(杭州中美華東制藥有限公司，浙江 杭州 310011)

非達霉素(fidaxomicin)是一種新型窄譜的大環(huán)內(nèi)脂類抗生素，能有效控制艱難梭狀芽孢桿菌感染(Clostridiumdifficileinfection, CDI)[1-4]。非達霉素通過與RNA聚合酶結(jié)合抑制細(xì)菌繁殖，進而針對性抑制艱難梭狀芽孢桿菌，其治療效果優(yōu)于傳統(tǒng)藥物萬古霉素和甲硝唑，并且具有更高的治愈率及更低的復(fù)發(fā)率[5-8]。目前，非達霉素主要通過微生物發(fā)酵生產(chǎn)，相關(guān)研究主要集中在菌種改良、發(fā)酵條件及提取工藝優(yōu)化方面，鮮有種子培養(yǎng)工藝方面的研究報道，而種子的制備是微生物發(fā)酵生產(chǎn)的第一道工序，因此，提供生產(chǎn)性能穩(wěn)定且優(yōu)良的種子液非常重要。現(xiàn)有報道的種子配方中大多含有牛肉膏和蛋白胨等動物性原料[9-13]，由于動物性原料存在潛在的病毒污染、成分不明確及不利于產(chǎn)物分離純化等缺點，F(xiàn)DA對動物性原料要求非?？量?，需要原料供應(yīng)商通過CEP認(rèn)證或出BSE/TSE聲明，而多數(shù)廠家都不具備這一資質(zhì)，因此，在生產(chǎn)過程中應(yīng)盡量避免使用動物性原料，保障產(chǎn)品安全性。為了提高發(fā)酵產(chǎn)量及穩(wěn)定性，同時，替代種子配方中的動物性原料，進一步提升產(chǎn)品質(zhì)量及安全性，筆者對種子培養(yǎng)溫度、種子配方進行優(yōu)化，確定種子最佳培養(yǎng)溫度，研究出無動物性原料的種子配方，同時對種子培養(yǎng)工藝進行細(xì)化，確定種齡及接種量，為發(fā)酵提供優(yōu)質(zhì)的種液，保證發(fā)酵穩(wěn)定。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌 種

桔橙指孢囊菌(Dactylosporangiumaurantiacum)為本公司保藏菌種。

1.1.2 培 養(yǎng) 基

固體培養(yǎng)基：葡萄糖4 g/L，酵母浸出粉4 g/L，麥芽浸粉10 g/L，瓊脂20 g/L，pH 7.0。

種子培養(yǎng)基：可溶性淀粉25 g/L，酵母浸出粉5 g/L，牛肉膏3 g/L，蛋白胨5 g/L，碳酸鈣4 g/L，pH 7.0。

發(fā)酵培養(yǎng)基：乳糖50 g/L，甘油10 g/L，酵母粉10 g/L，棉籽餅粉10 g/L，大豆蛋白胨5 g/L，硫酸鎂2 g/L，磷酸氫二鉀5 g/L，碳酸鈣4 g/L，pH 7.2。

1.2 培養(yǎng)條件

固體培養(yǎng)：將-80 ℃保藏的甘油管用無菌水稀釋涂布于平板培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)7～9 d。刮取長好的平板單菌落，制成菌懸液，取0.1 mL接入斜面培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)5～7 d。

種子培養(yǎng):將斜面菌體用無菌水制成菌懸液，接種于裝有20 mL(250 mL搖瓶)種子培養(yǎng)基中，28 ℃，220 r/min振蕩培養(yǎng)2～3 d。

發(fā)酵培養(yǎng)：將培養(yǎng)好的種液以10%接種量接入裝液量為20 mL(250 mL搖瓶)的發(fā)酵培養(yǎng)基中，28 ℃，220 r/min振蕩培養(yǎng)7～10 d。

1.3 實驗方法

1.3.1 種子培養(yǎng)溫度

為了確定種子的最佳培養(yǎng)溫度，將新鮮斜面接入種子培養(yǎng)基中，分別放置在溫度為24，26，28，30，32 ℃的搖床間進行培養(yǎng)，培養(yǎng)結(jié)束后分別接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，檢測種子液菌體生物量及發(fā)酵液非達霉素含量。

1.3.2 碳源的篩選

為了探究菌種對不同碳源的利用情況，考察了玉米淀粉、葡萄糖、蔗糖、麥芽糊精和甘油等幾種常見碳源對種子生長及發(fā)酵水平的影響。

1.3.3 動物性氮源替代實驗

選用植物來源的蛋白胨及微生物來源的蛋白胨代替初始的動物性蛋白胨，在完成蛋白胨替代實驗后，用玉米蛋白粉、棉籽精粉、多肽粉、麥芽浸粉和黃豆粉等幾種常用的氮源進行牛肉膏替代實驗，考查這幾種氮源對菌體生長及發(fā)酵水平的影響。

1.3.4 一級種子生長曲線的測定

取生長良好的新鮮斜面，接種于種子培養(yǎng)基中，分別培養(yǎng)24，32，40，48，56，64，72 h，測定菌體生物量、pH和總糖等指標(biāo)，通過顯微鏡鏡檢觀察菌絲形態(tài)。以培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)，生物量、總糖和pH等為縱坐標(biāo)，繪制一級種子生長曲線。

1.3.5 一級種子種齡實驗

根據(jù)一級種子生長曲線，選取56，60，64，68，72 h 5個時間點，將對應(yīng)的種子以10%的接種量分別接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，考察種齡對發(fā)酵的影響，以發(fā)酵液中非達霉素含量來確定一級種子的最佳種齡。

1.3.6 二級種子種齡實驗

為滿足產(chǎn)品工業(yè)化生產(chǎn)需求，進行二級種子培養(yǎng)工藝研究。將培養(yǎng)56，64 h的一級種子液接入二級種子培養(yǎng)基中，分別培養(yǎng)32，40，48，56 h后接入發(fā)酵培養(yǎng)基，28 ℃，220 r/min振蕩培養(yǎng)7 d，檢測發(fā)酵液中非達霉素含量，確定最佳二級種子移種時間。

1.3.7 二級種子種量實驗

將培養(yǎng)56 h的一級種子液按體積分?jǐn)?shù)分別為0.05%，0.1%，0.15%，0.2%接入二級種瓶，二級種子培養(yǎng)48 h后接入發(fā)酵培養(yǎng)基，28 ℃，220 r/min振蕩培養(yǎng)7 d，檢測發(fā)酵液中非達霉素含量，確定最佳接種量。

1.4 檢測方法

1.4.1 菌體生物量測定

菌體生物量采用菌體離心濃度(PMV)表示：取10 mL發(fā)酵液置于帶刻度離心管中，3 500 r/min離心10 min，測定離心后菌體體積。

1.4.2 總糖含量測定

采用3,5-二硝基水楊酸比色法(DNS法)測定總糖含量[14]。

1.4.3 非達霉素產(chǎn)量測定

取發(fā)酵液1 mL加入甲醇3 mL，混合均勻密封。超聲處理30 min，吸取1 mL于12 000 r/min離心10 min，取上清液，用0.45 (m的有機濾膜過濾后，HPLC檢測非達霉素含量。

色譜條件：色譜柱為Agilent Eclipse XDB-C8柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相為V(乙腈)∶V(體積分?jǐn)?shù)為0.5%的乙酸水溶液)=58∶42；流速1.0 mL/min；柱溫30 ℃；檢測波長230 nm；進樣量10 μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 種子培養(yǎng)溫度

溫度是影響微生物生長代謝的重要因素，通常培養(yǎng)溫度偏低，菌體生長緩慢，菌體量偏少，影響發(fā)酵產(chǎn)量；培養(yǎng)溫度偏高，菌體代謝活動加快，可以縮短培養(yǎng)時間，但菌體容易老化，影響發(fā)酵產(chǎn)量[15]。因此，為了獲得優(yōu)質(zhì)種子液，需要確定菌種的最佳培養(yǎng)溫度。溫度對種子生物量及發(fā)酵效價的影響見圖1。由圖1可知：種子在24，26 ℃培養(yǎng)時，菌體生物量較低，生長緩慢，而在28～32 ℃培養(yǎng)時，菌體生物量較高。把不同溫度下培養(yǎng)的種子接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，檢測發(fā)酵液中非達霉素含量。結(jié)果表明:在30 ℃下培養(yǎng)的種子具有較高的活性，發(fā)酵產(chǎn)量較高，因此，確定種子的最佳培養(yǎng)溫度為30 ℃。

圖1 溫度對種子生物量及發(fā)酵效價的影響Fig.1 The effect of temperature on seedbiomass and fermentation titer

2.2 種子碳源篩選

碳源既是構(gòu)成菌體細(xì)胞和代謝產(chǎn)物的主要元素，又是提供微生物生命活動所需能源的原料[16]。微生物的生理特性不同，對碳源的利用情況亦不相同。為探究種子對碳源的利用情況，實驗考察了玉米淀粉、葡萄糖、蔗糖、乳糖和甘油等幾種常見碳源對種子生長及發(fā)酵水平的影響。對種液進行生物量檢測和鏡檢，結(jié)果表明：可溶性淀粉、玉米淀粉和麥芽糊精為碳源時，菌體生物量較高，鏡檢時菌絲較粗壯，染色較深。種子碳源對發(fā)酵效價的影響見圖2。由圖2可知：以可溶性淀粉和玉米淀粉為碳源時，發(fā)酵產(chǎn)非達霉素效價較高；以葡萄糖和甘油為碳源時，發(fā)酵產(chǎn)非達霉素效價較低。綜合發(fā)酵水平、菌體生物量及鏡檢結(jié)果，最終選擇玉米淀粉作為種子碳源。

1—可溶性淀粉；2—玉米淀粉；3—葡萄糖；4—蔗糖；5—麥芽糊精；6—甘油圖2 種子碳源對發(fā)酵效價的影響Fig.2 The effect of seed carbon sourceon fermentation titer

2.3 動物性氮源替代實驗

氮源主要是構(gòu)成微生物細(xì)胞物質(zhì)(氨基酸、蛋白質(zhì)和核酸等)和含氮代謝產(chǎn)物[16]。初始種子配方中含有牛肉膏和蛋白胨兩種動物性氮源，為了提高產(chǎn)品質(zhì)量及安全性，實驗采用幾種常用氮源分別替代這兩種動物性氮源，考查菌種對氮源的利用情況及其對發(fā)酵水平的影響。

2.3.1 蛋白胨替代實驗

首先用植物來源的大豆蛋白胨及微生物來源的酵母蛋白胨FP101，F(xiàn)P102和FP103替代原始的動物性蛋白胨。通過生物量檢測及鏡檢觀察，發(fā)現(xiàn)3種型號的酵母蛋白胨均優(yōu)于大豆蛋白胨。不同來源的蛋白胨對發(fā)酵效價的影響見圖3。由圖3可知：酵母蛋白胨FP102與蛋白胨在發(fā)酵水平上無差異，因此可用酵母蛋白胨FP102替代初始的動物性蛋白胨。

1—蛋白胨；2—大豆蛋白胨；3—FP101；4—FP102；5—FP103圖3 不同來源的蛋白胨對發(fā)酵效價的影響Fig.3 The effects of peptone from different sourceson fermentation titer

2.3.2 牛肉膏替代實驗

酵母蛋白胨FP102成功替代動物性蛋白胨后，選用玉米蛋白粉、棉籽精粉、多肽粉、麥芽浸粉和黃豆粉等幾種常用氮源替代牛肉膏實驗。不同氮源代替牛肉膏對發(fā)酵效價的影響見圖4。由圖可知：多肽粉替代牛肉膏時，發(fā)酵產(chǎn)非達霉素水平優(yōu)于牛肉膏，綜合生物量及鏡檢結(jié)果，最終以多肽粉替代牛肉膏。

1—牛肉膏；2—玉米蛋白粉；3—棉籽精粉；4—多肽粉；5—麥芽浸粉；6—黃豆粉圖4 不同氮源代替牛肉膏對發(fā)酵效價的影響Fig.4 The effect of different nitrogen sources insteadof beef extract on fermentation titer

完成種子碳源篩選及動物性氮源替代實驗后，確定新的種子配方為：玉米淀粉25 g/L，酵母浸出粉5 g/L，多肽粉3 g/L，酵母蛋白胨FP102 5 g/L，碳酸鈣4 g/L，pH 7.0。以初始培養(yǎng)基為對照分別測定優(yōu)化前后菌體生物量及接入發(fā)酵培養(yǎng)基后測定發(fā)酵水平。結(jié)果表明：進行種子配方優(yōu)化及動物性原料替代后，種子液生物量及發(fā)酵產(chǎn)非達霉素水平均有所提高，同時提高了原料安全性及產(chǎn)品質(zhì)量。

2.4 一級種子培養(yǎng)條件

2.4.1 一級種子生長曲線

一級種子生長曲線見圖5。由圖5可知：種子培養(yǎng)過程中，0～32 h為延滯期，菌體生長緩慢，pH下降，總糖消耗較慢；32～64 h為對數(shù)生長期，菌體快速生長，菌體生物量快速增加，總糖消耗較快，pH由7.23快速上升至7.92；64 h后為穩(wěn)定期，總糖消耗放緩，生物量及pH維持穩(wěn)定。一般情況下，對數(shù)生長期中后期的種子活性較強，生長繁殖速度快，因此，選擇56～64 h為較合適的一級種齡范圍。

圖5 一級種子生長曲線Fig.5 The growth curve of primary seed

2.4.2 一級種齡對菌體生長及發(fā)酵的影響

在菌體生長過程中，不同生長階段的菌體生理活性差別較大，因此，接種種齡的控制非常重要。根據(jù)一級種子生長曲線，將種子分別培養(yǎng)56，58，60，62，64 h后，接入發(fā)酵培養(yǎng)基中。種齡對生物量及發(fā)酵效價的影響見圖6。由圖6可知：種齡為56 h時，生物量較低，發(fā)酵液效價較低，種齡為62，64 h時，生物量和發(fā)酵效價均較高。為了便于人員和設(shè)備的合理安排及生產(chǎn)活動的操作便利性，確定一級種子的培養(yǎng)時間為64 h。

圖6 種齡對生物量及發(fā)酵效價的影響Fig.6 The effect of seed age on biomass and fermentation titer

2.5 二級種子培養(yǎng)條件

在工業(yè)化生產(chǎn)過程中，發(fā)酵罐的體積越大，所需的種子也越多，因此，需要對種子進行擴大培養(yǎng)。菌種的擴大培養(yǎng)可以為發(fā)酵生產(chǎn)提供優(yōu)良的種子液，保證發(fā)酵穩(wěn)定性并提高發(fā)酵產(chǎn)量。因此，二級種子工藝研究對發(fā)酵生產(chǎn)意義重大。

2.5.1 二級種子種齡實驗

工業(yè)化生產(chǎn)中，一級和二級種子的種齡對發(fā)酵生產(chǎn)水平影響很大。種齡過于年輕的種子接入發(fā)酵罐后，前期生長緩慢，菌體生物量低，發(fā)酵周期延長；種齡過老的種子接入發(fā)酵罐后，菌種活性較低導(dǎo)致生產(chǎn)能力衰退；代謝旺盛且成熟的種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，菌體能快速適應(yīng)新的發(fā)酵培養(yǎng)環(huán)境，大大縮短延滯期及發(fā)酵產(chǎn)物合成周期，提高生產(chǎn)水平及生產(chǎn)效率[17]。不同的種子培養(yǎng)時間直接影響種子活力，進而影響發(fā)酵產(chǎn)抗能力。

實驗選取生長56，64 h的一級種子分別接種至二級種子液中，培養(yǎng)不同時間后測定生物量及非達霉素含量，實驗結(jié)果如表1所示。結(jié)果表明：種齡56 h的一級種子液轉(zhuǎn)接至二級種子液，培養(yǎng)48 h后，種子生物量及發(fā)酵產(chǎn)非達霉素水平均較高，因此確定生產(chǎn)工藝為一級種子培養(yǎng)56 h，二級種子培養(yǎng)48 h。通過培養(yǎng)基及種子工藝優(yōu)化，非達霉素產(chǎn)量較原工藝提高了12.3%。

表1 種齡對生物量及發(fā)酵效價的影響Table 1 The effect of seed age on biomass and fermentation titer

2.5.2 二級種子種量實驗

接種量大小直接影響菌體生長繁殖的速度，進而影響發(fā)酵水平[18]。中試放大時，如果一級種子到二級種子的接種量過大，則備種壓力較大，同時會增加染菌概率；而接種量過小，則會延長種子培養(yǎng)時間，菌量過低，影響發(fā)酵水平。一般而言，二級種子的接種量應(yīng)控制在0.2%以下，以便于放大生產(chǎn)。

在確定種子配方及接種工藝的基礎(chǔ)上，進行二級種子接種量實驗。接種量對生物量及發(fā)酵效價的影響見圖7。由圖7可知：二級種子接種量為0.05%時，種子菌量較低，發(fā)酵產(chǎn)非達霉素水平較低。當(dāng)二級種子接種量在0.1%～0.2%之間時，菌體量及發(fā)酵水平均無明顯差異，因此選擇0.1%～0.2%作為二級種子接種量。

圖7 接種量對生物量及發(fā)酵效價的影響Fig.7 The effect of inoculum size onbiomass and fermentation titer

3 結(jié) 論

優(yōu)質(zhì)且穩(wěn)定的種液是微生物發(fā)酵制藥的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，因此，在選育優(yōu)良菌種的同時，需要對種子的培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)基組成和種齡種量進行優(yōu)化，以提高種液的穩(wěn)定性及生產(chǎn)能力。用酵母蛋白胨FP102替代了原種子配方中的牛肉膏和蛋白胨兩種動物性原料，優(yōu)化了種子培養(yǎng)溫度及種子配方中的碳源和氮源，確定種子最佳培養(yǎng)溫度為30 ℃，研究出無動物性原料的新種子配方：玉米淀粉25 g/L，酵母浸出粉5 g/L，多肽粉3 g/L，酵母蛋白胨FP102 5 g/L，碳酸鈣4 g/L，pH 7.0。確定一級種子培養(yǎng)條件為30 ℃培養(yǎng)64 h；確定一級種子培養(yǎng)56 h，按0.1%～0.2%的接種量轉(zhuǎn)接二級種子，培養(yǎng)48h后二級種子可達較佳的生理狀態(tài)，具有較高的生產(chǎn)能力。研究成功替代原配方的動物性原料，避免潛在的病毒污染風(fēng)險，提升產(chǎn)品安全性及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，并通過優(yōu)化培養(yǎng)基及種子工藝研究，使非達霉素產(chǎn)量提高了12.3%，為提高發(fā)酵產(chǎn)量及發(fā)酵穩(wěn)定性奠定基礎(chǔ)。