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(1.哈爾濱商業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150076；2.中國(guó)科學(xué)院 蘭州化學(xué)物理研究所羰基合成和選擇氧化國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730000)

聚β-羥基丁酸酯(PHB)是聚羥基鏈烷酯(PHA)的典型代表[1]。PHA是一種高分子聚合物，在其結(jié)構(gòu)通式中n=1時(shí)，R為甲基，單體為β-羥基丁酸(HB)，其聚合物為聚β-羥基丁酸酯(PHB)[2]。PHB是由多個(gè)D型3HB單元組成。在原核微生物缺乏氮、磷、鎂和氧等造成營(yíng)養(yǎng)不均衡時(shí)，PHB是細(xì)胞內(nèi)形成的碳源和能源貯藏物質(zhì)[3]。因PHB的生物相容性，其在很多領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用。PHB在生產(chǎn)抗癌新藥中，可作為中長(zhǎng)期藥物控制釋放載體[4]。PHB可以作為藥物基質(zhì)植入人的體內(nèi)，用來(lái)控制藥物的釋放速率。當(dāng)人體服用了這種藥以后，隨著藥物在體內(nèi)完全釋放，作為藥物基質(zhì)的PHB就會(huì)自然降解，其最終降解產(chǎn)物為β-羥基丁酸[5]。這是人體血液中一種普遍存在并且無(wú)毒、無(wú)害的代謝產(chǎn)物，不會(huì)給人體帶來(lái)任何危險(xiǎn)。在軟骨組織工程中，細(xì)胞載體材料由PHB三維支架充當(dāng)[6]。這樣軟骨基質(zhì)明顯增多，且死細(xì)胞較少。PHB本身具有生物可降解性，使得PHB成為了石油質(zhì)塑料最有潛力的替代品。在農(nóng)業(yè)方面，PHB可以用作農(nóng)藥和肥料的殺菌載體[7-8]。例如除銹劑、殺蟲劑等。PHB主要由微生物發(fā)酵法制備，不依賴石油化工行業(yè)。隨著全球石油儲(chǔ)量的減少，國(guó)內(nèi)外對(duì)這種可降解的生物材料的研究十分重視。在國(guó)外，PHB生產(chǎn)可降解瓶子的項(xiàng)目已經(jīng)獲得歐盟的資助[9-10]。在國(guó)內(nèi)，利用甲烷氧化混合菌可以生物合成PHB。采用充盈-饑餓模式間歇供料，以甲烷為底物好氧開(kāi)放式培養(yǎng)甲烷氧化混合菌HD6T。在開(kāi)放條件下，對(duì)菌群中高產(chǎn)PHB的甲烷氧化菌進(jìn)行富集。根據(jù)發(fā)酵罐培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)規(guī)律，建立了開(kāi)放條件下一段式的發(fā)酵罐發(fā)酵生產(chǎn)PHB的方法[11]。除了利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)PHB，還可以利用轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)PHB。目前，PHB關(guān)鍵酶基因已在擬南芥、大白菜等植物中成功表達(dá)[12]。PHB常用的提取方法有溶劑提取法、酶法、次氯酸鈉氯仿提取法、高壓勻漿法和珠磨法。近年來(lái)，一些其他的提取方法也逐步發(fā)展起來(lái)，如噬菌體裂解法、基因工程法和活性污泥提取法等。筆者對(duì)這些提取方法進(jìn)行介紹，并展開(kāi)比較分析，進(jìn)而展望PHB提取方法的發(fā)展方向，為PHB工業(yè)化生產(chǎn)提供一定的參考。

1 常用的PHB提取方法

1.1 溶劑提取法

溶劑提取法是最傳統(tǒng)的PHB提取方法。這種方法研究時(shí)間最長(zhǎng)，應(yīng)用比較廣泛。溶劑提取法的原理是將PHB溶解在氯仿等氯代烴共沸物、環(huán)碳酸酯和四氯呋喃及其衍生物等有機(jī)溶劑中，因?yàn)榉荘HB的細(xì)胞物質(zhì)不能溶解，從而達(dá)到分離提取的目的[13]。不同的有機(jī)溶劑，PHB的提取率不同。薛林貴等[14]研究SDS法、次氯酸鈉法、SDS-次氯酸鈉法、CHCl3法和CHCl3-CH3OH法對(duì)芽孢桿菌胞內(nèi)PHB提取率的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示。CHCl3法和CHCl3-CH3OH法屬于溶劑提取法，PHB的提取率分別為38.6%和51.3%。采用不同種類的有機(jī)溶劑提取PHB，其提取率相差很大。這種方法的優(yōu)點(diǎn)是操作流程比較簡(jiǎn)單，操作步驟少，但是也存在一些缺點(diǎn)，如PHB在某些有機(jī)溶劑中的溶解度較低，易造成提取困難，提取率偏低；有時(shí)需要提高有機(jī)試劑的用量，不但生產(chǎn)成本會(huì)隨之提高，而且也會(huì)造成一定程度的環(huán)境污染；當(dāng)培養(yǎng)物黏度過(guò)高時(shí)，采用有機(jī)溶劑分離提取PHB會(huì)有一定的困難。通過(guò)采用混合培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)菌種，則可以解決這一問(wèn)題。混合培養(yǎng)技術(shù)是指人工建立微生物區(qū)系，利用兩種或兩種以上的微生物不同特性，加以調(diào)節(jié)控制，從而達(dá)到所需目的的技術(shù)[15]。將兩種或兩種以上的菌種混合培養(yǎng)，通過(guò)有機(jī)溶劑改變細(xì)胞膜的通透性，根據(jù)PHB和非雜質(zhì)溶解度的不同，提取PHB[16]，需要注意的是菌體需采用低溫冷凍技術(shù)進(jìn)行預(yù)處理。這種混合培養(yǎng)技術(shù)可以有效改善培養(yǎng)液介質(zhì)，增加培養(yǎng)物密度，提高PHB質(zhì)量和降低PHB生產(chǎn)成本。

表1 提取方法對(duì)胞內(nèi)PHB提取率的影響Table 1 The effect of extraction method on theextraction rate of PHB

1.2 酶法提取PHB

酶法提取PHB的工藝是由Mothes等[17]研究發(fā)現(xiàn)的，他們利用酶使微生物細(xì)胞內(nèi)大量的雜質(zhì)溶解，細(xì)胞內(nèi)的PHB在此過(guò)程中不溶解，最后達(dá)到分離、提取PHB的目的。酶法工藝流程主要包括細(xì)胞的熱處理、酶處理和用陰離子表面活性劑處理等步驟[18]。酶法可以篩除非PHB雜質(zhì)，不需使用大量的有機(jī)溶劑，操作過(guò)程幾乎沒(méi)有污染。但是也存在一些缺點(diǎn)，酶的最適作用條件比較苛刻，酶產(chǎn)物存在抑制問(wèn)題，很難控制，造成PHB的提取率偏低。將酶法與溶劑提取法結(jié)合起來(lái)，可以提高PHB的提取率。在酶法提取PHB之后，利用氯仿等有機(jī)溶劑進(jìn)一步進(jìn)行純化[19]，可以獲得更高純度的PHB，即可解決單一酶法PHB提取率低，純度不高等問(wèn)題。

1.3 次氯酸鈉氯仿法

次氯酸鈉氯仿法是一種比較常見(jiàn)的提取PHB的方法。次氯酸鈉的主要作用是破除微生物的細(xì)胞壁，氯仿的作用是保護(hù)PHB[20]。許旭萍等[21]采用次氯酸鈉氯仿法提取球衣菌內(nèi)的PHB。將菌體從發(fā)酵液中離心出來(lái)并用蒸餾水洗滌，濕菌體分別用次氯酸鈉，SDS-次氯酸鈉處理。處理結(jié)束后，將這些濕菌體分別離心，離心得到的沉淀分別用蒸餾水和丙酮洗滌，烘干后用氯仿抽提。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，SDS-次氯酸鈉-氯仿混合處理的PHB提取率為56%，與僅用次氯酸鈉氯仿處理的PHB提取率相當(dāng)。但是，SDS-次氯酸鈉-氯仿混合處理提取的PHB純度明顯提高，基本與標(biāo)準(zhǔn)品一致。SDS首先作用于脂類和蛋白質(zhì)，使細(xì)胞膜受到破壞，次氯酸鈉可破壞細(xì)胞壁的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)使之成為溶于水的物質(zhì)，增大非PHB雜質(zhì)的去除率[22-23]。李凌凌等[24]以魔芋多糖為碳源產(chǎn)PHB的菌株篩選、鑒定及發(fā)酵研究中，采用次氯酸鈉氯仿法提取PHB。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，菌體LKH在氮源質(zhì)量濃度為0.2 g/L，以魔芋多糖為唯一碳源合成的PHB質(zhì)量濃度高達(dá)0.85 g/L，PHB提取率為93.29%。這種方法操作比較簡(jiǎn)便，在提取時(shí)加入SDS與次氯酸鈉混合處理菌體，可以縮短次氯酸鈉與PHB的接觸時(shí)間，保護(hù)PHB分子，提高PHB的提取率和純度。但是，氯仿有特殊氣味，易揮發(fā)，操作過(guò)程需要注意安全。

1.4 酶法、溶劑提取法和次氯酸鈉氯仿法的比較

酶法、溶劑提取法和次氯酸酸鈉提取法都是比較常用的PHB提取方法，這3種方法的比較如表2所示。

表2 酶法、溶劑提取法和次氯酸酸鈉提取法的比較Table 2 Comparison of enzymatic extraction, solvent extraction and sodium hypochlorite extraction

1.5 機(jī)械破碎提取PHB

機(jī)械破碎提取PHB主要利用高壓勻漿法或者珠磨法破碎微生物的細(xì)胞壁，進(jìn)而達(dá)到提取細(xì)胞內(nèi)PHB的目的。高壓勻漿法利用高壓勻漿機(jī)對(duì)物料進(jìn)行擠壓和剪切，從而達(dá)到細(xì)胞破碎的目的[25]。高壓勻漿法處理量比較大，且破碎效率較高，處理的速度也較快。珠磨法采用珠磨機(jī)破碎細(xì)胞，利用珠子和細(xì)胞之間相互剪切碰撞，達(dá)到細(xì)胞破碎的目的，通過(guò)珠液分離器，使細(xì)胞的漿液流出，進(jìn)而提取微生物細(xì)胞中的PHB[26]。珠磨法與高壓勻漿法的特點(diǎn)比較如表3所示。

表3 珠磨法和高壓勻漿法的比較Table 3 Comparison between bead milling method and highpressure homogenization method

2 PHB的其他提取方法

2.1 螯合劑法提取PHB

Carla等[27]提出了用于優(yōu)化生產(chǎn)經(jīng)濟(jì)的MINLP模型。在該模型中以微藻的生物精煉為基礎(chǔ)，以甘油為原料生產(chǎn)生出柴油和PHB等產(chǎn)品。提取PHB的方法選擇表面活性劑-螯合劑的提取方法。隨著表面活性劑-螯合劑的加入，細(xì)菌外膜不穩(wěn)定，發(fā)生破裂，與二價(jià)陽(yáng)離子形成配合物。在細(xì)胞裂解后，也可以通過(guò)添加二乙基琥珀酸酯(DES)提取PHB。在這個(gè)模型中，PHB作為酯交換反應(yīng)的副產(chǎn)物來(lái)獲得，其生產(chǎn)水平由生物柴油間接決定。

EDTA作為一種螯合劑，具有很多獨(dú)特的性質(zhì)。其可以螯合金屬離子，還可以破壞細(xì)胞膜脂多糖穩(wěn)定結(jié)構(gòu)[28]。在研究從甲烷氧化混合菌中提取PHB時(shí)，選用EDTA作為提取劑，操作流程如圖1所示。這種方法利用甲烷氧化混合菌積累PHB，有效節(jié)約了PHB的生產(chǎn)成本，同時(shí)也減少了向環(huán)境中排放污染物。利用EDTA提取甲烷氧化菌內(nèi)的PHB，有效地提高PHB產(chǎn)量，提取的過(guò)程不使用有機(jī)溶劑，不僅可減少操作過(guò)程中的安全隱患，而且可以更好地保護(hù)環(huán)境[29]。

圖1 EDTA提取PHB流程圖Fig.1 Flow chart of EDTA extracting PHB

2.2 噬菌體裂解法

噬菌體在自然界中廣泛存在，并且可以特異性識(shí)別其宿主細(xì)胞。正是因?yàn)檫@種特異性，可以通過(guò)噬菌體裂解細(xì)胞，使得細(xì)菌內(nèi)富集的PHB釋放。噬菌體作為一種提取劑，提供了一種PHB提取的新方法。Hand等[30]使用細(xì)菌噬菌體作為提取劑，成功提取假單胞菌中富集的PHB。該方法不需要加入化學(xué)試劑，也不需要借助外力，就可將細(xì)胞內(nèi)的PHB提取出來(lái)。通過(guò)短期的營(yíng)養(yǎng)處理，就可以使細(xì)胞裂解，節(jié)約了PHB的提取成本。但是，這種噬菌體介導(dǎo)裂解的方法只能釋放PHB總積累量的2/3，PHB的提取率較低。由于受到疏水作用的相互影響，導(dǎo)致PHB的不完全釋放。因此，還需進(jìn)一步針對(duì)該問(wèn)題進(jìn)行研究，開(kāi)發(fā)更優(yōu)化的方法，最大化地提取PHB。

2.3 從活性污泥中提取PHB

在自然界中，絕大部分微生物在一定條件下都可以在細(xì)胞內(nèi)積累PHB。Karthi等[31]從船艙底油污染的海水中分離出能夠利用烴類廢物生產(chǎn)PHB的細(xì)菌菌株，通過(guò)蘇丹黑和尼羅紅的染色證明了PHB的積累。然后，進(jìn)一步優(yōu)化所使用的BH培養(yǎng)基，PHB積累量可增加37%。近年來(lái)，從活性污泥中生產(chǎn)和提取PHB越來(lái)越受到關(guān)注?；钚晕勰喑Ｓ糜谖鬯幚恚旧硪簿哂辛己玫某两敌阅芎洼^大的比表面積等優(yōu)點(diǎn)。活性污泥中的微生物可以作為發(fā)酵菌群，通過(guò)污水合成PHB[32-33]，可以有效地節(jié)約生產(chǎn)成本，免去操作過(guò)程中復(fù)雜的條件控制。沈俊宇[34]利用活性污泥篩選每種菌株產(chǎn)PHA的含量。其中最高產(chǎn)量的菌株，菌體質(zhì)量濃度為1.172 g/L，最高PHA質(zhì)量濃度為0.241 g/L。在從活性污泥中提取PHB的研究中，當(dāng)PHB達(dá)到污泥干重的4.86%時(shí)，提取的PHB純度在70.6%以上。由于活性污泥中成分復(fù)雜，會(huì)影響PHB的提取率，在一定程度上增加了提取難度。但是，隨著研究的不斷深入，這些問(wèn)題都會(huì)得到解決。

2.4 超聲波破碎法

超聲波破碎法是發(fā)射超聲波，通過(guò)探頭處理細(xì)胞懸浮液，從而進(jìn)行細(xì)胞破碎的方法[35]。其原理是液體在超聲波的作用下會(huì)發(fā)生空化作用，通過(guò)形成空穴、增大空穴和閉合空穴產(chǎn)生巨大的沖擊波和剪切力，從而使微生物細(xì)胞破碎[36-37]。超聲破碎微生物細(xì)胞后，細(xì)胞懸液的流動(dòng)性顯著提高。同時(shí)，長(zhǎng)細(xì)胞鏈斷裂成短細(xì)胞鏈，具有一定的破壁效果。這種超聲破碎法廣泛地應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)室中[38]。Pradhan等[39]使用超聲破碎的方法提取PHB，并用FTIR進(jìn)行表征檢測(cè)。干細(xì)胞中PHB的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8.10%～21.6%。PHB的提取率為6.85%～36.41%。但是僅使用超聲破碎，PHB的提取率不高。超聲破碎法與氯仿結(jié)合使用，則可有效提高PHB的提取率。張永杰等[40]用多種方法破碎假單胞菌，提取胞內(nèi)PHB。SDS提取PHB的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%，SDS-次氯酸鈉提取PHB的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為52.5%，次氯酸鈉提取PHB的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%。超聲-氯仿法的預(yù)處理效果較好，PHB的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為55%。超聲破碎沒(méi)有破壞PHB的分子結(jié)構(gòu)，加入氯仿使得細(xì)胞中高分子量的PHB更容易被抽提出來(lái)，更有助于PHB的提取。

2.5 基因工程法

在植物中克隆合成PHB的關(guān)鍵酶基因，可以從植物的質(zhì)體或者細(xì)胞質(zhì)中分離得到PHB。目前在擬南芥、大白菜的葉片和種子中可以成功表達(dá)PHB的關(guān)鍵酶基因。同時(shí)，該基因在馬鈴薯、棉花和油菜等植物中也能夠成功表達(dá)[41]。在E.coil大腸桿菌中導(dǎo)入合成PHB的關(guān)鍵酶基因，該基因也可成功表達(dá)。同時(shí)，因大腸桿菌的厚度對(duì)PHB的積累量有一定影響，導(dǎo)入可以改變細(xì)胞壁厚度的檸檬酸合成酶基因gltA，改變大腸桿菌的細(xì)胞壁厚度，可以得知，細(xì)胞壁增厚的大腸桿菌僅積累質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25%的PHB，細(xì)胞壁變薄的大腸桿菌積累質(zhì)量分?jǐn)?shù)為93%的PHB[42]。利用基因工程法提取PHB不需要消耗發(fā)酵底物，也不需要復(fù)雜的發(fā)酵過(guò)程。不僅節(jié)約了生產(chǎn)成本，而且大大減少了生產(chǎn)過(guò)程中的污染。但是大量PHB的積累，會(huì)阻礙底物運(yùn)輸，影響植物的正常生長(zhǎng)。重新導(dǎo)入的外源基因表達(dá)及表現(xiàn)出的相應(yīng)功能存在一定的限制。不同種類物種之間也存在一些有待解決的遺傳問(wèn)題。因此，這項(xiàng)技術(shù)目前還沒(méi)有在生產(chǎn)中大規(guī)模使用。

2.6 直接成型法

在工業(yè)加工中，在高溫高壓的條件下，微生物細(xì)胞破裂，PHB會(huì)發(fā)生交聯(lián)聚合，同時(shí)與細(xì)胞殘?jiān)烊?，共同成型。在發(fā)酵過(guò)程中，當(dāng)PHB的質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于細(xì)胞干重的50%時(shí)，可將其壓制成膜產(chǎn)物。這種方法獲得的PHB，有良好的可塑性，比較適用于工業(yè)生產(chǎn)加工[43]。

2.7 化學(xué)法合成PHB

PHB的化學(xué)合成法有很多，通過(guò)化學(xué)催化法可制備PHB。雙烯酮在催化劑Ru2Cl4[(S)-binap]2·ET3N的作用下進(jìn)行非對(duì)稱氫化可制得具有光學(xué)活性的β-丁內(nèi)酯。β-丁內(nèi)酯在催化作用下可以開(kāi)環(huán)聚合制得PHB[44]。除了化學(xué)催化法，還可以通過(guò)氧化法得到單體3-羥基丁酸，然后以單體為原料聚合得到PHB。乙醛經(jīng)羥醛縮合生成3-羥基丁醛，3-羥基丁醛在適宜的條件可被氧化成3-羥基丁酸。氧化劑可以選擇雙氧水、純氧等[45]?；瘜W(xué)催化法與氧化法的比較如表4所示。雖然化學(xué)法合成PHB可以在一定程度上提高PHB的產(chǎn)量，簡(jiǎn)化生產(chǎn)流程。但是，利用這種方法生產(chǎn)PHB，原料成本比較高，而且大多數(shù)的化學(xué)原料具有毒性。同時(shí)，化學(xué)反應(yīng)的條件不是很好控制，會(huì)導(dǎo)致很多副產(chǎn)物的產(chǎn)生，對(duì)于PHB的分離提純也會(huì)造成一定的困難。

表4 化學(xué)催化法與氧化法的比較Table 4 Comparison between chemical catalytic methodand oxidation method

2.8 PHB其他提取方法的比較

PHB的其他提取方法有螯合劑法提取PHB、噬菌體裂解法、從活性污泥中提取PHB、超聲波破碎法、基因工程法、直接成型法和化學(xué)法合成PHB。這些提取方法的比較如表5所示。

表5 PHB其他提取方法的比較Table 5 Comparison of other extraction methods for PHB

3 結(jié) 論

PHB可以用來(lái)生產(chǎn)抗癌新藥、作為三維支架充當(dāng)細(xì)胞載體材料以及用作農(nóng)藥和肥料的殺菌載體，具有巨大的發(fā)展?jié)摿?。筆者介紹了多種PHB的提取方法，為降低PHB的生產(chǎn)成本，實(shí)現(xiàn)PHB的工業(yè)化生產(chǎn)提供了參考。在常用的提取方法中，次氯酸鈉氯仿法是最適宜提取PHB的方法。相較于酶法的作用條件比較苛刻，溶劑提取法需使用大量的有機(jī)溶劑，次氯酸鈉氯仿法的操作則比較簡(jiǎn)便，各種提取條件易于控制。同時(shí)，其PHB的提取率比較高，加入SDS混合處理后，PHB的純度與標(biāo)準(zhǔn)品基本一致。其他的提取方法，如螯合劑法、噬菌體裂解法、從活性污泥中提取PHB、超聲破碎法和基因工程法都不使用大量的有毒有害物質(zhì)，更好地保護(hù)了環(huán)境。從活性污泥中提取PHB，在處理污水的同時(shí)也提取了PHB，變廢為寶，節(jié)約了PHB的生產(chǎn)成本。直接成型法和化學(xué)法更適用于PHB的工業(yè)生產(chǎn)加工。但是化學(xué)法合成PHB時(shí)，會(huì)使用一些有毒的化學(xué)原料。目前，這些方法還需要進(jìn)一步完善。在不久的將來(lái)，PHB的提取方法會(huì)更加無(wú)污染、低成本。隨著研究的深入，PHB的提取方法將會(huì)越來(lái)越多，PHB的應(yīng)用也會(huì)越來(lái)越廣泛。