裘丞軍， 任玉琴

（浙江省獸藥飼料監(jiān)察所，浙江杭州 311199）

維生素A和維生素E是維持動(dòng)物體正常代謝所必需的脂溶性維生素，具有促進(jìn)生長，提高免疫力等作用，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于大規(guī)模畜禽養(yǎng)殖中。在飼料添加劑中主要以維生素A乙酸酯和dl-α-生育酚乙酸酯的形式存在，并且通過各種壁材包被保護(hù)（楊優(yōu)敏，2016）。目前測(cè)定飼料中維生素A和維生素E的方法已有國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 17812-2008和GB/T 17817-2010，主要是皂化萃取法和甲醇直接提取法，還有堿性蛋白酶水解法（趙曉華等，2010）。皂化萃取法操作步驟繁瑣，時(shí)間長，消耗試劑多；甲醇直接提取法和酶解法結(jié)果不穩(wěn)定，有些包被產(chǎn)品未能被有效提取。因此本研究擬建立一種能穩(wěn)定、快速、準(zhǔn)確、同時(shí)測(cè)定飼料中維生素A和維生素E的方法，通過氫氧化鉀溶液皂化，乙醇提取，將包被物質(zhì)溶解，維生素A乙酸酯和dl-α-生育酚乙酸酯轉(zhuǎn)化為維生素A醇和dl-α-生育酚，用外標(biāo)法計(jì)算含量。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器 維生素A乙酸酯標(biāo)準(zhǔn)品（德國Dr.Ehrenstorfer公司）；維生素E乙酸酯標(biāo)準(zhǔn)品（Fluka公司）；無水乙醇、抗壞血酸、冰乙酸、氫氧化鉀均為分析純；甲醇為色譜純；水是超純水；配合飼料、濃縮料、維生素預(yù)混料、復(fù)合預(yù)混料為日常檢測(cè)時(shí)收集。

Agilent1260高效液相色譜儀，紫外可變波長檢測(cè)器（美國Agilent公司）；KQ-500E超聲儀（昆山超聲儀器公司）；ZP205電子天平（Mettler公司）。

1.2 色譜條件 色譜柱：Agilent XDB-C18柱，柱長150 mm，內(nèi)徑 4.6 mm，粒徑 5 μm；流動(dòng)相：甲醇+水=98+2；流速：1.2 mL/min；進(jìn)樣量：20 μL；柱溫：30 ℃；紫外檢測(cè)波長：0～7min，326nm；7～20min，280nm。

1.3 飼料樣品前處理 準(zhǔn)確稱取飼料樣品適量（不大于 2 g，精確至0.1 mg），置于 50 mL容量瓶中，依次加入無水乙醇6 mL，10%抗壞血酸水溶液 2.0 mL，470 g/L氫氧化鉀水溶液 2.0 mL，混勻，置65℃水浴超聲波皂化反應(yīng)20 min，取出，立即加入1.0 mL冰乙酸調(diào)pH至6.0～7.5，冷卻至室溫，用無水乙醇定容至刻度，混勻，靜置。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液配制 精密稱取標(biāo)準(zhǔn)品維生素A乙酸酯62.19 mg，維生素E乙酸酯207.58 mg，分別置于100 mL棕色容量瓶中，加入無水乙醇超聲波助溶，冷卻至室溫，用無水乙醇定容至刻度，混勻，得到維生素A濃度為1807.8 IU/mL，維生素E濃度為2075.8 μg/mL，-20℃避光保存。

1.5 標(biāo)準(zhǔn)工作液配制 精密移取維生素A儲(chǔ)備液和維生素E儲(chǔ)備液適量，分別置于 50 mL容量瓶中，按照1.3方法處理，用無水乙醇稀釋定容成維 生 素 A 濃 度 0.03616、0.1808、0.3616、1.085、5.424、27.12、54.24、108.5 IU/mL 和維生素 E 濃度0.62274、1.2455、6.2274、12.455、24.910、62.274、124.55 μg/mL系列標(biāo)準(zhǔn)工作液。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的確立 參考國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 17817-2010和GB/T 17812-2008，維生素A和維生素E的分析方法有正相和反相兩種色譜體系。正相法分離效果好，能夠有效分離異構(gòu)體，并且試樣中溶解的脂肪容易被流動(dòng)相沖洗出色譜柱，但是作為溶劑的正己烷揮發(fā)性比較大，長時(shí)間分析樣品濃度會(huì)變化，精密度相對(duì)較差；反相法穩(wěn)定性高，對(duì)于飼料中維生素A和維生素E的分離效果好，保留時(shí)間適中（見圖1）。因此選擇反相色譜系統(tǒng)，采用 C18 柱，甲醇和水（98∶2）作為流動(dòng)相，利用紫外檢測(cè)器可切換波長的功能在326 nm和280 nm處分別記錄維生素A和維生素E的色譜峰。

圖1 維生素A、維生素E標(biāo)準(zhǔn)圖譜（a）和樣品溶液圖譜（b）

2.2 提取劑的確定 本方法對(duì)比選用甲醇、乙醇作為提取劑，實(shí)驗(yàn)表明乙醇比甲醇的提取效果好，同時(shí)對(duì)人體危害性小，因此選擇乙醇作為提取劑。

按照本方法，飼料樣品前處理過程分為皂化提取和乙醇稀釋定容兩部分。超聲波水浴加熱皂化反應(yīng)時(shí)體系中水和乙醇的比例對(duì)于一部分飼料中維生素的檢出值影響比較大。尤其是水產(chǎn)料中的水分散性維生素顆粒，低含水量皂化液使得飼料黏稠不易分散，維生素A和維生素E檢出值相對(duì)較低；相反，濃縮料和配合料在水含量高時(shí)容易黏稠不易分散。實(shí)驗(yàn)比較分析含水量分別為13%、20%、28%、40%、53%五種乙醇皂化體系，結(jié)果如表1，當(dāng)皂化體系水分含量為40%和53%時(shí)，提取效果較好。

由于流動(dòng)相是高比例甲醇體系，如果上機(jī)溶液水分含量較高，一些溶于水不溶于甲醇的物質(zhì)在進(jìn)樣時(shí)容易析出，從而污染色譜柱。用水分含量分別為5%、10%、16%三種上機(jī)乙醇溶液與甲醇1∶1混合，研究最終定容后上機(jī)溶液水分含量對(duì)于色譜系統(tǒng)的影響。發(fā)現(xiàn)16%溶液產(chǎn)生渾濁，10%和5%溶液澄清。

表1 某水產(chǎn)維生素預(yù)混料（水分散型）皂化體系比較

綜合分析，確定皂化時(shí)水含量為40%，最終定容上機(jī)液水分含量為10%，即在50 mL容量瓶中，加入無水乙醇6 mL，抗壞血酸水溶液2.0 mL，氫氧化鉀水溶液2.0 mL，然后皂化提取，加入1.0 mL冰乙酸，冷卻至室溫，用無水乙醇定容至刻度。

2.3 抗氧化劑選擇 在高溫強(qiáng)堿的環(huán)境中維生素E特別容易被氧化，因此在皂化提取時(shí)一般加入抗壞血酸（張艷海等，2015；謝云峰等，2014；黃誠等，2012）或者沒食子酸（李頌群等，2013）防止維生素氧化，國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 17812-2018和GB/T 17817-2010中還加入了2，6二叔丁基對(duì)甲酚（BHT）。本方法采用抗壞血酸作為抗氧化劑，在皂化提取液中分別加入2～200 mg的量，其他條件按照1.3方法處理，比較維生素A和維生素E的值。結(jié)果如表2，當(dāng)抗壞血酸少于40 mg時(shí)，維生素E全部或部分損失，維生素A部分損失；當(dāng)加入量大于100 mg時(shí)，維生素A和維生素E的值相對(duì)穩(wěn)定，本方法選取抗壞血酸加入量為200 mg，即2.0 mL10%的抗壞血酸水溶液。

表2 抗壞血酸含量對(duì)維生素測(cè)定結(jié)果的影響

2.4 皂化提取加堿量控制 取5份相同飼料，分別加入1.5～60 mmol不等的氫氧化鉀，其他條件按照1.3方法，分析色譜峰。結(jié)果如表3，隨著堿含量的增加，皂化液pH不斷升高，當(dāng)氫氧化鉀低于3.0 mmol時(shí)，維生素E未皂化或未完全皂化，維生素A未完全皂化；當(dāng)氫氧化鉀大于10 mmol時(shí)，維生素A和維生素E完全皂化，并且值相對(duì)穩(wěn)定。因此，為保證皂化效果，選擇加入2.0 mL 470 g/L氫氧化鉀（約16 mmol），最后皂化完成時(shí)用1.0 mL冰乙酸調(diào)pH為6.0～7.5。

表3 不同堿含量對(duì)維生素測(cè)定結(jié)果的影響

2.5 皂化溫度控制 取5份相同的飼料，分別在50～100℃的水浴中超聲加熱，其他條件按照1.3方法，分析色譜峰，計(jì)算維生素A和維生素E的含量。結(jié)果如表4，維生素A在60～70℃時(shí)含量最大，低于60℃或高于70℃含量都偏低；維生素E在50～70℃時(shí)含量較穩(wěn)定，80℃以上時(shí)含量下降。分析原因，維生素A在高溫下會(huì)發(fā)生異構(gòu)和聚合反應(yīng)（俞安，2012），維生素E在堿性液體高溫條件下易氧化降解；同時(shí)維生素包膜在溫度較低時(shí)不易被溶解分散，影響維生素溶出效率，所以根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇最佳提取溫度為65℃。

表4 皂化溫度對(duì)維生素測(cè)定結(jié)果的影響

2.6 皂化時(shí)間確定 取A，B兩批不同類型飼料樣品，每批7份，在65℃水浴中分別超聲5～120 min，其他條件按照1.3方法，計(jì)算含量，結(jié)果如表5，在120 min內(nèi)提取的維生素含量基本不變，性質(zhì)較穩(wěn)定?？紤]到其他飼料中維生素含有不同的包被，皂化時(shí)間太短不容易完全釋出，因此選擇20 min作為最終皂化時(shí)間。

表5 皂化時(shí)間對(duì)維生素測(cè)定結(jié)果的影響

2.7 方法線性和檢測(cè)限 按配制好的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度從小到大，分別取20 μL注入液相色譜測(cè)定分析，記錄峰面積，以濃度（x）為橫坐標(biāo)，峰面積（y）為縱坐標(biāo)，繪制線性回歸曲線；同時(shí)添加適量的維生素A和維生素E標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液至2 g空白飼料中，按照1.3方法處理，高效液相色譜分析并記錄色譜峰，以信噪比大于10確定定量限，結(jié)果見表6。

表6 維生素A和維生素E的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.8 回收率和精密度 取三批不同的空白飼料樣品，每批5份，每份2 g，分別添加適量的維生素A和維生素E標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，制得低、中、高三種濃度的樣品，按實(shí)驗(yàn)方法1.3處理，取20 μL樣品溶液注入液相色譜測(cè)定分析，外標(biāo)法計(jì)算含量，并計(jì)算回收率，結(jié)果見表7。

2.9 穩(wěn)定性與重復(fù)性 取一份飼料樣品按照1.3方法處理，放置 0、1.5、3、4.5、10 h 后進(jìn)樣測(cè)定，記錄維生素A和維生素E的峰面積并計(jì)算RSD分別為0.8%和1.1%，表明飼料樣品溶液中維生素A和維生素E在10 h內(nèi)穩(wěn)定。另取一批次飼料樣品6份，按照1.3方法處理，分別進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算維生素A和維生素E含量，計(jì)算RSD分別為2.5%、4.9%，表明本方法重復(fù)性良好。

表7 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=5）

2.10 與其他方法含量測(cè)定結(jié)果的比較 選取3種維生素預(yù)混料、5種復(fù)合預(yù)混料、1種配合料、1種濃縮料共10批次飼料樣品，分別用酶解法（曹冶，1997）、甲醇直接提取法（GB/T 17817-2010 第二法和GB/T 17812-2008第二法）、皂化法（GB/T 17817-2010第一法和GB/T 17812-2008第一法）和本方法處理測(cè)定維生素A和維生素E含量，結(jié)果如表8。酶解法測(cè)定時(shí)，不同樣品提取效果會(huì)有差異，一些樣品不能完全被提取，這可能和維生素包被壁材的類型有關(guān)系；甲醇提取法測(cè)定維生素A普遍偏低，測(cè)定維生素E相對(duì)較好，只有個(gè)別樣品偏低，一是因?yàn)樵诩状既軇┲?，長時(shí)間高溫使得維生素A產(chǎn)生了異構(gòu)體，另一方面也可能是和維生素包被壁材的類型有關(guān)，一些包膜不能被甲醇破壞溶解，維生素不能完全釋出；本方法和皂化法測(cè)定結(jié)果基本一致，略有偏高（特別是維生素E），這可能是本方法相對(duì)較少的步驟和時(shí)間，相對(duì)較低的皂化溫度，優(yōu)化了皂化體系，減少了維生素的損失。因此在日常飼料檢測(cè)中可以利用本方法快速測(cè)定維生素A和E的含量，結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

3 討論與結(jié)論

目前維生素的壁材包被物質(zhì)主要有明膠、阿拉伯膠、環(huán)糊精、變性淀粉、乳糖、玉米糖漿等以及多種壁材的混合物。淀粉和環(huán)糊精在高溫和堿的作用下易產(chǎn)生糊化作用分散在含水溶劑中形成膠體溶液；乳糖、玉米糖漿在水中易溶解；明膠、阿拉伯膠和乳清濃縮蛋白等含蛋白質(zhì)物質(zhì)在強(qiáng)堿加熱條件下容易水解。因此本方法采用皂化法，并且精簡(jiǎn)優(yōu)化操作，適用性廣，結(jié)果更準(zhǔn)確，可以廣泛應(yīng)用于飼料中維生素A和維生素E的質(zhì)量控制。

表8 四種方法測(cè)定飼料中維生素A和維生素E含量的比較

維生素預(yù)混料和復(fù)合預(yù)混料中主要成分是礦物質(zhì)或者含纖維素多的物料，不含或含有極少量脂肪和蛋白質(zhì)，皂化后的產(chǎn)物與其他有機(jī)質(zhì)比較相對(duì)單一，采取皂化后直接進(jìn)行色譜分析，皂化溫度相對(duì)較低，簡(jiǎn)化了萃取操作，不僅提高工作效率，還減少樣品損失，降低了誤差。但是本方法取樣量相對(duì)國標(biāo)皂化法少，對(duì)于飼料樣品的均勻度要求相對(duì)較高。

樣品提取液溶解有部分醋酸鉀等無機(jī)鹽和其他水溶物，在分析時(shí)也會(huì)進(jìn)入到液相色譜系統(tǒng)。特別是其他水溶物，和流動(dòng)相混合時(shí)，容易析出甲醇不溶物，因此在提取時(shí)減少鹽和水的含量，但又能滿足皂化要求，加入堿和抗壞血酸的量都選擇較低水平，提取液體系中水的含量控制在10%左右。同時(shí)在色譜分析一段時(shí)間或者完成全部分析后要用15%左右的甲醇水溶液沖洗色譜柱至少60 min，有利于延長色譜柱的使用壽命。

實(shí)際飼料樣品中，維生素A含量的范圍跨度比較大，使得制備的樣品上機(jī)液濃度范圍跨度也大，在使用相對(duì)應(yīng)寬濃度范圍（最高濃度和最低濃度相差2500倍）標(biāo)準(zhǔn)校準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量時(shí)，高濃度或者低濃度樣品的校準(zhǔn)濃度和實(shí)際濃度有一定的差異，導(dǎo)致定量不準(zhǔn)確，因此可以采用高、低兩個(gè)濃度范圍分段做標(biāo)準(zhǔn)校準(zhǔn)曲線。