楊力權(quán) ， 周連廣 ， 陳貴元 ， 桑 鵬 *

（1.大理大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院，云南大理671003；2.大理大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南大理671000；3.云南省昆蟲生物醫(yī)藥研發(fā)重點實驗室，云南大理671000）

纖維素是光合作用的初級產(chǎn)物，占植物干重的35%～50%，是分布最廣、含量最豐富的碳水化合物（Zhang 等，2006；Kubicek 等，1993）。 但是纖維素的結(jié)構(gòu)十分穩(wěn)定，只有很少一部分能夠被利用，更多的被浪費甚至造成污染。如何有效地開發(fā)利用纖維素資源已成為當(dāng)今研究的熱門課題。研究表明，利用生物酶的水解作用，可以促使纖維素降解，但生物酶的生產(chǎn)具有酶活力低和生產(chǎn)成本高等問題，阻礙了生物酶的實際應(yīng)用。因此，進(jìn)一步尋找和開發(fā)高產(chǎn)纖維素酶菌種，是纖維素資源高效利用的關(guān)鍵。目前，已分離到產(chǎn)纖維素酶的微生物主要集中在真菌、放線菌和部分酵母菌等（Yang 等，2009；Alani等，2008），對于細(xì)菌產(chǎn)纖維素酶方面的研究還鮮有報道。本研究以大理彌渡縣熱泉土樣為材料，篩選出能耐高溫產(chǎn)纖維素酶的菌株，分類鑒定及研究酶學(xué)性質(zhì)，為纖維素酶的發(fā)酵工業(yè)新備選菌株的開發(fā)應(yīng)用提供資源，為進(jìn)一步開發(fā)利用該菌株及獲得產(chǎn)纖維素酶基因的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 土壤樣品 土壤樣品來自大理彌渡縣石夾泉熱泉的底泥，熱泉水溫55℃。

1.1.2 主要儀器 顯微鏡（奧林巴斯）；紫外可見光分光光度計（上海菁華儀器公司）；高速冷凍離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器公司）；恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；水浴恒溫?fù)u床（常州國華電器有限公司）；高壓蒸汽滅菌鍋（上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司）；超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司）；PCR擴(kuò)增儀（美國ABI）；電泳儀（北京六一生物科技有限公司）。

1.1.3 試劑 酵母抽提物、蛋白胨為英國進(jìn)口；瓊脂粉為西班牙進(jìn)口分裝；羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）、氯化鈉、結(jié)晶紫、碘、乙醇、孔雀綠、番紅均為國產(chǎn)分析純試劑。DNA抽提試劑盒、PCR擴(kuò)增試劑盒、膠回收試劑盒和DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)品均購自北京天根生物技術(shù)有限公司。

1.1.4 培養(yǎng)基 LB液體培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨10.0，酵母粉 5.0，NaCl 10.0，pH 7.2，121 ℃滅菌 20 min。

羥甲基纖維素培養(yǎng)基 （g/L）：（NH4）2SO42.0，K2HPO41.0，MgSO4·7H2O 0.2，NaCl 5.0，CMC-Na 15.0，pH 7.2，121℃滅菌20 min。固體培養(yǎng)基添加2%瓊脂。

羥甲基纖維素剛果紅培養(yǎng)基（g/L）：K2HPO40.5，MgSO40.25，CMC 1.88，剛果紅 0.2，明膠 2.0，瓊脂 14.0，pH 7.2，121 ℃滅菌 20 min。

稻草發(fā)酵培養(yǎng)基 （g/L）：稻草10.0，蛋白胨5.0，NaCl 5.0，KH2PO41.0，MgSO4·7H2O 0.2， 酵母粉 5.0，葡萄糖 1.0，pH 7.2，121 ℃滅菌 20 min。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株富集 稱取石夾泉熱泉底泥2.0 g于45 mL的無菌蒸餾水中，150 r/min，振蕩15 min。在無菌條件下，用移液槍吸取5 mL懸液于50 mL的富集培養(yǎng)基中，將接種好的富集培養(yǎng)基置于43℃轉(zhuǎn)速為150 r/min的水浴恒溫振蕩培養(yǎng)箱中振蕩培養(yǎng)24 h。

1.2.2 菌株初篩 將富集好的菌液稀釋至10-3、10-6、10-9倍，用移液槍分別吸取稀釋的菌液150 μL接種在篩選培養(yǎng)基平板上，涂布均勻。于37℃，倒置培養(yǎng)24 h。觀察菌落周圍若有透明圈出現(xiàn)，說明該菌株能產(chǎn)生纖維素酶。

1.2.3 菌株復(fù)篩 將初篩得到的菌株取少量接種于種子瓶（LB液體培養(yǎng)基），55℃，培養(yǎng)24 h后，將種子液按2%的接種量接入到發(fā)酵培養(yǎng)基，55℃，150 r/min水浴搖床培養(yǎng)1周。離心取上清測酶活。

酶活測定：參照 Hardin（2000）和 Ghose（1987）的方法進(jìn)行測定。酶活力單位（U）：在一定條件下，每毫升酶液每分鐘水解底物生成1 μmol葡萄糖的能力定義為1個酶活力單位。

1.2.4 菌株鑒定

1.2.4.1 形態(tài)學(xué)、生理生化特征 產(chǎn)酶菌株的形態(tài)觀察及生理生化試驗參照黃秀梨等（2008）的方法進(jìn)行。

1.2.4.2 16S rRNA基因序列測序和分析 根據(jù)北京天根生化科技有限公司提供的試劑盒以及說明書進(jìn)行DNA的提取。使用通用引物 27F:5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’ 和 1492R：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’擴(kuò)增細(xì)菌 16S rDNA。擴(kuò)增條件為：預(yù)變性94℃，5 min，變性94℃，30 s，退火 50 ℃，45 s，延伸 72 ℃，100 s，最后延伸72℃，5 min，循環(huán)30次，將PCR產(chǎn)物加入預(yù)先制備好的0.8%瓊脂糖凝膠中，140 V，電泳1 h，瓊脂糖凝膠回收根據(jù)北京天根生化科技有限公司提供的試劑盒以及說明書進(jìn)行。將PCR回收產(chǎn)物送廣州英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司測序，將獲得的序列提交GenBank（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov），根據(jù)BLAST數(shù)據(jù)庫中細(xì)菌16S rRNA基因序列進(jìn)行相似性比較分析，利用MEGA 5.0軟件進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析。

1.2.5 菌株最適生長溫度 按接種量為1%接種于LB液體培養(yǎng)基中，置于不同的溫度（25、31、37、43、49、55 ℃）下?lián)u床培養(yǎng) 24 h，然后在波長600 nm處測定各個溫度下菌株生長的吸光值，以確定菌株的最適生長溫度。

1.2.6 酶學(xué)性質(zhì)

1.2.6.1 溫度對酶活力的影響 將酶液分別在4～85℃條件下測定纖維素酶的活力。

1.2.6.2 pH對酶活力的影響 在最適酶活溫度下，配制不同pH的反應(yīng)緩沖液，檢測不同pH對纖維素酶活力的影響。

1.2.6.3 酶的熱穩(wěn)定性 將1 mL酶液分別置于不同的溫度（4、25、37、55、75 ℃）下保溫，在保溫15、30、60、90、120 min 時測定酶活。 以保溫 0 min各溫度下所測得的酶活為對照組，不同溫度保溫不同時間，所測得的酶活與相應(yīng)溫度保溫0 min所測得的酶活相比，并計算相對酶活，用相對酶活繪制出酶的熱穩(wěn)定性曲線。

1.2.6.4 金屬離子對酶活力的影響 將1 mL的酶液和10 μL濃度為0.1 mol/L的金屬離子（Ca2+、Fe2+、Mn2+、Cu2+、Zn2+、Mg2+、K+）混勻，將其放置到 4 ℃冰箱過夜，第二天測定各組酶活力。以未加入金屬離子的酶液反應(yīng)體系作為對照組，測定和觀察金屬離子對酶活力的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)酶菌株的篩選 根據(jù)水解圈直徑與菌落直徑比值的大小。篩選出5株產(chǎn)高溫纖維素酶菌株。其中1號菌株水解圈直徑與菌落直徑比值（R1/R2）最大。經(jīng)復(fù)篩發(fā)現(xiàn)5株菌均為分泌型纖維素酶產(chǎn)生菌，且1號菌株酶活最高，達(dá)到59.94 U/mL，與初篩的結(jié)果相符。因此，選擇1號菌株作為后續(xù)試驗研究菌株，命名為Cel-55。

2.2 菌種鑒定

2.2.1 形態(tài)學(xué)、生理生化特征 Cel-55在LB培養(yǎng)基上37℃培養(yǎng)72 h后，菌落呈乳白色，不透明，圓形隆起，黏稠，不易挑取。革蘭氏染色為陽性，菌體呈桿狀，有中生芽孢。

對Cel-55的生理生化特性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)V-P試驗、吲哚試驗、明膠試驗結(jié)果均為陽性；甲基紅試驗結(jié)果為陰性；乳糖發(fā)酵試驗結(jié)果為陰性；葡萄糖發(fā)酵試驗、蔗糖發(fā)酵試驗結(jié)果均為能利用糖，但不產(chǎn)氣。

2.2.2 16S rRNA基因序列及系統(tǒng)發(fā)育分析 16S rRNA基因測序，所獲得的序列長度為1436 bp，將Cel-55的16S rRNA基因序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行同源性比對，發(fā)現(xiàn)Cel-55與芽孢桿菌屬的16S rRNA基因序列自然聚類，Cel-55的16S rRNA基因序列與15條相似性較高的序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖1），從圖中可以看出，Cel-55與 Bacillus aryabhattaistrain WU-7（MH174183.1） 和 Bacillus megaterium strain N3（MH715353.1）的菌株聚為一群，相似性也最高，表明Cel-55與Bacillus sp.親緣關(guān)系最近。

圖1 基于16S rRNA基因序列相似性的菌株Cel-55與15株細(xì)菌的系統(tǒng)進(jìn)化樹

根據(jù)Cel-55的形態(tài)及生理生化特征，結(jié)合《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》（第八版）（布坎南等，1984），以及Cel-55 16S rRNA基因序列及系統(tǒng)發(fā)育樹，將Cel-55初步鑒定為芽孢桿菌屬 （Bacillussp.）的一株菌，命名為Bacillussp.Cel-55。

2.3 菌種的最適生長溫度 在波長600 nm處測定不同溫度培養(yǎng)下LB培養(yǎng)基的吸光值，以600 nm處的吸光值為縱坐標(biāo)，溫度為橫坐標(biāo)作溫度-吸光值關(guān)系曲線，結(jié)果如圖2。

由圖2可知，25～37℃，菌體的生長量隨著溫度的升高而增加，37℃時，LB培養(yǎng)基在600 nm下的吸光值最高，表明37℃是菌株的最適生長溫度。37℃以后，菌體生長量隨著溫度的升高而下降，菌株在55℃下還有一定生長，表明菌株屬于典型的耐高溫菌。

圖2 Cel-55菌株生長曲線

2.4 菌株Cel-55的纖維素酶性質(zhì)

2.4.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線 根據(jù)制作葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法，制作出的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程為y=0.8632x-0.0721，線性相關(guān)性R2=0.9947，表明線性比較好。

2.4.2 溫度對酶活的影響 在不同溫度下測定酶的活性，以酶活力為縱坐標(biāo)，溫度為橫坐標(biāo)作溫度—酶活關(guān)系曲線（圖3）。

圖3 溫度對Cel-55纖維素酶活性的影響

從圖3可以看出，低溫能抑制酶的活性，但不能使酶失活，在4℃的條件下，纖維素酶仍具有活性，但活性較低，4～75℃，隨著溫度升高，酶活力增加，在75℃時，酶活力達(dá)到最大值，為59.94 U/mL。在75℃之后，隨著溫度升高，纖維素酶活力反而降低，部分酶失去活性。酶反應(yīng)都有一個最適反應(yīng)溫度，在沒有達(dá)到最適反應(yīng)溫度之前，酶活力隨著溫度升高而增加，溫度超過最適反應(yīng)溫度，酶開始失活，反應(yīng)速度降低，75℃是纖維素酶的最適反應(yīng)溫度，菌株產(chǎn)生的纖維素酶屬于典型的耐熱纖維素酶。

2.4.3 纖維素酶的最適反應(yīng)pH 從圖4可以看出，pH 5.0之前，纖維素酶活力隨著pH的升高而升高，在pH 5.0之后，纖維素酶活性下降且下降速度較快，酶促反應(yīng)都有最適pH，當(dāng)反應(yīng)體系pH大于或者小于酶促反應(yīng)的最適pH時，酶活力相對于最適酶促反應(yīng)pH條件下的酶活力較低。pH 5.0是該纖維素酶的最適反應(yīng)pH，表明菌株Cel-55產(chǎn)生的纖維素酶屬于酸性纖維素酶。

圖4 pH對Cel-55纖維素酶活性的影響

圖5 Cel-55纖維素酶的熱穩(wěn)定性

2.4.4 纖維素酶熱穩(wěn)定性 測定各個溫度下不同時間點纖維素酶的酶活，以保溫0 min各溫度下所測得的酶活為對照組，其余溫度不同時間下所測得的酶活與其相比并計算相對酶活，用相對酶活繪制出酶的熱穩(wěn)定性曲線，結(jié)果如圖5所示。從圖5可以看出，纖維素酶在37℃以下，能夠在長時間內(nèi)保持相對穩(wěn)定的酶活。酶在75℃保溫120 min，酶活損失近20%，表明該酶熱穩(wěn)定性較好。菌株產(chǎn)生的酶雖然是高溫纖維素酶，但酶在較高的溫度下，酶活性隨著保溫時間的增加而降低，溫度耐受性質(zhì)符合一般酶的性質(zhì)。

2.4.5 金屬離子對酶活力的影響 本試驗中，將加有金屬離子的稀釋酶液在4℃中保溫過夜，以未加入金屬離子的酶液反應(yīng)體系作為對照組，測定各種金屬離子對酶活力的影響結(jié)果，結(jié)果見表1。

表1 金屬離子對Cel-55酶活的影響 %

從表 1 可知，Zn2+、Mn2+、Ca2+、K+、Mg2+、Fe2+、Cu2+均對Cel-55纖維素酶活力起一定的抑制作用，其中Mg2+的抑制效果最為明顯。金屬離子通過與酶的活性中心結(jié)合，影響酶活性。因此，Zn2+、Mn2+、Ca2+、K+、Mg2+、Fe2+、Cu2+均能與酶的活性中心基團(tuán)結(jié)合，抑制酶的活性中心與底物結(jié)合，使酶活性降低。

3 結(jié)論

大多數(shù)商業(yè)化的纖維素酶是中溫真菌的胞外酶，雖然水解活力高，但在高溫環(huán)境下易失活。由于大多數(shù)工業(yè)過程都在高溫下（＞60℃）進(jìn)行，因此對嗜熱/耐熱纖維素酶的需求越來越迫切。近年來，在研究耐熱纖維素酶的過程中，嗜熱真菌（最適生長溫度在50℃及以上的真菌被稱為嗜熱真菌）引起了廣泛關(guān)注。嗜熱真菌所產(chǎn)的纖維素酶通常在pH 3.0～11.0有活性，最適作用溫度一般在60～75℃，且在長時間的保溫過程中具有較好的熱穩(wěn)定性 （Li等，2011；Liu 等，2006；Wojtczak等，1987）。實際上，除了嗜熱真菌，嗜熱細(xì)菌也可產(chǎn)生嗜熱纖維素酶。

本研究從大理彌渡白總旗熱泉篩選到一株能向胞外分泌高溫纖維素酶的菌株，經(jīng)初步鑒定為芽孢桿菌屬的一株菌，命名為Bacillus sp.Cel-55。菌株最適生長溫度為37℃，菌株在55℃仍能生長。酶學(xué)性質(zhì)研究表明，最適作用溫度為75℃，最適pH為5.0，為酸性纖維素酶。酶在25℃以下能在較長時間內(nèi)保持穩(wěn)定，Ca2+、Mn2+、K+、Fe2+、Cu2+、Zn2+和 Mg2+對 Cel-55纖維素酶的活力有一定的抑制作用。