劉 輝, 季海峰, 王四新, 張董燕, 王 晶, 張 偉, 王雅民, 王帥欽
(北京市農(nóng)林科學院畜牧獸醫(yī)研究所,北京 100097)
γ-氨基丁酸(GABA)是廣泛存在于動植物及微生物細胞中的一種非蛋白氨基酸,是哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì),具有鎮(zhèn)靜、降血壓、改善腦機能和脂質(zhì)代謝等多種生理功能(Diana 等,2014;Jakobs等,1993)。有研究表明,GABA作為飼料添加劑應用于動物生產(chǎn),能夠提高動物生產(chǎn)性能、改善胴體品質(zhì)、提高抗熱應激及機體抵抗能力(施忠秋和齊智利,2014;沈名燦等,2012; Zendehdel等,2009;胡家澄等,2008),在飼料工業(yè)中展現(xiàn)出了良好的應用前景。
目前,GABA的生產(chǎn)制備主要采用微生物發(fā)酵的方法(Wang 等,2003;Kono 等,2000),乳酸菌是其中一類重要的生產(chǎn)菌種 (Dhakal等,2012;Li等,2010)。乳酸菌是動物腸道的正常菌群,被認為是可直接飼喂且安全的微生物(GRAS),也是目前應用最為廣泛、效果較好的一類飼用微生物。Siragusa等(2007)研究發(fā)現(xiàn),乳酸菌具有較強的GABA發(fā)酵能力。
本研究以一株能夠合成GABA的乳酸片球菌ZPA017為研究對象,采用單因素篩選和響應面試驗法,對其發(fā)酵合成GABA的發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件進行優(yōu)化,以期提高ZPA017的GABA產(chǎn)量,為進一步深入研究和開發(fā)飼用益生菌提供理論依據(jù)。
1.1 菌種與基礎(chǔ)培養(yǎng)基 乳酸片球菌ZPA017:分離自健康北京黑豬糞便,由中國普通微生物菌種保藏管理中心鑒定并保存于本研究室。
基礎(chǔ)培養(yǎng)基(MRS培養(yǎng)基):葡萄糖20 g/L、蛋白胨10 g/L、牛肉膏10 g/L、酵母膏5 g/L、檸檬酸氫二銨2 g/L、磷酸氫二鉀2 g/L、乙酸鈉5 g/L、硫酸鎂 0.58 g/L、硫酸錳0.19 g/L、吐溫-80 1 mL/L,調(diào)節(jié)pH為6.5,121℃滅菌15 min。
1.2 方法
1.2.1 發(fā)酵方法 將-80℃保存的菌種,連續(xù)兩次復壯后按1%的接種量接種于裝有100 mL滅菌液體培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中,37℃靜置培養(yǎng)24 h。
1.2.2 GABA的測定方法 參考竇海艷(2010)的方法,采用Berthelot比色法檢測GABA的含量:取不同濃度的GABA標準液和處理后的發(fā)酵液上清液0.4 mL,加入0.1 mL 1 mol/L的碳酸鈉溶液、0.5 mL 0.2 mol/L的四硼酸鈉溶液、1 mL 6%苯酚、1 mL 10%次氯酸鈉溶液,搖勻后靜置10 min。沸水浴10 min后冰浴20 min,待溶液出現(xiàn)藍綠色后,加入2 mL 60%的乙醇溶液,搖勻后靜置30 min。640 nm波長處測定吸光值,依據(jù)標準曲線計算GABA含量。
1.2.3 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化
1.2.3.1 單因素試驗法篩選培養(yǎng)基碳氮源及碳氮比 在MRS培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上,固定其他成分,選取不同的碳氮源分別取代MRS培養(yǎng)基中的碳氮源,研究不同碳氮源對GABA產(chǎn)量的影響,篩選出發(fā)酵培養(yǎng)基的最優(yōu)碳氮源,并在此基礎(chǔ)上篩選出發(fā)酵培養(yǎng)基的最優(yōu)碳氮比。
1.2.3.2 響應面法優(yōu)化培養(yǎng)基配方 以GABA質(zhì)量濃度為響應指標,采用3步進行優(yōu)化:首先采用Plackett-Burman試驗確定對響應值影響顯著的主要因素;然后進行最陡爬坡試驗確定試驗因素的中心點;最后運用Minitab軟件采用Box-Behnken法創(chuàng)建響應面設(shè)計,進行響應面分析,確定最優(yōu)培養(yǎng)基配方,并進行驗證試驗。
1.2.4 發(fā)酵條件的優(yōu)化 在優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上,采用單因素試驗法研究發(fā)酵溫度、初始pH、接種比例和發(fā)酵時間等培養(yǎng)條件對GABA產(chǎn)量的影響,確定最優(yōu)發(fā)酵條件。
2.1 發(fā)酵培養(yǎng)基單因素試驗結(jié)果
2.1.1 不同碳源對GABA產(chǎn)量的影響 碳源物質(zhì)是培養(yǎng)基的主要組分之一,是構(gòu)成菌體合成GABA的碳架及能量來源。由圖1可知,乳酸片球菌ZPA017可以利用多種碳源合成GABA,但利用率不同,產(chǎn)量不一。當以D-果糖為碳源時,GABA產(chǎn)量最高,因此將D-果糖作為乳酸片球菌發(fā)酵合成GABA的最適碳源。
圖1 不同碳源對GABA的影響
2.1.2 不同氮源對GABA產(chǎn)量的影響 氮源是組成菌體核酸和蛋白質(zhì)的重要元素,對微生物的生長發(fā)育有著重要作用。由圖2可知,當以大豆蛋白胨作為氮源時,乳酸片球菌的GABA產(chǎn)量明顯高于其他氮源,因此選擇大豆蛋白胨作為最優(yōu)氮源。
圖2 不同氮源對GABA的影響
2.1.3 不同碳氮比對GABA產(chǎn)量的影響 碳氮比過高和過低都不利于細胞生長和代謝產(chǎn)物的合成,適當?shù)奶嫉壤兄谖⑸锇l(fā)酵分解。由圖3可知,當碳氮比為1∶2時,GABA的產(chǎn)量最高,因此選擇1∶2作為發(fā)酵培養(yǎng)基的初始碳氮比。
圖3 不同碳氮比對GABA的影響
2.1.4 響應面法優(yōu)化培養(yǎng)基
2.1.4.1 Plackett-Burman(P-B)試驗設(shè)計篩選顯著影響因子 選用N=12的P-B試驗設(shè)計,以乳酸片球菌GABA產(chǎn)量為響應值,篩選出對GABA產(chǎn)量影響顯著的培養(yǎng)基成分。試驗選擇7個因素:D-果糖(X1)、大豆蛋白胨(X2)、乙酸鈉(X4)、磷酸氫二鉀(X5)、檸檬酸氫二銨(X7)、硫酸鎂(X8)和硫酸錳(X10),外加 3 個虛擬變量(X3、X6、X9)。 試驗設(shè)計及結(jié)果見表1,各因素水平及主效應分析見表2。
表1 Plackett-Burman試驗設(shè)計及響應值
表2 Plackett-Burman試驗結(jié)果分析
由表2可以看出,在這7個因素的主效應中,對結(jié)果產(chǎn)生正效應的因素有大豆蛋白胨、乙酸鈉、硫酸鎂和硫酸錳,對結(jié)果產(chǎn)生負效應的因素有D-果糖、磷酸氫二鉀和檸檬酸氫二銨。在95%的水平上磷酸氫二鉀、硫酸鎂、D-果糖和硫酸錳差異顯著,其他因素在這個水平上差異不顯著。將負效應的因素固定在-1水平,正效應的因素固定在+1水平,選取磷酸氫二鉀、硫酸鎂、D-果糖和硫酸錳這4個顯著因素進行下一步試驗。
2.1.4.2 最陡爬坡試驗設(shè)計確定重要影響因素的水平 對P-B試驗設(shè)計篩選得到的顯著影響因素進行最陡爬坡試驗,確定最陡爬坡試驗的方向和梯度,進而確定試驗因素的中心點。試驗設(shè)計及結(jié)果見表3。由表3可以看出,隨著硫酸鎂和硫酸錳質(zhì)量濃度升高、磷酸氫二鉀和D-果糖質(zhì)量濃度的降低,GABA產(chǎn)量呈先上升后下降的變化趨勢,產(chǎn)量最高的響應值區(qū)域在第4組試驗,因此以第4組因素的水平作為響應面試驗設(shè)計的中心點,即磷酸氫二鉀1.4 g/L、硫酸鎂0.65 g/L、D-果糖19 g/L和硫酸錳0.31 g/L。
表3 最陡爬坡試驗設(shè)計及結(jié)果 g/L
2.1.4.3 響應面分析法確定最大響應值 根據(jù)P-B試驗、最陡爬坡試驗,以及Box-Behnken的中心組合設(shè)計原理,設(shè)計4因素3水平的響應面試驗,以磷酸氫二鉀、硫酸鎂、D-果糖和硫酸錳4個因素為自變量,以GABA的產(chǎn)量為響應值,根據(jù)最陡爬坡試驗的結(jié)果確定試驗中心和水平。試驗因素與水平的選取見表4,Box-Behnken試驗設(shè)計及結(jié)果見表5。
表4 Box-Behnken試驗因素與水平
根據(jù)表5結(jié)果,用Minitab 16軟件對數(shù)據(jù)進行二次回歸分析,得到的回歸方程為:
式中:Y為乳酸片球菌GABA產(chǎn)量的預測響應值;X1、X2、X3、X4分別為磷酸氫二鉀、 硫酸鎂、D-果糖和硫酸錳的編碼值。
由 表 6 可 以 看 出 ,X1、X2、X3、X4、X12、X22、X32、X42、X3X4對 GABA 產(chǎn)量有顯著的影響(P < 0.05)。由表7可知,回歸方程P<0.01,失擬項P>0.05,說明所得數(shù)據(jù)擬合效果較好;相關(guān)系數(shù)R2=95.47%,R2(調(diào)整)=90.18%,說明模型相關(guān)度很好。所以,此模型可以用來分析和預測GABA的產(chǎn)量。
表5 Box-Behnken試驗設(shè)計及結(jié)果
表6 回歸方程中回歸系數(shù)的估計值
表7 回歸方程的方差分析
根據(jù)上述回歸方程繪出響應面分析圖及等高線圖,以確認磷酸氫二鉀、硫酸鎂、D-果糖和硫酸錳4個因素對GABA產(chǎn)量的影響,響應面圖和等高線圖見圖4。由圖及軟件分析可知所得擬合回歸方程存在穩(wěn)定點,即極大值點。根據(jù)Minitab軟件得到的回歸方程,可計算得到GABA產(chǎn)量的最大預測值為1.0237 g/L,此時4個因素的質(zhì)量濃度為:磷酸氫二鉀1.3747 g/L、硫酸鎂0.6313 g/L、D-果糖18 g/L、硫酸錳0.29 g/L。
圖4 各因素交互作用響應面分析圖與等高線圖
2.1.4.4 驗證試驗 為了驗證模型預測的準確性,采用優(yōu)化培養(yǎng)基重復試驗3次,結(jié)果乳酸片球菌發(fā)酵液中的GABA平均產(chǎn)量為1.006 g/L,與響應面預測的最大產(chǎn)量1.0237 g/L接近,誤差為1.76%,這表明該模型能夠很好地預測試驗結(jié)果。
由上得到乳酸片球菌ZPA017的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基為:磷酸氫二鉀1.37 g/L、硫酸鎂0.63 g/L、D-果糖18 g/L、硫酸錳0.29 g/L、大豆蛋白胨40 g/L、乙酸鈉3 g/L、檸檬酸氫二銨2 g/L、吐溫-80 1 mL/L。
2.2 發(fā)酵條件的確定
2.2.1 發(fā)酵溫度 不同溫度(25、28、30、32、35、37、40℃和42℃)對乳酸片球菌ZPA017發(fā)酵合成GABA的影響見圖5。由圖5可知,培養(yǎng)溫度對乳酸片球菌ZPA017發(fā)酵合成GABA具有明顯的影響,較高或較低的溫度均不利于GABA的合成,當溫度為37℃時,GABA的產(chǎn)量最高(為1.005 g/L),因此將37℃作為該菌株產(chǎn)GABA的最適發(fā)酵溫度。
圖5 不同溫度對GABA的影響
2.2.2 初始 pH 不同培養(yǎng)基初始 pH(5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5 和 8.0) 對乳酸片球菌 ZPA017 發(fā)酵合成GABA的影響見圖6。結(jié)果表明,乳酸片球菌ZPA017合成GABA的最適初始pH為6.5,初始pH增大或減小均會影響GABA的合成。這可能是因為培養(yǎng)基的pH可通過改變菌體膜表面電荷影響菌體對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收,從而影響菌體的生長和體內(nèi)GABA的合成。
2.2.3 接種比例 不同接種比例 (0.1%、0.2%、0.5%、1%、3%和5%)對乳酸片球菌ZPA017合成GABA的影響見圖7。由圖7可以看出,當接種比例為1%時GABA的產(chǎn)量最高,為1.019 g/L,因此將1%作為該菌株發(fā)酵合成GABA的最佳接種比例。
圖6 不同初始pH對GABA的影響
圖7 不同接種比例對GABA的影響
2.2.4 發(fā)酵時間 不同發(fā)酵時間(6、18、24、30、42、48、60 h 和 72 h)對乳酸片球菌 ZPA017 合成GABA的影響見圖8。由圖8可知,當培養(yǎng)開始后,GABA的產(chǎn)量隨著發(fā)酵時間的延長而提高;當培養(yǎng)到30 h時,GABA產(chǎn)量達到1.036 g/L;此后,發(fā)酵液中的GABA含量趨于穩(wěn)定。這可能是因為隨著培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)被消耗和代謝產(chǎn)物的增加,菌體活力下降并進入衰亡期,GABA的合成也逐漸停止。綜上,將GABA生物合成量較高的30 h作為該菌株發(fā)酵合成GABA的最佳培養(yǎng)時間。
圖8 不同發(fā)酵時間對GABA的影響
采用單因素篩選和響應面法,對乳酸片球菌ZPA017發(fā)酵合成GABA的條件進行了優(yōu)化,結(jié)果得到其最佳發(fā)酵培養(yǎng)基配方為:D-果糖18 g/L、大豆蛋白胨40 g/L、乙酸鈉3 g/L、磷酸氫二鉀1.37 g/L、檸檬酸氫二銨2 g/L、硫酸鎂0.63 g/L、硫酸錳0.29 g/L、吐溫-80 1 mL/L;其最佳發(fā)酵條件為:溫度37℃、初始pH 6.5、接種比例 1%、發(fā)酵時間30 h。乳酸片球菌ZPA017在此培養(yǎng)基和發(fā)酵條件下培養(yǎng),發(fā)酵液中γ-氨基丁酸的含量可達1.036 g/L,是未優(yōu)化前產(chǎn)量(0.275 g/L)的3.77倍,達到了提高GABA產(chǎn)量的目的。