王昆，羅小娜，李時光，馮麗君，劉新生

帕金森?。≒arkinson's disease，PD）為老年人常見的神經(jīng)退行性病變，調(diào)查顯示其發(fā)病率高于阿爾茨海默病，且發(fā)病率逐年升高，85 歲以上的老年人中發(fā)病率達(dá) 5%，對患者認(rèn)知、神經(jīng)、行動等機能產(chǎn)生嚴(yán)重的影響，給家庭、社會帶來巨大的精神負(fù)擔(dān)[1]。目前 PD 病因尚不明確，因此探究其發(fā)病機制，尋找該病的治療靶點對于提高患者預(yù)后具有積極的意義。氧化應(yīng)激損傷導(dǎo)致多巴胺水平降低是 PD 發(fā)病的重要原因[2]，核因子 E2 相關(guān)因子 2（nuclear factor E2-related factor2，Nrf2）/血紅素加氧酶-1（heme oxygenase-1，HO-1）信號通路是重要的抗氧化信號通路，多數(shù)體外研究顯示激活 Nrf2/HO-1 通路后能夠緩解 PD 模型細(xì)胞氧化應(yīng)急損傷，降低小膠質(zhì)細(xì)胞活化程度，緩解神經(jīng)損 傷[3-4]，但與黑質(zhì)區(qū)神經(jīng)元損傷的關(guān)系目前尚不明確。本研究通過制備 PD 大鼠、PD 模型細(xì)胞，給予 Nrf2/HO-1 通路抑制劑及激活劑處理，探究 Nrf2/HO-1 通路在 PD 發(fā)生發(fā)展中的作用，以期為 PD 的治療提供新的參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物及細(xì)胞 無特定病原體（specific pathogen free，SPF）級 SD 大鼠，體質(zhì)量 200～240 g，8 周齡，由河南省動物實驗中心提供，許可證號：SYXK（豫）2017-0002。大鼠均置于 23～25 ℃、濕度 50%～60%，晝夜交替 12 h（光照 12 h，黑夜 12 h）的環(huán)境中統(tǒng)一喂養(yǎng)，正常喂養(yǎng) 1 周后進(jìn)行模型制備。

人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞 SH-SY5Y 購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞研究所，置于 10% 胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）的 DMEM 培養(yǎng)基，放置在 5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi) 37 ℃ 培養(yǎng)。

1.1.2 試劑與儀器 6- 羥基多巴胺（6-hydroxydopamine，6-OHDA）、阿普嗎啡、FBS、DMEM 培養(yǎng)基購自美國 Sigma 公司；丙二醛（malondialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（superoxidedismutase，SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、過氧化氫酶（catalase，CAT）檢測試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；BCA 蛋白測定試劑盒、HE 染色試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所；RIPA 蛋白裂解液購自美國 Invitrogen 公司；兔抗鼠酪氨酸羥化酶（tyrosine hydroxylase，TH）、Nrf2、HO-1 購自美國 CST 公司；B 細(xì)胞淋巴瘤 2（Bcl2）、Bcl2 相關(guān) X 蛋白（Bcl2 associated X protein，Bax）、HRP 標(biāo)記羊抗鼠免疫球蛋白 G（IgG）單克隆抗體購自美國 R & D 公司；電泳儀、電泳槽、凝膠成像儀為美國 Bio-Rad 公司產(chǎn)品；光學(xué)顯微鏡、透射電鏡為日本 Olmpus 公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 帕金森病大鼠模型制備 大鼠腹腔注射 400 mg/kg 10% 水合氯醛麻醉后，仰臥固定于大鼠腦立體定位儀，依據(jù)文獻(xiàn)[5]中的大鼠腦立體定位圖譜，確定腦部黑質(zhì)坐標(biāo)點，右側(cè)黑質(zhì)致密部：硬膜下方 7.5 mm，矢狀線右 1.5 mm，前鹵后方 5 mm；前腦內(nèi)側(cè)束：硬膜下方 7.7 mm，矢狀線右 2.3 mm，前鹵后方 1.4 mm。于各坐標(biāo)點用注射器注射 4 g/L 的 6-OHDA（含 0.02% 抗壞血酸生理鹽水），注射速率控制在 1 μl/min，注射體積 1.0 μl，結(jié)束后留針 5 min，緩慢退針縫合傷口。假手術(shù)組（control）大鼠，選取相同坐標(biāo)點，注射等體積含 0.02% 抗壞血酸生理鹽水，操作方法同模型制備。術(shù)后 2 周，腹腔注射阿普嗎啡（0.5 mg/ml），10 min 后觀察大鼠在 30 min 內(nèi)旋轉(zhuǎn)圈數(shù)即逆時針方向 旋轉(zhuǎn)圈數(shù)與順時針方向旋轉(zhuǎn)圈數(shù)，旋轉(zhuǎn)圈數(shù)超過 100 圈，則視為模型制備成功[6]，排除死亡、感染大鼠，模型制備成功大鼠共 36 只，control 組大鼠 12 只。

1.2.2 帕金森病細(xì)胞模型制備 參考文獻(xiàn)[7]制備帕金森病細(xì)胞模型，取對數(shù)期 SH-SY5Y 細(xì)胞，消化后密度調(diào)整為 5 × 106個/ml，接種 100 μl 于 96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，培養(yǎng) 24 h 后，添加 50 μmol/L 6-OHDA 干預(yù)細(xì)胞 24 h 制備 PD 細(xì)胞模型。

1.2.3 動物及細(xì)胞分組 將大鼠分為 control 組、PD 組、Nrf2 激活劑（Hesperin）組、Nrf2 抑制劑（Brusatol）組，每組 12 只。Hesperin 組：PD 模型制備后，于腹腔注射 10 mg/kg Hesperin，每天 1 次，連續(xù)一周；Brusatol 組：PD 模型制備后，于腹腔注射 2 mg/kg Brusatol，每天 1 次，連續(xù) 一周；control 組、PD 組均連續(xù)一周注射等量生理鹽水。

將細(xì)胞分為 control 組、PD 組、Nrf2 激活劑（Hesperin）組、Nrf2 抑制劑（Brusatol）組。Control 組細(xì)胞不進(jìn)行任何處理，Hesperin 組：6-OHDA 干預(yù)細(xì)胞 24 h 后添加 0.5 μg/ml Hesperin；Brusatol：6-OHDA 干預(yù)細(xì)胞 24 h 后添加 0.2 μg/ml Brusatol。

1.2.4 觀察指標(biāo)與檢測方法

1.2.4.1 大鼠行為學(xué)評估 末次處理后，進(jìn)行 APO 轉(zhuǎn)誘導(dǎo)實驗，統(tǒng)計 30 min 內(nèi)大鼠旋轉(zhuǎn)圈數(shù)，計算平均旋轉(zhuǎn)圈數(shù)。將大鼠置于轉(zhuǎn)棒上，啟動轉(zhuǎn)棒計時，逐漸加大轉(zhuǎn)速，統(tǒng)計觀察大鼠從轉(zhuǎn)棒上掉落的時間。末次處理后，統(tǒng)計 30 min 內(nèi)各組 PD 大鼠對側(cè)旋轉(zhuǎn)圈數(shù)，并評估異常不自主評分（AIM）[8]。1.2.4.2 標(biāo)本采集 各組大鼠麻醉后斷頭取腦，分離腦黑質(zhì)部位，將一部分組織置于 4% 聚甲醛溶液中固定以制備組織石蠟切片，一部分組織凍存于 -80 ℃。

1.2.4.3 免疫組化檢測腦組織黑質(zhì)中 TH 陽性表達(dá)情況 常規(guī)制備腦組織黑質(zhì)部石蠟切片，添加 3% H2O2溶液解除內(nèi)源性過氧化物酶活，清洗后 添加檸檬酸鈉行抗原修復(fù)，封閉后添加 TH 一抗 4 ℃ 中孵育過夜，清洗后添加二抗，PBS 清洗后進(jìn)行 DAB 顯色，清洗后行蘇木素復(fù)染，脫水、透明處理后滴加中性樹脂封片，置于顯微鏡下觀察腦組織黑質(zhì)中 TH 陽性表達(dá)情況，計算陽性染色細(xì)胞率（%）= TH 陽性/細(xì)胞總數(shù) × 100%。

1.2.4.4 SOD、MDA、GSH-Px、CAT 活性檢 測 取出保存腦組織黑質(zhì)部位添加生理鹽水后置于電動勻漿機制備組織勻漿，離心后保留上清，參照試劑盒說明書進(jìn)行操作，采用氮藍(lán)四唑光還原法檢測 SOD 水平，硫代巴比妥酸法檢測 MDA 水平，比色法檢測 GSH-Px 水平，采用雙抗體夾心法檢測 CAT 水平。

1.2.4.5 透射電子顯微鏡觀察神經(jīng)元超微結(jié) 構(gòu) 取出保存腦組織黑質(zhì)部位，添加 2.5% 戊二醛，置于 4 ℃ 固定 3 h，添加 1% 鋨酸溶液中 4 ℃ 固定 2 h。經(jīng)梯度乙醇脫水后，采用環(huán)氧樹脂包埋，用超薄切片機切割為 50 nm 超薄切片，經(jīng)醋酸鈾、檸檬酸鉛染色后，置于透射電子顯微鏡觀察神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)變化。

1.2.4.6 Western blot 檢測組織中 Nrf2、HO-1、Bcl2、caspase3、Bax 蛋白表達(dá) 取出保存組織，加入細(xì)胞裂解液，冰上勻漿后，12 000 ×g離心后收集上清，抽提蛋白，BCA 法測定蛋白濃度后，行 SDS-PAGE 電泳，轉(zhuǎn)膜后添加 5% 脫脂牛奶封閉，添加 Nrf2、HO-1、Bcl2、caspase3、Bax 一抗，4 ℃ 孵育過夜后，添加二抗室溫下孵育 1 h，ECL 發(fā)光顯影后，置于蛋白凝膠儀中觀察蛋白表達(dá)，以 β-actin 作為內(nèi)參，ImageJ 軟件定量各蛋白表達(dá)。

1.2.4.7 MTT 法檢測 SH-SY5Y 細(xì)胞增殖情況 各組細(xì)胞處理后繼續(xù)培養(yǎng) 24、48、36、72 h，添加 MTT 溶液，避光孵育 4 h，添加 DMSO 溶液，振蕩培養(yǎng) 15 min，在酶標(biāo)儀上 490 nm 波長下測定各組吸光值（OD）。細(xì)胞增殖抑制率（%）=（OD實驗組-ODcontrol組）/ODcontrol組× 100%。

1.2.4.8 流式細(xì)胞術(shù)檢測 SH-SY5Y 細(xì)胞凋亡情況 收集各組細(xì)胞，添加 PBS 洗滌細(xì)胞消化液后制備單細(xì)胞懸液，添加 5 μl Annexin V-FITC 染液避光孵育 20 min，加入 5 μl PI 混勻后冰上避光孵 育 10 min，置于流式細(xì)胞儀中檢測細(xì)胞凋亡情況。1.2.4.9 SH-SY5Y 細(xì)胞中 Nrf2、HO-1、Bcl2、caspase3、Bax 蛋白表達(dá) 細(xì)胞各組處理后，繼續(xù)培養(yǎng) 24 h，收集細(xì)胞后，添加裂解液后抽提細(xì)胞總蛋白，后續(xù)操作同方法 1.2.4.6。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用統(tǒng)計學(xué)軟件 SPSS 22.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計量資料以±s描述，兩組間比較行t檢驗，多組間比較行單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用 snk-q 檢驗，當(dāng)P＜ 0.05 時，則差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠神經(jīng)行為學(xué)評估結(jié)果比較

與 control 組相比，PD 組 APO 誘導(dǎo)圈數(shù)、AIM 評分均升高，轉(zhuǎn)棒滯留時間縮短，差異具有顯著性（P＜ 0.05）；與 PD 組相比，Hesperin 組 APO 誘導(dǎo)圈數(shù)、AIM 評分均降低，轉(zhuǎn)棒滯留時間增長，Brusatol 組 APO 誘導(dǎo)圈數(shù)升高，轉(zhuǎn)棒滯留時間縮短，差異均具有顯著性（P＜ 0.05）（表1）。

2.2 各組腦組織黑質(zhì)區(qū)神經(jīng)元數(shù)量比較

與 control 組相比，PD 組腦組織黑質(zhì)區(qū) TH 神經(jīng)元比例降低，差異具有顯著性（P＜ 0.05）；與 PD 組相比，Hesperin 組腦組織黑質(zhì)區(qū) TH 神經(jīng)元比例升高，Brusatol 組腦組織黑質(zhì)區(qū) TH 神經(jīng)元比例降低，差異均具有顯著性（P＜ 0.05）（圖1和 表2）。

表1 各組大鼠 APO 誘導(dǎo)圈數(shù)、轉(zhuǎn)棒滯留時間比較(±s) Table 1 Comparison of APO induction circles and rotation time of rod in each group (± s)

表1 各組大鼠 APO 誘導(dǎo)圈數(shù)、轉(zhuǎn)棒滯留時間比較(±s) Table 1 Comparison of APO induction circles and rotation time of rod in each group (± s)

注：與 control 組相比，*P ＜ 0.05；與 PD 組相比，#P ＜ 0.05。Notes：*P ＜ 0.05 compared with control group; #P ＜ 0.05 compared with PD group.

組別 Groups APO 誘導(dǎo)圈數(shù)（圈/30 min） Number of APO induction cycles (cycles/30 min) 轉(zhuǎn)棒滯留時間（s） Retention time of rotating rod (s) AIM 評分 AIM Score Control 組 Control group 1.24 ± 0.15 67.38 ± 8.29 19.12 ± 4.46 PD 組 PD group 80.73 ± 6.59* 41.52 ± 7.18* 30.24 ± 5.21* Hesperin 組 Hesperin group 47.44 ± 4.59*# 54.16 ± 6.75*# 26.47 ± 1.20*# Brusatol 組 Brusatol group 96.17 ± 7.04*# 33.24 ± 3.16*# 46.52 ± 3.06*#

圖1 免疫組化檢測各組神經(jīng)元數(shù)量變化情況（40 ×） Figure 1 Changes in the number of neurons in each group detected by immunohistochemistry (40 ×)

表2 各組大鼠腦組織黑質(zhì)區(qū)神經(jīng)元數(shù)量比較（± s） Table 2 Comparison of the number of neurons in the substantia nigra of brain tissue of each group (± s)

表2 各組大鼠腦組織黑質(zhì)區(qū)神經(jīng)元數(shù)量比較（± s） Table 2 Comparison of the number of neurons in the substantia nigra of brain tissue of each group (± s)

注：與 control 組相比，*P ＜ 0.05；與 PD 組相比，#P ＜ 0.05。Notes：*P ＜ 0.05 compared with control group; #P ＜ 0.05 compared with PD group.

組別 Groups TH 標(biāo)記神經(jīng)元比例（%） TH labeled neurons (%) Control 組 Control group 44.64 ± 0.29 PD 組 PD group 22.34 ± 2.35* Hesperin 組 Hesperin group 36.73 ± 2.32*# Brusatol 組 Brusatol group 15.35 ± 1.48*#

2.3 各組腦組織黑質(zhì)區(qū)神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)變化情況

Control 組神經(jīng)元細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞核形態(tài)結(jié)構(gòu)正常；PD 組細(xì)胞核皺縮，核內(nèi)異染色質(zhì)變多呈小塊狀分布；Hesperin 組細(xì)胞核皺縮以及染色質(zhì)聚集情況有所改善；Brusatol 組細(xì)胞核嚴(yán)重皺縮、呈凋亡樣（圖2）。

2.4 腦組織黑質(zhì)區(qū) SOD、MDA、GSH-Px、CAT 水平 比較

與 control 組相比，PD 組 SOD、GSH-Px、CAT 水平降低，MDA 水平升高，差異具有顯著性（P＜ 0.05）；與 PD 組相比，Hesperin 組 SOD、GSH-Px、CAT 水平升高，MDA 水平降低，Brusatol 組 SOD、GSH-Px、CAT 水平降低，MDA 水平升高，差異均具有顯著性（P＜ 0.05）（表3）。

2.5 各組黑質(zhì)區(qū)組織中 Nrf2、HO-1、Bcl2、caspase3、Bax 蛋白表達(dá)情況

與 control 組相比，PD 組 Nrf2、HO-1、Bcl2 蛋白表達(dá)降低，caspase3、Bax 蛋白表達(dá)升高，差異具有顯著性（P＜ 0.05）；與 PD 組相比，Hesperin 組 Nrf2、HO-1、Bcl2 蛋白表達(dá)升高，caspase3、Bax 蛋白表達(dá)降低，Brusatol 組 Nrf2、HO-1、Bcl2 蛋白表達(dá)降低，caspase3、Bax 蛋白表達(dá)升高，差異均具有顯著性（P＜ 0.05）（表4）。

圖2 掃描電鏡觀察黑質(zhì)區(qū)細(xì)胞核超微結(jié)構(gòu)（10 000 ×） Figure 2 The ultrastructure of cell nuclei in the substantia nigra by scanning electron microscope (10 000 ×)

表3 各組大鼠 SOD、MDA、GSH-Px、CAT 水平比較（± s） Table 3 Comparison of SOD,MDA,GSH-Px and CAT levels in the rats of each group (± s)

表3 各組大鼠 SOD、MDA、GSH-Px、CAT 水平比較（± s） Table 3 Comparison of SOD,MDA,GSH-Px and CAT levels in the rats of each group (± s)

注：與 control 組相比，*P ＜ 0.05；與 PD 組相比，#P ＜ 0.05。Notes：*P ＜ 0.05 compared with control group; #P ＜ 0.05 compared with PD group.

組別 Groups SOD（μU/L） MDA（μmol/L） GSH-Px（U/L） CAT（U/L） Control 組 Control group 234.26 ± 24.13 3.26 ± 0.48 334.17 ± 27.38 4.26 ± 0.72 PD 組 PD group 141.64 ± 12.18* 5.97 ± 0.69* 268.27 ± 23.09* 2.61 ± 0.42* Hesperin 組 Hesperin group 198.29 ± 11.75*# 4.03 ± 0.64*# 304.26 ± 19.68*# 3.48 ± 0.51*# Brusatol 組 Brusatol group 120.24 ± 12.43*# 6.37 ± 0.59*# 243.72 ± 18.15*# 2.34 ± 0.42*#

表4 各組黑質(zhì)區(qū)組織中 Nrf2、HO-1、Bcl2、caspase3、Bax 蛋白表達(dá)比較（± s） Table 4 Comparison of Nrf2,HO-1,Bcl2,caspase3 and Bax protein expression in the substantia nigra (± s)

表4 各組黑質(zhì)區(qū)組織中 Nrf2、HO-1、Bcl2、caspase3、Bax 蛋白表達(dá)比較（± s） Table 4 Comparison of Nrf2,HO-1,Bcl2,caspase3 and Bax protein expression in the substantia nigra (± s)

注：與 control 組相比，*P ＜ 0.05；與 PD 組相比，#P ＜ 0.05。Notes：*P ＜ 0.05 compared with control group; #P ＜ 0.05 compared with PD group.

組別 Groups Nrf2 HO-1 Bcl2 caspase3 Bax Control 組 Control group 1.25 ± 0.29 1.05 ± 0.23 0.89 ± 0.05 0.18 ± 0.02 0.19 ± 0.03 PD 組 PD group 0.45 ± 0.03* 0.51 ± 0.08* 0.62 ± 0.06* 0.74 ± 0.06* 0.83 ± 0.08* Hesperin 組 Hesperin group 0.81 ± 0.04*# 0.96 ± 0.04*# 0.79 ± 0.05*# 0.42 ± 0.08*# 0.46 ± 0.05*# Brusatol 組 Brusatol group 0.17 ± 0.04*# 0.30 ± 0.06*# 0.40 ± 0.08*# 0.97 ± 0.09*# 0.92 ± 0.07*#

表5 各組細(xì)胞增殖抑制率比較（%，± s） Table 5 Comparison of cell proliferation inhibition rates of each group（%,± s）

表5 各組細(xì)胞增殖抑制率比較（%，± s） Table 5 Comparison of cell proliferation inhibition rates of each group（%,± s）

注：與 control 組相比，*P ＜ 0.05；與 PD 組相比，#P ＜ 0.05。Notes：*P ＜ 0.05 compared with control group; #P ＜ 0.05 compared with PD group.

組別 Groups 24 h 36 h 48 h 72 h Control 組 Control group 0.04 ± 0.01 0.05 ± 0.01 0.05 ± 0.01 0.07 ± 0.02 PD 組 PD group 10.34 ± 1.27* 16.28 ± 1.13* 22.58 ± 3.17* 27.16 ± 4.27* Hesperin 組 Hesperin group 6.07 ± 0.38*# 10.08 ± 1.46*# 12.16 ± 1.34*# 18.57 ± 2.18*# Brusatol 組 Brusatol group 14.68 ± 1.53*# 22.47 ± 2.18*# 27.17 ± 2.36*# 32.45 ± 3.66*#

圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡情況 Figure 3 Cell apoptosis analysis by flow cytometry

2.6 各組細(xì)胞增殖抑制率比較

與 control 組相比，PD 組細(xì)胞增殖抑制率升高，差異具有顯著性（P＜ 0.05）；與PD 組相比，Hesperin 組細(xì)胞增殖抑制率降低，Brusatol 組細(xì)胞增殖抑制率升高，差異均具有顯著性（P＜ 0.05） （表5）。

2.7 各組細(xì)胞凋亡情況比較

與 control 組相比，PD 組細(xì)胞凋亡率升高，差異具有顯著性（P＜ 0.05）；與 PD 組相比，Hesperin 組細(xì)胞凋亡率降低，Brusatol 組細(xì)胞凋亡率升高，差異均具有顯著性（P＜ 0.05）（圖3和 表6）。

2.8 各組細(xì)胞中 Nrf2、HO-1、Bcl2、caspase3、Bax 蛋白表達(dá)情況

與 control 組相比，PD 組細(xì)胞 Nrf2、HO-1、Bcl2 蛋白表達(dá)降低，caspase3、Bax 蛋白表達(dá)升高，差異具有顯著性（P＜ 0.05）；與 PD 組相比，Hesperin 組細(xì)胞中 Nrf2、HO-1、Bcl2 蛋白表達(dá)升高，caspase3、Bax 蛋白表達(dá)降低，Brusatol 組細(xì)胞中 Nrf2、HO-1、Bcl2 蛋白表達(dá)降低，caspase3、Bax 蛋白表達(dá)升高，差異均具有顯著性（P＜ 0.05）（表7）。

表6 各組細(xì)胞凋亡率比較（± s） Table 6 Comparison of apoptosis rates of each group (± s)

表6 各組細(xì)胞凋亡率比較（± s） Table 6 Comparison of apoptosis rates of each group (± s)

注：與 control 組相比，*P ＜ 0.05；與 PD 組相比，#P ＜ 0.05。Notes：*P ＜ 0.05 compared with control group; #P ＜ 0.05 compared with PD group.

組別 Groups 凋亡率（%） Apoptosis rates (%)Control 組 Control group 11.18 ± 1.46 PD 組 PD group 35.26 ± 3.37* Hesperin 組 Hesperin group 19.44 ± 2.69*# Brusatol 組 Brusatol group 44.29 ± 1.46*#

表7 各組細(xì)胞中 Nrf2、HO-1、Bcl2、caspase3、Bax 蛋白表達(dá)比較（± s） Table 7 Comparison of intracellular Nrf2,HO-1,Bcl2,caspase3 and Bax protein expression in each group (± s)

表7 各組細(xì)胞中 Nrf2、HO-1、Bcl2、caspase3、Bax 蛋白表達(dá)比較（± s） Table 7 Comparison of intracellular Nrf2,HO-1,Bcl2,caspase3 and Bax protein expression in each group (± s)

注：與 control 組相比，*P ＜ 0.05；與 PD 組相比，#P ＜ 0.05。Notes：*P ＜ 0.05 compared with control group; #P ＜ 0.05 compared with PD group.

組別 Groups Nrf2 HO-1 Bcl2 caspase3 Bax Control 組 Control group 1.08 ± 0.27 1.12 ± 0.16 0.97 ± 0.14 0.18 ± 5.29 0.23 ± 0.04 PD 組 PD group 0.52 ± 0.08* 0.76 ± 0.09* 0.43 ± 0.09* 0.84 ± 0.13* 0.89 ± 0.14* Hesperin 組 Hesperin group 0.76 ± 0.07*# 0.93 ± 0.17*# 0.58 ± 0.07*# 0.56 ± 0.08*# 0.43 ± 0.08*# Brusatol 組 Brusatol group 0.34 ± 0.06*# 0.52 ± 0.07*# 0.22 ± 0.04*# 1.07 ± 0.34*# 1.05 ± 0.25*#

3 討論

PD 病理特征主要為腦黑質(zhì)部多巴胺神經(jīng)元變性、壞死、丟失，導(dǎo)致腦部紋狀體多巴胺減少，進(jìn)而導(dǎo)致神經(jīng)損傷[9]。6-OHDA 為 PD 動物模型與細(xì)胞模型常用誘導(dǎo)劑，6-OHDA 注射腦部紋狀體能夠損傷腦黑質(zhì)部神經(jīng)元，可模擬 PD 早期臨床表現(xiàn)。本研究通過制備 PD 大鼠及細(xì)胞模型，發(fā)現(xiàn) PD 模型大鼠 APO 誘導(dǎo)圈數(shù)、AIM 評分均升高，轉(zhuǎn)棒滯留時間縮短，腦組織黑質(zhì)區(qū) TH 神經(jīng)元比例降低，電鏡檢測發(fā)現(xiàn)細(xì)胞核皺縮，細(xì)胞呈凋亡狀，同樣 PD 模型細(xì)胞增殖活性明顯降低，與過往 PD 大鼠（細(xì)胞）模型研究結(jié)果相似[10]，提示 6-OHDA 誘導(dǎo) PD 大鼠（細(xì)胞）模型成功。

氧化應(yīng)激反應(yīng)為 PD 發(fā)病中重要的病理機制，研究顯示在神經(jīng)元丟失的早期氧化應(yīng)激水平升 高[11]。Arenas[12]研究發(fā)現(xiàn)，PD 大鼠中降低氧化應(yīng)激水平可以降低膠質(zhì)細(xì)胞活化程度，緩解神經(jīng)損傷。研究證實 PD 大鼠腦組織處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，其中 SOD、GSH-Px、CAT 等抗氧化因子功能異常，造成氧化應(yīng)激反應(yīng)升高，氧自由基水平升高，MDA 水平升高，且氧化應(yīng)激損傷會導(dǎo)致多巴胺能神經(jīng)元損傷，進(jìn)而損傷大鼠神經(jīng)功能[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，與 control 組相比，SOD、GSH-Px、CAT 水平降低，MDA 水平升高，表明 PD 大鼠腦黑質(zhì)中氧化水平升高，抗氧化能力降低，提示 PD 大鼠腦黑質(zhì)存在氧化應(yīng)激損傷，推測氧化應(yīng)激損傷可能會導(dǎo)致神經(jīng)元受損，影響大鼠神經(jīng)行為學(xué)。過往研究顯示氧化應(yīng)激與細(xì)胞凋亡密切有關(guān)，過氧化氫可誘導(dǎo)大鼠腦皮質(zhì)區(qū)神經(jīng)元發(fā)生氧化應(yīng)激凋亡，進(jìn)而損傷神經(jīng)功能[14]。本研究經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果分析 PD 細(xì)胞發(fā)生明顯凋亡，提示 PD 大鼠腦黑質(zhì)區(qū)神經(jīng)元凋亡，這可能是由于氧化應(yīng)激損傷導(dǎo)致。

Nrf2 為細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子，一般與 Keap1 結(jié)合存在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，當(dāng)受到氧化應(yīng)激刺激后，Nrf2 與 Keap1 解離，移位到細(xì)胞核中與 ARE 蛋白結(jié)合調(diào)控下游 HO-1 等抗氧化酶，發(fā)揮抗氧化作用。Nrf2/HO-1 與神經(jīng)元抗氧化損傷有關(guān)，過往研究顯示過表達(dá) Nrf2 后可避免神經(jīng)細(xì)胞受 6-OHDA 導(dǎo)致的氧化應(yīng)激損傷[15]。在 Nrf2 缺陷小鼠中發(fā)現(xiàn)小鼠腦黑質(zhì)區(qū)神經(jīng)元凋亡明顯增加，小膠質(zhì)細(xì)胞活化程度升高，HO-1 水平顯著降低[16]。在 PD 體內(nèi)、體外研究中均發(fā)現(xiàn)，上調(diào) HO-1 表達(dá)，則能夠修復(fù) 神經(jīng)系統(tǒng)氧化應(yīng)激以及炎癥損傷[17]。在 MPTP 誘導(dǎo) PD 小鼠中發(fā)現(xiàn)上調(diào) Nrf2，可使黑質(zhì)區(qū) HO-1 蛋白表達(dá)明顯升高，神經(jīng)元死亡數(shù)量降低，具有神經(jīng)保護作用[18]。本研究體內(nèi)體外實驗均顯示 PD 模型中 Nrf2、HO-1 蛋白表達(dá)降低，經(jīng) Nrf2 激活劑 Hesperin 干預(yù)后 Nrf2、HO-1 蛋白表達(dá)升高，經(jīng)抑制劑 Brusatol 干預(yù)后 Nrf2、HO-1 蛋白表達(dá)則進(jìn)一步降低，提示 Nrf2/HO-1 通路可能與 PD 的發(fā)生相關(guān)，激活 Nrf2/HO-1 通路能夠發(fā)揮抗神經(jīng)元氧化應(yīng)激損傷，緩解大鼠神經(jīng)細(xì)胞損傷。

細(xì)胞凋亡時涉及到凋亡因子以及抗凋亡因子，是多種蛋白共同參與的結(jié)果，其中抑凋亡成員 Bcl2 以及凋亡成員 Bax 在細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮重要作用。一般 Bcl2 與 Bax 在線粒體以二聚體形式存在以阻礙細(xì)胞凋亡；當(dāng)遭受外界損傷后，Bax 水平升高，導(dǎo)致線粒體膜聚集大量 Bcl2/Bax 二聚體，造成線粒體膜通透性升高，使凋亡有關(guān)因子進(jìn)入細(xì)胞中，激活 caspase 通路發(fā)生級聯(lián)反應(yīng)加速細(xì)胞凋亡。趙靜宇等[19]研究顯示激活 Nrf2 通路后，可減輕神經(jīng)細(xì)胞的凋亡。此外激活 Nrf2 通路，可上調(diào)下游 HO-1 等抗氧化酶酶活，緩解大鼠海馬神經(jīng)損傷[20]。本研究顯示 PD 模型大鼠 Bcl2 蛋白表達(dá)降低，caspase3、Bax 蛋白表達(dá)升高，經(jīng) Nrf2 激活劑 Hesperin 干預(yù)后 Bcl2 表達(dá)升高，caspase3、Bax 蛋白表達(dá)降低；經(jīng)抑制劑 Brusatol 干預(yù)后 Bcl2 蛋白表達(dá)進(jìn)一步降低，caspase3、Bax 蛋白進(jìn)一步表達(dá)升高，提示 Nrf2/HO-1 通路抑制后會加重神經(jīng)元凋亡，而激活后則可減輕神經(jīng)細(xì)胞凋亡，推測 Nrf2/HO-1 通路可通過調(diào)控 caspase3 凋亡通路進(jìn)而減輕神經(jīng)細(xì)胞損傷。

綜上所述，Nrf2/HO-1 通路可能參與 PD 的發(fā)生、發(fā)展，激活該通路后能夠減輕腦組織氧化應(yīng)激水平，降低神經(jīng)元細(xì)胞凋亡，進(jìn)而發(fā)揮對 PD 大鼠的神經(jīng)保護作用。然而本研究僅對 Nrf2/HO-1 通路與 PD 的關(guān)系進(jìn)行初步探究，并未對該通路下游調(diào)控基因進(jìn)行研究，有待后續(xù)深入探究。