陶元平，王麗萍，楊遠(yuǎn)，黃智平，倪俊聲，周偉平

肝細(xì)胞癌（HCC）是世界范圍內(nèi)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，尤其是在中國(guó)[1]。但由于其發(fā)病過(guò)程復(fù)雜，目前其發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚。肝癌的臨床治療效果非常有限，手術(shù)仍是最常用的治療方法。然而，低治愈率和手術(shù)后高復(fù)發(fā)率降低了手術(shù)的療效[2-3]。因此，迫切需要進(jìn)一步研究肝細(xì)胞癌的發(fā)病機(jī)制和發(fā)現(xiàn)潛在的治療靶點(diǎn)以期實(shí)現(xiàn)對(duì)肝細(xì)胞癌的個(gè)體化靶向治療。

microRNAs（miRNAs）是一類(lèi)在真核生物中廣泛存在的長(zhǎng)度為 20～22 個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼 RNA。這些分子大約占整個(gè)人類(lèi)基因組的 1%，在各種組織中廣泛表達(dá)[4]。miRNAs 可以直接靶向靶基因的 3'-非翻譯區(qū)（UTR），從而抑制這些基因的翻譯或誘導(dǎo)降解。研究證實(shí) miRNAs 在包括細(xì)胞增殖、分化、凋亡和遷移在內(nèi)的多種重要的生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。因此 miRNAs 在腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展中扮演重要角色，并可能作為潛在的治療靶點(diǎn)[5-8]。目前已經(jīng)證實(shí) miR-361[5]、miR-122[9]和 miR-199[10]等異常表達(dá)的 miRNAs 參與了肝癌的發(fā)生和進(jìn)展。最新的研究證實(shí)，miR-1297 與多種癌癥聯(lián)系緊密，包括胃癌[11]和胰腺癌[12]。本研究證實(shí) miR-1297 在肝癌組織中的高表達(dá)與患者的不良預(yù)后顯著相關(guān)，并重點(diǎn)關(guān)注了 miR-1297 在肝細(xì)胞癌發(fā)展過(guò)程中的作用以及相應(yīng)的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣本 109 對(duì) HCC 組織和其匹配的癌旁組織來(lái)自 2013年1月- 2015年12月海軍軍醫(yī)大學(xué)附屬東方肝膽外科醫(yī)院進(jìn)行根治手術(shù)的肝細(xì)胞癌患者。癌旁組織距離癌灶邊緣超過(guò) 5 cm。標(biāo)本和相應(yīng)的鄰近組織來(lái)自同一肝癌患者。由本院擁有 5年以上經(jīng)驗(yàn)的病理醫(yī)師檢查每個(gè)組織樣本 并確認(rèn)組織類(lèi)型。術(shù)后腫瘤組織立即凍存于 -80 ℃ 液氮中以備后用?；颊咴谑中g(shù)前沒(méi)有接受任何治療。本研究經(jīng)海軍軍醫(yī)大學(xué)附屬東方肝膽外科醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)且所有患者均簽署知情同意書(shū)。

1.1.2 細(xì)胞系 人肝細(xì)胞癌細(xì)胞系 SMMC-7721 和 HepG2、人肝細(xì)胞系 QSG-7701 和 HEK293 購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。

1.1.3 試劑 胎牛血清購(gòu)自美國(guó) Gibco 公司；DMEM 培養(yǎng)基和 lip2000 購(gòu)自美國(guó) Invitrogen 公司；miR-1297 陰性對(duì)照、抑制劑或模擬物購(gòu)自廣州市銳博生物科技有限公司；報(bào)告基因購(gòu)自上海吉馬生物制藥有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞系培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 將 SMMC-7721、HepG2、QSG-7701 和 HEK293 細(xì)胞培養(yǎng)在含 10% 胎牛血清的 DMEM 培養(yǎng)基中，在 37 ℃ 置于 5% CO2中。將 2.5 × 105SMMC-7721 或 HepG2 細(xì)胞接種于 6 孔板中培養(yǎng)過(guò)夜，然后用 50 nmol/L miR-1297 陰性對(duì)照、抑制劑或模擬物根據(jù)產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)，使用 lip2000 進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

1.2.2 qRT-PCR 檢測(cè) 具體實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程依照參考文獻(xiàn)[13]，U6 為內(nèi)參基因。用 2-ΔΔCT方法分析 miR-1297 的相對(duì)表達(dá)情況。

1.2.3 細(xì)胞增殖和凋亡實(shí)驗(yàn) 具體實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程依照參考文獻(xiàn)[13]。

1.2.4 雙熒光素酶報(bào)告基因分析 具體實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程依照參考文獻(xiàn)[13]和試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.5 蛋白質(zhì)印跡分析 具體實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程依照參考文獻(xiàn)[13]。所用抗體 BID（ab32060）、Anti-Bid Cleavage Site（ab108293）、cytochrome C（ab13575）和 gapdh（ab8245）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用 SPSS 18.0 版進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。Kaplan-Meier 生存分析法用于肝細(xì)胞癌患者的生存資料分析，并用對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。t檢驗(yàn)來(lái)比較兩組的數(shù)據(jù)，當(dāng)P＜ 0.05 時(shí)，認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-1297 在肝細(xì)胞癌中顯著上調(diào)表達(dá)

為了研究 miR-1297 在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)情況，通過(guò) qRT-PCR 分析了 109 對(duì)肝癌組織和匹配的癌旁組織中 miR-1297 的表達(dá)水平，結(jié)果提示其在肝細(xì)胞癌中顯著上調(diào)表達(dá)（圖1A）。qRT-PCR 結(jié) 果證實(shí)，相對(duì)于肝細(xì)胞系 QSG-7701，miR-1297 在肝癌細(xì)胞系 SMMC-7721 和 HepG2 中的表達(dá)也明顯上調(diào)（圖1B）。為了評(píng)估 miR-1297 表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系，將 109 例肝細(xì)胞癌患者的組織樣本按照 miR-1297 的中位表達(dá)分為高/低兩組。生存曲線(xiàn)顯示，在肝細(xì)胞癌組織中 miR-1297 的高表達(dá)與患者不良預(yù)后顯著相關(guān)（圖1C 和 1D）。

2.2 抑制 miR-1297 降低肝癌細(xì)胞增殖能力

研究了 miR-1297 在肝細(xì)胞癌進(jìn)展中的潛在作用。首先將 miR-1297 抑制劑轉(zhuǎn)染至肝癌細(xì)胞系 SMMC-7721 和 HepG2 中，通過(guò) qRT-PCR 證實(shí) miR-1297 在轉(zhuǎn)染后的肝癌細(xì)胞系中顯著下調(diào)表達(dá)（圖2A）。細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)證實(shí)降低 miR-1297 表達(dá)可以顯著抑制肝細(xì)胞癌細(xì)胞的增殖能力（圖2B）。以上結(jié)果提示 miR-1297 在體外可以增強(qiáng)肝細(xì)胞癌細(xì)胞的增殖能力。

2.3 抑制 miR-1297 促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡

本研究還檢測(cè)了 miR-1297 在調(diào)節(jié)肝癌細(xì)胞凋亡中的作用，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)抑制miR-1297 的表達(dá)可促進(jìn)肝癌細(xì)胞的凋亡（圖2C）。以上數(shù)據(jù)表明在肝細(xì)胞癌中高表達(dá)的 miR-1297 可抑制肝癌細(xì)胞凋亡。

2.4 miR-1297 直接靶向 BID

為了探索 miR-1297 促進(jìn)肝癌細(xì)胞進(jìn)展的分子學(xué)機(jī)制，利用在線(xiàn)軟件 TargetScan 7.2 預(yù)測(cè) miR-1297 的潛在結(jié)合靶點(diǎn)。在被預(yù)測(cè)的所有靶基因中，發(fā)現(xiàn) BH3 結(jié)構(gòu)域凋亡誘導(dǎo)蛋白（BH3 interacting domain death agonist，BID）（Bcl2 家族成員）與細(xì)胞凋亡的關(guān)系最為密切（圖3A）。首先構(gòu)建了包含 BID 的 3'-UTR 區(qū)的雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)通過(guò)與 miR-1297 模擬物共轉(zhuǎn)染后熒光素酶活性顯著降低，然而在 3'-UTR 中含有突變潛在靶位點(diǎn)的熒光素酶活性無(wú)變化（圖3B）。此外，Western blot 實(shí)驗(yàn)證實(shí)在 HepG2 和 SMMC-7721 細(xì)胞中抑制 miR-1297 可提高 BID 的蛋白表達(dá)水平（圖3C）。

以往研究證實(shí) BID 可通過(guò) tBID-線(xiàn)粒體途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[14]。因此，接下來(lái)研究了 miR-1297 在肝細(xì)胞癌細(xì)胞中對(duì)相關(guān)信號(hào)通路的影響。Western blot 實(shí)驗(yàn)證實(shí)抑制 miR-1297 表達(dá)顯著提高了線(xiàn)粒體中 tBID 和細(xì)胞色素 C 的表達(dá)水平（圖3D）。以上結(jié)果提示，miR-1297 可通過(guò) tBID 線(xiàn)粒體凋亡途徑抑制肝癌細(xì)胞的凋亡。

圖1 miR-1297 在肝癌組織和細(xì)胞系中上調(diào)（A：qRT-PCR 檢測(cè) 109 對(duì)肝癌組織和匹配的癌旁正常組織中 miR-1297 的表達(dá)水平；B：qRT-PCR 檢測(cè) miR-1297 在永生化正常肝細(xì)胞系 QSG-7701 和肝癌細(xì)胞系 SMMC-7721 和 HepG2 中的表達(dá)水平；C：Kaplan-Meier 生存曲線(xiàn)分析 miR-1297 表達(dá)水平與無(wú)復(fù)發(fā)生存率之間的關(guān)系；D：Kaplan-Meier 生存曲線(xiàn)分析 miR-1297 表達(dá)水平與總體生存率之間的關(guān)系；**P ＜ 0.01 和 ***P ＜ 0.001） Figure 1 miR-1297 is up-regulated in HCC tissue and cell lines (A：qRT-PCR analysis of miR-1297 expression levels in 109 pairs of HCC tissues and matched nontumor tissues; B：Relative expression of miR-1297 in the immortalized normal hepatic cell line QSG-7701 and HCC cell lines SMMC-7721 and HepG2 was detected by qRT-PCR; C：Kaplan-Meier survival curves showing the relationship between high or low miR-1297 expression levels with the overall survival of HCC patients; D：Kaplan-Meier survival curves showing the relationship between high or low miR-1297 expression levels with the recurrence free survival of HCC patients;**P ＜ 0.01 and ***P ＜ 0.001)

2.5 BID 是 miR-1297 介導(dǎo)的抑制細(xì)胞凋亡的 原因

為了進(jìn)一步闡明 BID 在 miR-1297 介導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡中的作用，我們用 Bcl2 抑制劑 ABT-199 處理了 SMMC-7721 和 HepG2 細(xì)胞。發(fā)現(xiàn)在 SMMC-7721 和 HepG2 細(xì)胞中，ABT-199 對(duì) miR-1297 的表達(dá)沒(méi)有任何影響（圖4A），而加入 ABT-199 后抵消了降低 miR-1297 表達(dá)對(duì)肝癌凋亡的抑制作用（圖4B）。這些結(jié)果表明 miR-1297 主要通過(guò)靶向 BID 蛋白發(fā)揮其抑制凋亡的生物學(xué)功能。

3 討論

以前的研究表明，miRNAs 在肝細(xì)胞癌的發(fā)生和發(fā)展中起著重要作用[11,15-17]，并且可以用作診斷或預(yù)后標(biāo)志物。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn) miR-1297 在肝癌組織中顯著上調(diào)表達(dá)，并且 miR-1297 的高表達(dá)預(yù)示著肝癌患者術(shù)后的預(yù)后不良。本研究表明 miR-1297 可能是一個(gè)潛在的預(yù)測(cè)肝細(xì)胞癌患者手術(shù)預(yù)后臨床標(biāo)志物和治療的分子靶點(diǎn)。

圖2 抑制 miR-1297 促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡并降低增殖能力（A：qRT-PCR 檢測(cè) miR-1297 抑制劑或?qū)φ辙D(zhuǎn)染至 SMMC-7721 和 HepG2 細(xì)胞后 miR-1297 的表達(dá)；B：用 CCK8 法評(píng)估 miR-1297 抑制劑或 miR-NC 轉(zhuǎn)染的 SMMC-7721 細(xì)胞和 HepG2 細(xì)胞的增殖能力；C 用流式細(xì)胞儀檢測(cè) miR-1297 抑制劑或 miR-NC 轉(zhuǎn)染的 SMMC-7721 細(xì)胞和 HepG2 細(xì)胞的凋亡率；*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01 和 ***P ＜ 0.001） Figure 2 Inhibition of miR-1297 promotes HCC apoptosis and reduces proliferation (A：Relative expression of miR-1297 in SMMC-7721 and HepG2 cells transfected with 80 nmol/L miR-1297 inhibitor or control; B：Estimation of cell proliferation in SMMC-7721 and HepG2 cells transfected with control or miR-1297 inhibitor by CCK8 assays; C：Rate of apoptosis of SMMC-7721 and HepG2 cells transfected with miR-1297 inhibitor or miR-NC was detected by FACS; *P ＜ 0.05,**P ＜ 0.01 and ***P ＜ 0.001)

BID 蛋白與線(xiàn)粒體途徑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡有關(guān)，能夠有效促進(jìn)細(xì)胞凋亡[18]。BID 主要分布在細(xì)胞質(zhì)中，無(wú)促進(jìn)細(xì)胞凋亡的活性。然而，當(dāng) caspase8 被激活時(shí)，BID 蛋白被識(shí)別并裂解成蛋白質(zhì)的激活形式被稱(chēng)為 tBID，并且 tBID 從細(xì)胞質(zhì)被轉(zhuǎn)運(yùn)到外線(xiàn)粒體膜以與 Bcl2 蛋白結(jié)合并抑制其抗凋亡作 用[14,19]或增加線(xiàn)粒體通透性以誘導(dǎo)細(xì)胞色素 C 的釋放，從而激活下游 caspase3 和 caspase9 以促進(jìn)細(xì)胞凋亡。最近發(fā)現(xiàn)，miR-20a 直接靶向 BID 基因，通過(guò) tBID 線(xiàn)粒體途徑誘導(dǎo) TRAIL 耐藥性直腸癌細(xì)胞 SW480 的凋亡。以往研究表明，HepG2 和 SMMC-7721[15-16]細(xì)胞的凋亡是由 tBID 介導(dǎo)的線(xiàn)粒體途徑調(diào)控的，這與本研究的發(fā)現(xiàn)是一致的。本研究通過(guò)一系列實(shí)驗(yàn)證實(shí)發(fā)現(xiàn)，miR-1297 可以通過(guò)抑制 tBID-線(xiàn)粒體凋亡途徑抑制細(xì)胞凋亡，為 BID 對(duì)細(xì)胞凋亡的調(diào)控機(jī)制研究提供了新的思路。

圖3 miR-1297 直接靶向 BID[A：TargetScan 分析顯示 BID 的 3'-UTR 區(qū)段存在 miR-1297 潛在結(jié)合位點(diǎn)，示意圖顯示了 miR-1297 與 BID 結(jié)合的 3'-UTR 野生型（WT）和 BID 3'-UTR 突變體（MUT）；B：過(guò)表達(dá) miR-1297 降低了 BID 3'-UTR WT 熒光素酶活性，而未改變突變的 BID 3'-UTR MUT 中熒光素酶活性；C：Western blot 分析miR-NC 和 miR-1297 抑制劑轉(zhuǎn)染的 SMMC-7721 和 HepG2 細(xì)胞中 BID 的表達(dá)；D：Western blot 分析 miR-NC 或 miR-1297 抑制劑轉(zhuǎn)染的 SMMC-7721 和 HepG2 細(xì)胞系中 tBID 和 cytochrome C 蛋白表達(dá)；***P ＜ 0.001]Figure 3 miR-1297 directly targets BID [A：TargetScan analysis demonstrated the presence of putative miR-1297 targets sites in the 3'-UTR of BID.Schematic showing the putative binding sites of miR-1297 in the 3'-UTR of BID and mutations in the miR-1297 binding sites; B：Relative luciferase activity in BID 3'-UTR wild-type (WT) and BID 3'-UTR mutant (MUT) demonstrated that miR-1297 mimics downregulate luciferase activity from wild-type BID 3'-UTR,but not from mutant BID 3'-UTR; C：Western blot analysis of BID expression in SMMC-7721 and HepG2 cells transfected with miR-NC and miR-1297 inhibitor; D：Western blot analysis of the tBID-mitochondrial pathway in SMMC-7721 and HepG2 cell lines transfected with miR-NC or miR-1297 inhibitor; ***P ＜ 0.001]

圖4 miR-1297 通過(guò) BID 的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控抑制 HCC 細(xì)胞凋亡（A：qRT-PCR 分析在 miR-NC 和 miR-1297 抑制劑轉(zhuǎn)染的 SMMC-7721 和 HepG2 細(xì)胞后用 ABT-199 或 DMSO 處理后 miR-1297 的表達(dá)情況；B：流式細(xì)胞儀檢測(cè)用 A 圖處理后各組細(xì)胞的凋亡率，***P ＜ 0.001） Figure 4 miR-1297 inhibits HCC apoptosis by the post-transcriptional regulation of BID (A：qRT-PCR analysis of miR-1297 expression in SMMC-7721 and HepG2 cells transfected with miR-NC or miR-1297 inhibitor,followed by treatment with ABT-199 or DMSO,as indicated; B：Rate of apoptosis of SMMC-7721 and HepG2 cells transfected with miR-1297 inhibitor or miR-NC and treated with ABT-199 or DMSO was detected by FACS; ***P ＜ 0.001)

研究證實(shí)，miR-1297 通過(guò)靶向不同靶點(diǎn)在多種癌癥中發(fā)揮重要作用，例如：通過(guò)靶向 cyclin D2 抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移能力[17]；靶向 CREB1 抑制胃癌細(xì)胞的增殖[12]；還可靶向異黏蛋白（MTDH）抑制胰腺癌的增殖和轉(zhuǎn)移[12]。MTDH也被稱(chēng)為星形膠質(zhì)細(xì)胞上調(diào)基因-1（AEG-1）蛋白，是一種跨膜蛋白[20]。最近的研究發(fā)現(xiàn)，MTDH 在肝細(xì)胞癌中起著重要作用。Jung 等[21]報(bào)道，高表達(dá)的 MTDH 是肝癌患者術(shù)后總生存率和無(wú)病生存率的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子。Jyoti 等[22]的研究結(jié)果表明，MTDH 可誘導(dǎo)脂肪變性、抑制衰老和激活凝血途徑來(lái)促進(jìn)肝癌的發(fā)生和發(fā)展。Zhou 等[23]報(bào)道 MTDH 可通過(guò)誘導(dǎo)上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程來(lái)促進(jìn)肝癌轉(zhuǎn)移。Li 等[24]報(bào)道敲除 MTDH 后抑制了肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)并誘導(dǎo)其凋亡?；?MTDH 在肝癌的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮著重要作用，我們大膽猜測(cè) miR-1297 也極有可能通過(guò)靶向 MTDH 抑制肝癌的發(fā)展，這將是我們下一步研究的重點(diǎn)方向。

綜上所述，本研究表明，miR-1297 在肝細(xì)胞癌組織中上調(diào)表達(dá)，增強(qiáng)了肝細(xì)胞癌細(xì)胞的增殖能力。一系列的體外分子實(shí)驗(yàn)證實(shí) miR-1297 通過(guò)靶向 BID 和抑制 tBID-線(xiàn)粒體凋亡途徑來(lái)促進(jìn)肝細(xì)胞癌的發(fā)展，表明 miR-1297 可能是一個(gè)新的肝癌治療靶點(diǎn)。