王 平，宋 婧，方翔宇，李 鑫，劉 栩，賈 園，栗占國,2，胡凡磊,2△

(1. 北京大學(xué)人民醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，風(fēng)濕病機(jī)制及免疫診斷北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 北京 100044； 2. 北京大學(xué)藥學(xué)院天然藥物及仿生藥物國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 北京 100191)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種慢性炎癥性自身免疫性疾病，主要累及關(guān)節(jié)部位，是臨床常見的主要致殘性疾病之一[1]。RA的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，遺傳、環(huán)境、微生物等多種因素均參與RA的發(fā)生，多種免疫細(xì)胞參與并介導(dǎo)了RA的發(fā)生和發(fā)展[2]：CD4+T細(xì)胞亞群的失衡參與RA炎癥的發(fā)生和持續(xù)過程[3]；B細(xì)胞過度分化為漿細(xì)胞產(chǎn)生大量自身抗體，參與炎癥的發(fā)生[4]；調(diào)節(jié)性B細(xì)胞功能失調(diào)參與RA發(fā)病[5]；骨髓來源的抑制性細(xì)胞(myeloid-derived suppressor cells，MDSCs)促進(jìn)炎癥反應(yīng)及骨破壞，加重RA病情[6]。

2018年Han等[7]在荷瘤小鼠中發(fā)現(xiàn)了一個新細(xì)胞亞群——成紅細(xì)胞樣Ter-119+細(xì)胞(Ter細(xì)胞)， 研究表明該群細(xì)胞來源于巨核-紅系，主要存在于脾臟中，在肝癌狀態(tài)下數(shù)量明顯增加，并且可通過分泌artemin促進(jìn)肝癌的進(jìn)展。但關(guān)于Ter細(xì)胞在自身免疫病尤其是RA中的作用尚未見報(bào)道。

鑒于Ter細(xì)胞主要存在于脾臟中，RA患者的臨床樣本難以獲得，因此，本研究選擇在膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎(collagen-induced arthritis，CIA)小鼠模型[8]中進(jìn)行研究，旨在通過研究Ter細(xì)胞在不同發(fā)病階段CIA小鼠中的數(shù)量變化及其與關(guān)節(jié)評分和T、B細(xì)胞亞群比例的相關(guān)性，探索Ter細(xì)胞在CIA發(fā)生和發(fā)展中的作用，從而進(jìn)一步深入理解RA的發(fā)病機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

無特定病原體(specific pathogen free，SPF)級6～8 周DBA/1雄性小鼠和Balb/c雄性小鼠購于北京華阜康生物科技股份有限公司，SPF級6～8周C57BL/6雄性小鼠購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，均寄養(yǎng)于北京大學(xué)人民醫(yī)院動物實(shí)驗(yàn)室SPF級環(huán)境，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 主要試劑和儀器

流式細(xì)胞儀FACSAriaⅡ由美國BD公司制造，流式細(xì)胞儀CytoFLEX LX由美國Beckman Coulter公司制造；熒光標(biāo)記的抗鼠CD45(FITC標(biāo)記)、抗鼠Ter-119(APC標(biāo)記)、抗鼠CD4(APC-Cy7標(biāo)記)、抗鼠干擾素γ(interferon，IFN-γ，PerCP-Cy5.5標(biāo)記)、抗鼠CD19(PerCP-Cy5.5標(biāo)記)、抗鼠GL-7(Pacific Blue標(biāo)記)、抗鼠CD138(APC標(biāo)記)抗體均購自美國Biolegend公司；熒光標(biāo)記的抗鼠白細(xì)胞介素(interleukin-17，IL-17，PE標(biāo)記)、抗鼠FoxP3(PE標(biāo)記)、抗鼠CD5(APC標(biāo)記)、抗鼠CD1d(PE標(biāo)記)、抗鼠CD95(Alexa Fluor 488標(biāo)記)購自美國eBioscience公司；牛Ⅱ型膠原(bovine type Ⅱ Collagen，CⅡ)、完全弗氏佐劑(complete Freund’s adjuvant，CFA)、不完全弗氏佐劑(incomplete Freund’s adjuvant，IFA)購自美國Chondrex公司；FACS Permeabilizing Solution購自美國BD公司；FoxP3/Transcriptn Factor Staining Buffer Set購自Thermo Fisher Scienti-fic 公司；FCM Lysing solution、4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))多聚甲醛(paraformaldehyde，PFA)、佛波酯(phorbol-12-myristate-13-acetate，PMA)、離子霉素(ionomycin)和布雷非德菌素A(brefeldin A，BFA)均購自杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司。

1.3 CIA造模、分組及評分

1.3.1造模 CⅡ用100 mmol/L冰醋酸溶解4 ℃過夜，與CFA按照1 ∶1的體積比混合，充分乳化。在小鼠尾根部分兩點(diǎn)進(jìn)行皮下注射，各注射含100 μg CⅡ的乳化液；初次免疫后第21天，CⅡ和IFA按照1 ∶1的體積比充分乳化，在小鼠尾根部皮下注射含100 μg CⅡ的乳化液，完成CIA模型的誘導(dǎo)。

1.3.2分組 本次實(shí)驗(yàn)共構(gòu)建40只CIA模型小鼠，在二次免疫后5 d發(fā)病率約為50%，挑選評分相近的小鼠，隨機(jī)分入發(fā)病早期、高峰期和晚期3組，共挑選出18只小鼠，每組6只。發(fā)病高峰期小鼠根據(jù)最終關(guān)節(jié)評分以8分為界再細(xì)分為高評分組和低評分組。

1.3.3評分 分別對小鼠的四只爪子進(jìn)行評分，每只爪子的評分標(biāo)準(zhǔn)如下： 0分，無關(guān)節(jié)紅腫；1分，1～2個腳趾/手指腫脹或掌心腫脹或腕/踝部腫脹；2分，超過2個腳趾/手指腫脹或達(dá)到任意2個1分的條件；3分，達(dá)到3個1分的條件或超過2個腳趾/手指腫脹且有掌心或腕/踝部腫脹；4分，超過2個腳趾/手指腫脹且有掌心和腕/踝部腫脹。每只爪子最高為4分，整體評分最高16分。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測小鼠脾臟Ter細(xì)胞、生發(fā)中心(germinal centers，GC)-B細(xì)胞和B10細(xì)胞

小鼠異氟烷吸入麻醉后以頸椎脫臼的方式安樂死，取脾臟，研磨、裂紅、洗滌，制備單細(xì)胞懸液。檢測Ter細(xì)胞加入抗鼠CD45-FITC和Ter-119-APC流式抗體，檢測GC-B、B10細(xì)胞加入抗鼠CD19-PerCP-Cy5.5、CD5-APC、CD1d-PE、CD95-Alexa Fluor 488、GL-7-Pacific Blue流式抗體，檢測漿細(xì)胞加入抗鼠CD19-PerCP-Cy5.5、CD138-APC流式抗體。振蕩混勻后室溫避光孵育30 min，洗滌后重懸，上機(jī)檢測。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測小鼠脾臟Th1、Th17和Treg細(xì)胞

1.5.1檢測Th1、Th17細(xì)胞 制備小鼠脾臟單細(xì)胞懸液，離心后完全1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，加入PMA、離子霉素和BFA，混勻，37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育5 h。5 h后加入抗鼠CD4-APC-Cy7抗體，振蕩混勻后室溫避光孵育30 min，固定、破胞膜，加入抗鼠IL-17-PE和IFN-γ-PerCP-Cy5.5抗體，振蕩混勻后室溫避光孵育30 min，洗滌后重懸，上機(jī)檢測。

1.5.2檢測Treg細(xì)胞 制備小鼠脾臟單細(xì)胞懸液，加入抗鼠CD4-APC-Cy7抗體，振蕩混勻后室溫避光孵育30 min，F(xiàn)oxP3 Staining Buffer set破核膜，然后加入抗鼠FoxP3-PE抗體，振蕩混勻后室溫避光孵育30 min，洗滌后重懸，上機(jī)檢測。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用Prism 7軟件進(jìn)行處理、分析。各個階段CIA小鼠之間及其與na?ve小鼠Ter細(xì)胞比例差異采用One-way ANOVA分析，然后采用Tukey’s多重比較檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較；高峰期兩組CIA小鼠Ter、Th1、Th17、GC-B細(xì)胞比例差異采用Welch’st檢驗(yàn)分析；Ter細(xì)胞比例與各T、B細(xì)胞亞群比例的相關(guān)性采用Pearson分析(雙側(cè)檢驗(yàn))，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Ter細(xì)胞在不同品系小鼠脾臟中的分布

流式細(xì)胞儀檢測Ter細(xì)胞的圈門策略如圖1所示，DBA/1、Balb/c、C57BL/6三種品系na?ve小鼠脾臟中均存在Ter細(xì)胞，但在DBA/1小鼠脾臟中比例最高。

2.2 Ter細(xì)胞在發(fā)病高峰期CIA小鼠中明顯擴(kuò)增

鑒于DBA/1小鼠是公認(rèn)的構(gòu)建CIA模型的小鼠品系，并且上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示DBA/1小鼠脾臟中Ter細(xì)胞的比例最高，因此我們選擇DBA/1小鼠進(jìn)行了CIA模型的構(gòu)建。流式細(xì)胞儀檢測6只na?ve和6只發(fā)病高峰期CIA小鼠脾臟Ter細(xì)胞，結(jié)果顯示發(fā)病高峰期CIA小鼠脾臟Ter細(xì)胞比例較na?ve小鼠明顯升高(8.522%±2.645%vs. 1.937%±0.725%，P<0.01，圖2)。

A,gating strategies for Ter cells in the spleen of mice; B, the frequencies of Ter cells in C57BL/6, Balb/c and DBA/1 mice.圖1 Ter細(xì)胞在不同品系小鼠脾臟中的分布Figure 1 Distribution of Ter cells in the spleen of different strains of mice

CIA, collagen-induced arthritis. Frequencys of Ter cells in the spleen of na?ve and CIA mice. Ter cells were increased markbly in CIA mice compared with na?ve mice.圖2 Ter細(xì)胞在發(fā)病高峰期CIA小鼠中明顯增加(n=6)Figure 2 Ter cells were significantly increased in CIA mice (n=6)

2.3 發(fā)病高峰期Ter細(xì)胞比例與CIA關(guān)節(jié)評分及T、B細(xì)胞亞群比例的相關(guān)性分析

根據(jù)關(guān)節(jié)評分將發(fā)病高峰期CIA小鼠分為兩組，以8分為分界線，評分≤8分為低評分，評分>8分為高評分。比較兩組小鼠脾臟Ter、Th1、Th17、GC-B細(xì)胞的比例，結(jié)果顯示，高評分組小鼠脾臟Ter細(xì)胞比例明顯低于低評分組(6.217%±0.841%vs. 10.827%±0.917%，P<0.01)。高評分組小鼠脾臟Th1細(xì)胞比例明顯高于低評分組(1.337%±0.110%vs. 0.727%±0.223%，P<0.05)，高評分組小鼠脾臟Th17細(xì)胞比例高于低評分組(0.750%±0.171%vs. 0.477%±0.051%，P=0.099)， 高評分組小鼠脾臟GC-B細(xì)胞比例明顯高于低評分組(1.243%±0.057%vs. 1.097%±0.015%，P<0.05)，提示高峰期CIA小鼠脾臟Ter細(xì)胞比例與T、B細(xì)胞及其亞群比例可能存在相關(guān)性(圖3)。進(jìn)一步的相關(guān)性分析結(jié)果顯示，發(fā)病高峰期CIA小鼠脾臟Ter細(xì)胞比例與CD4+T、Th1、Th17、GC-B細(xì)胞比例均呈強(qiáng)負(fù)相關(guān)，與B10細(xì)胞比例呈強(qiáng)正相關(guān)，初步提示這群細(xì)胞在CIA中可能具有保護(hù)作用(圖3)。

A, The differences of the frequencies of Ter, Th1, Th17 and GC-B cells between the mice with high score and low score at the peak stage of CIA； B, Correlation analysis of Ter cell frequencies with T and B cell subsets.圖3 CIA發(fā)病高峰期Ter細(xì)胞比例與關(guān)節(jié)評分及T、B細(xì)胞亞群的相關(guān)性分析Figure 3 Correlation analysis of Ter cell frequencies with joint score, T and B cell subsets

2.4 Ter細(xì)胞呈現(xiàn)動態(tài)變化，在CIA發(fā)病晚期比例降低

根據(jù)CIA發(fā)病時間和關(guān)節(jié)評分將CIA分為發(fā)病早期(發(fā)病1～2天，評分≤2分)、高峰期(發(fā)病15 d左右)、晚期(發(fā)病60 d以上)。流式細(xì)胞儀檢測各個階段CIA小鼠脾臟Ter細(xì)胞比例，觀察其動態(tài)變化過程。結(jié)果顯示，晚期CIA小鼠脾臟Ter細(xì)胞比例明顯低于高峰期(0.917%±0.588%vs. 8.522%±2.645%，P<0.001，圖4)，進(jìn)一步提示其可能作為一群免疫保護(hù)細(xì)胞參與CIA發(fā)病，但其具體作用及機(jī)制仍需后續(xù)進(jìn)一步的體內(nèi)及體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

3 討論

RA的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，多種免疫細(xì)胞及細(xì)胞因子參與其發(fā)病過程，之前的研究主要集中在淋巴系和髓系細(xì)胞，例如T細(xì)胞、B細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞等淋巴細(xì)胞及其亞群及MDSCs細(xì)胞的相關(guān)研究，但關(guān)于紅系細(xì)胞在RA發(fā)病中的作用卻未見報(bào)道。

本研究首先證實(shí)了小鼠脾臟中存在Ter細(xì)胞，并且發(fā)現(xiàn)發(fā)病高峰期CIA小鼠脾臟中Ter細(xì)胞比例較na?ve小鼠明顯升高，提示Ter細(xì)胞可能參與CIA發(fā)展。接下來的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，發(fā)病高峰期CIA小鼠脾臟Ter細(xì)胞比例與CD4+T、Th1、Th17、GC-B細(xì)胞比例均呈強(qiáng)負(fù)相關(guān)，與B10細(xì)胞比例呈強(qiáng)正相關(guān)。而研究表明，Th1、Th17、GC-B細(xì)胞在RA中發(fā)揮致病作用[9-10]，B10細(xì)胞在RA中發(fā)揮保護(hù)作用[11]，提示Ter細(xì)胞在CIA中可能具有保護(hù)作用。隨著疾病進(jìn)展，發(fā)病晚期CIA小鼠脾臟Ter細(xì)胞比例明顯降低，進(jìn)一步提示Ter細(xì)胞在CIA中可能作為一種保護(hù)性細(xì)胞發(fā)揮作用。

Ter細(xì)胞在RA中發(fā)揮保護(hù)作用的具體機(jī)制仍需進(jìn)一步研究確認(rèn)。在體外通過Ter細(xì)胞與na?ve T細(xì)胞共培養(yǎng)，觀察其對T細(xì)胞分化的影響；通過Ter細(xì)胞與不同T、B細(xì)胞亞群共培養(yǎng)，觀察其對不同T、B細(xì)胞亞群增殖的作用。在體內(nèi)通過過繼轉(zhuǎn)移Ter細(xì)胞到CIA小鼠體內(nèi)，觀察其對CIA發(fā)展的加重或減輕情況。通過以上研究將進(jìn)一步明確Ter細(xì)胞在RA發(fā)病中的作用。

Frequencys of Ter cells in the spleen of na?ve and CIA mice at different stages. Ter cells were decreased markbly in CIA mice at late stage compared with peak stage.圖4 CIA不同發(fā)病階段Ter細(xì)胞的動態(tài)變化(n=6)Figure 4 Dynamic changes of Ter cells in different stages of CIA (n=6)

Han等[7]研究發(fā)現(xiàn)，在荷瘤小鼠中Ter細(xì)胞主要在脾臟發(fā)生異常擴(kuò)增，參與疾病進(jìn)展。RA的主要受累部位是關(guān)節(jié)和滑膜組織，Ter細(xì)胞是否在此部位異常聚集尚不清楚。我們目前正在進(jìn)行RA患者滑膜組織中Ter細(xì)胞的數(shù)量及功能的研究；此外，CIA小鼠關(guān)節(jié)滑膜組織中Ter細(xì)胞的特征及功能也是我們未來的研究內(nèi)容之一。

Ter細(xì)胞通過分泌artemin促進(jìn)肝癌的進(jìn)展，但Ter細(xì)胞在CIA中是通過artemin還是其他途徑發(fā)揮作用目前仍不清楚。研究表明，artemin在多種腫瘤中表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)腫瘤進(jìn)展[12-14]，但關(guān)于其在RA中的表達(dá)情況及作用仍未見報(bào)道，值得進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)成紅細(xì)胞樣Ter細(xì)胞在發(fā)病高峰期CIA小鼠脾臟中明顯擴(kuò)增，并且與關(guān)節(jié)評分及Th1、Th17、GC-B細(xì)胞比例均呈負(fù)相關(guān)，與B10細(xì)胞比例呈正相關(guān)，晚期CIA小鼠脾臟Ter細(xì)胞比例較高峰期明顯降低，提示Ter細(xì)胞參與RA發(fā)病并且可能發(fā)揮保護(hù)作用，表明紅系細(xì)胞可能參與RA的發(fā)病。后續(xù)研究中我們將進(jìn)一步完善紅系細(xì)胞對RA發(fā)病作用的研究，以期深入理解RA的發(fā)病機(jī)制，并為RA的治療提供新的靶點(diǎn)。