白 潔,英子偉，趙 林，李偉杰，王 聰，謝賢鑫，姜大慶

0 引言

隨著化療藥物及靶向治療藥物的研發(fā),乳腺癌患者的總生存率及復(fù)發(fā)率均有一定程度的提高[1],但是化療耐藥仍然是影響乳腺癌患者復(fù)發(fā)率及總生存期的最主要因素,最終導(dǎo)致治療減效、無(wú)效及失敗[2-3]。多西他賽(Docetaxel，Doc)在乳腺癌、胃癌及非小細(xì)胞肺癌等腫瘤中是最主要的化療藥物，為新一代紫杉類抗癌藥，是有絲分裂抑制劑[4-8]。多西他賽與希羅達(dá)、順鉑及表柔比星等藥物聯(lián)合化療在晚期乳腺癌化療中發(fā)揮重要的作用[9-11]。多種miRNA在乳腺癌中為高表達(dá)，通過(guò)作用于靶基因調(diào)控多種惡性腫瘤細(xì)胞的增殖及凋亡等惡性行為，并與化療耐藥具有相關(guān)性[12]。有研究顯示，miR-21對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖具有重要調(diào)控作用，Tumor-suppressor genes programmed cell death 4 (PDCD4)是miR-21的靶基因[13-14]。本研究通過(guò)Targetscan等靶基因預(yù)測(cè)分析軟件，進(jìn)一步對(duì)miR-21與PDCD4的靶向調(diào)控關(guān)系進(jìn)行了預(yù)測(cè)分析，觀察miR-21表達(dá)對(duì)Doc耐藥乳腺癌細(xì)胞株存活的影響，并探討其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 人乳腺癌細(xì)胞株HCC1937購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)，通過(guò)Doc劑量階梯遞增方法建立穩(wěn)轉(zhuǎn)Doc耐藥HCC1937/Doc細(xì)胞株，在中國(guó)醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院(遼寧省腫瘤醫(yī)院)中心實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)傳代。miR-21-5p mimics、miR-21-5p inhibitor、control mimics及control inhibitor購(gòu)自英國(guó)Cohesion Biosciences公司,PDCD4多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。miRNA提取及分離試劑盒、RT-PCR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自立陶宛Fermentas公司，MTT試劑盒及All-in-OneTMqPCR Mix試劑盒購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。大連寶生生物技術(shù)有限公司對(duì)引物設(shè)計(jì)及合成,miR-21-5p forward:5′-CGTTGAATGTCACTCTGGTG-3′;reverse:5′-GGTCATTGTGTGCAGCTCAC-3′。GAPDH forward:5′-GGAGTGAGATCGAAGTGGC-3′;reverse:5′-GAGGATGATGATTAGTGGTC-3′。

1.2 轉(zhuǎn)染試驗(yàn) 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HCC1937及HCC1937/Doc細(xì)胞消化為單細(xì)胞懸液，以20×104/孔細(xì)胞接種于24孔板，依據(jù)Lipo2000說(shuō)明書對(duì)達(dá)到70%融合度的細(xì)胞株轉(zhuǎn)染(miR-21-5p mimics、miR-21-5p inhibitor、control mimics及control inhibitor)，轉(zhuǎn)染過(guò)程完成后繼續(xù)培養(yǎng)，48 h后qRT-PCR進(jìn)行轉(zhuǎn)染效率檢測(cè)，準(zhǔn)備進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

1.3 細(xì)胞生存率分析 將轉(zhuǎn)染后的HCC1937/Doc及HCC1937細(xì)胞以8×103/孔的濃度加入96孔板,以0.05、0.5、5、50 μmol/L濃度梯度歸于Doc處理48 h，以MTT試驗(yàn)分析細(xì)胞增殖率。加入5 mg/ml濃度的MTT液2 ml/孔，溫育條件下放置4 h后棄上清，加入二甲基亞砜150 μl進(jìn)行振蕩以溶解結(jié)晶，以550 nm的波長(zhǎng)用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀進(jìn)行吸光度測(cè)定，獨(dú)立實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，對(duì)平均值進(jìn)行分析。

1.4 qRT-PCR 取擬進(jìn)行試驗(yàn)的HCC1937/Doc及HCC1937細(xì)胞，總RNA提取及純化依照Trizol試劑操作說(shuō)明進(jìn)行，分別以紫外吸收法和變性瓊脂糖凝膠電泳法對(duì)RNA的質(zhì)量及完整性進(jìn)行檢測(cè)。依次進(jìn)行合成樣品cDNA，采用qRT-PCR測(cè)定梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品包括待測(cè)樣品的管家基因，然后進(jìn)行梯度稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線的DNA模板繪制，qRT-PCR步驟測(cè)定待測(cè)基因，配制完成的PCR反應(yīng)液上RT-PCR，PCR擴(kuò)增反應(yīng)。ΔΔCt法分析溶解曲線。

1.5 Western blot 對(duì)擬進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的HCC1937/Doc及HCC1937細(xì)胞預(yù)處理，對(duì)蛋白的濃度進(jìn)行定量。對(duì)蛋白進(jìn)行裂解后震蕩搖勻，對(duì)總蛋白進(jìn)行抽提操作，取上清液，采用BCA定量試劑盒對(duì)蛋白濃度進(jìn)行定量分析。10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)電轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。然后用5%脫脂奶粉在室溫條件下進(jìn)行90 min封閉后加Ⅰ抗，孵育12 h后加入Ⅱ抗，ECL進(jìn)行顯色。β-actin是內(nèi)參照。以軟件Quantity One進(jìn)行灰度值的分析，結(jié)果以蛋白相對(duì)表達(dá)量=灰度值(目標(biāo)蛋白)/灰度值(內(nèi)參照蛋白)進(jìn)行表示及統(tǒng)計(jì)。

2 結(jié)果

2.1 miR-21-5p調(diào)控HCC1937細(xì)胞對(duì)Doc敏感性 miR-21-5p mimic轉(zhuǎn)染HCC1937/Doc細(xì)胞，結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，miR-21-5p在HCC1937細(xì)胞中表達(dá)為對(duì)照組的212倍(P<0.05)，Doc的ICD50(1.98±0.16)μmol/L明顯高于NC組(0.78±0.06)μmol/L及control mimics組(1.08±0.17)μmol/L(F=77.54,P<0.001)，HCC1937細(xì)胞培養(yǎng)48 h,細(xì)胞存活率呈劑量依賴性下降,但敏感性低于NC組及control mimics組，見圖1A、圖1C。

miR-21-5p inhibitor轉(zhuǎn)染HCC1937/Doc細(xì)胞，結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，miR-21-5p在HCC1937細(xì)胞中表達(dá)為對(duì)照組的0.52倍(P<0.05)，Doc的ICD50(46.32±7.85)μmol/L明顯低于NC組(110.54±7.92)μmol/L及control inhibitor組(109.41±9.57)μmol/L(F=202.4,P<0.001)，HCC1937細(xì)胞培養(yǎng)48 h,細(xì)胞存活率呈現(xiàn)劑量依賴性下降,敏感性高于NC組及control inhibitor組，見圖1B、圖1D。

2.2 miR-21-5p調(diào)控PDCD4表達(dá) 通過(guò)靶基因預(yù)測(cè)軟件TargetScan、Genecard等預(yù)測(cè)，PDCD4與miR-21-5p可能存在靶向調(diào)控關(guān)系，見圖2A。qRT-PCR檢測(cè)顯示，在HCC1937/Doc細(xì)胞中PDCD4 mRNA表達(dá)明顯低于HCC1937細(xì)胞(t=6.254，P=0.003)，見圖2B。Western blot檢測(cè)顯示,在HCC1937/Doc細(xì)胞中，PDCD4蛋白表達(dá)明顯低于HCC1937細(xì)胞(t=5.942，P=0.004)，見圖2C；給予miR-21-5p mimic轉(zhuǎn)染HCC1937/Doc細(xì)胞，qRT-PCR檢測(cè)顯示，PDCD4 mRNA表達(dá)明顯低于NC組HCC1937細(xì)胞(t=6.583，P=0.003)，見圖2D。Western blot檢測(cè)顯示,PDCD4蛋白表達(dá)明顯低于NC組HCC1937細(xì)胞(t=10.57，P=0.001)，見圖2E。給予miR-21-5p inhibitor轉(zhuǎn)染HCC1937/Doc細(xì)胞，qRT-PCR檢測(cè)顯示，PDCD4 mRNA表達(dá)明顯高于NC組(t=4.242，P=0.013)，見圖2F。Western blot檢測(cè)顯示,PDCD4蛋白表達(dá)明顯高于NC組(t=4.611，P=0.009)，見圖2G。

3 討論

miRNA作為內(nèi)源性非編碼RNA，對(duì)細(xì)胞功能具有重要的調(diào)控作用，與腫瘤的轉(zhuǎn)移、侵襲、凋亡及增殖等具有相關(guān)性，并通過(guò)被上游基因調(diào)控或?qū)ο掠位蜻M(jìn)行調(diào)控，影響腫瘤細(xì)胞的化療及放療耐藥[15-16]。多西他賽作為紫杉醇類化療藥，通過(guò)促進(jìn)微管蛋白的聚合異常，抑制細(xì)胞有絲分裂過(guò)程中的紡錘體形成，從而影響微管的功能，破壞細(xì)胞有絲分裂，使腫瘤細(xì)胞停留在分裂期[17-18]。有研究顯示，miR-141、miR-125及miR-452等miRNA對(duì)乳腺癌細(xì)胞Doc耐藥均具有調(diào)控作用，其表達(dá)進(jìn)行下調(diào)可以提高Doc耐藥乳腺癌細(xì)胞對(duì)Doc的敏感性[15-16]。miR-21在乳腺癌中表達(dá)上調(diào)，PDCD4在乳腺癌中表達(dá)下調(diào)。Rodrigues等[19]研究顯示，在肝細(xì)胞癌中，miR-21對(duì)PDCD4具有負(fù)向調(diào)節(jié)作用。

本研究顯示，給予miR-21-5p mimic轉(zhuǎn)染HCC1937/Doc細(xì)胞，HCC1937細(xì)胞的Doc敏感性進(jìn)一步降低，而給予miR-21-5p inhibitor轉(zhuǎn)染HCC1937/Doc細(xì)胞，HCC1937細(xì)胞的Doc敏感性改善，并具有劑量依賴性。結(jié)果表明,上調(diào)miR-NA-21表達(dá)降低HCC1937細(xì)胞對(duì)Doc敏感度,下調(diào)miRNA-21改善HCC1937細(xì)胞對(duì)Doc的敏感性。miR-21-5p可能對(duì)乳腺癌細(xì)胞Doc敏感性具有直接或間接的調(diào)控作用。Hu等[20]對(duì)Doc耐藥的MCF-7乳腺癌細(xì)胞給予miR-452擬似劑或抑制劑，結(jié)果顯示，miR-452通過(guò)靶向調(diào)控APC4(Adenomatous polyposis coli,結(jié)腸腺瘤樣息肉)基因影響MCF-7的Doc敏感性。He等[2]認(rèn)為，miR-944對(duì)乳腺癌細(xì)胞的化療耐藥也具有重要的調(diào)控功能。Zhao等[5]研究顯示，miR-638通過(guò)調(diào)控STARD10信號(hào)通路介導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞的Doc耐藥。Zhou等[21]研究認(rèn)為，miR-125b通過(guò)調(diào)控Bak1基因表達(dá)影響紫杉醇對(duì)乳腺癌細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用，誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞的紫杉醇耐藥。本研究進(jìn)一步顯示，在HCC1937/Doc細(xì)胞中，PDCD4 mRNA及蛋白表達(dá)明顯低于對(duì)照組，給予miR-21-5p mimic轉(zhuǎn)染HCC1937/Doc細(xì)胞，PDCD4 mRNA及蛋白表達(dá)明顯低于對(duì)照組，給予miR-21-5p inhibitor轉(zhuǎn)染HCC1937/Doc細(xì)胞，PDCD4 mRNA及蛋白表達(dá)明顯高于對(duì)照組。結(jié)果表明，miR-21-5p對(duì)PDCD4具有負(fù)向調(diào)控作用，miR-21-5p作為促癌基因，負(fù)向調(diào)控抑癌基因PDCD4，從而介導(dǎo)HCC1937細(xì)胞對(duì)Doc的化療敏感性。Venturutti等[13]研究認(rèn)為，對(duì)乳腺癌細(xì)胞中miR-21表達(dá)進(jìn)行上調(diào)，可以誘發(fā)PDCD4表達(dá)水平降低，PDCD4是miR-21調(diào)控的下游靶基因。在多種惡性腫瘤中miR-21高表達(dá)，是促癌基因，PDCD4是miR-21的靶基因，可能作為惡性腫瘤治療的靶點(diǎn)[22]。Frankel等[14]研究也顯示，在乳腺癌細(xì)胞中PDCD4是miR-21重要的下游靶基因，miR-21通過(guò)對(duì)PDCD4基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，介導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞的增殖、凋亡及浸潤(rùn)等惡性行為。

圖1 miR-21-5p調(diào)控HCC1937細(xì)胞對(duì)Doc敏感性

圖2 miR-21-5p調(diào)控PDCD表達(dá)

靶向治療可能是提高晚期乳腺癌生存期的主要治療和研究方向[23]，本研究通過(guò)觀察miR-21-5p對(duì)乳腺癌HCC1937細(xì)胞Doc耐藥的影響，結(jié)果顯示，對(duì)miR-21-5p表達(dá)進(jìn)行下調(diào)，可能通過(guò)上調(diào)PDCD4表達(dá)改善乳腺癌細(xì)胞的Doc敏感性，miR-21可能作為逆轉(zhuǎn)乳腺癌化療耐藥的治療靶基因。