姜 磊，徐倩楠，2，朱如心，盛 翔，李 莉

（1.司法鑒定科學研究院 上海市法醫(yī)學重點實驗室 上海市司法鑒定專業(yè)技術(shù)服務(wù)平臺，上海200063；2.溫州醫(yī)科大學 法醫(yī)學系，浙江 溫州325035；3.凱杰企業(yè)管理（上海）有限公司，上海200003）

1案例

1.1 簡要案情

因申報戶口需要，孫某某（被檢母親）、張某某（被檢父親）與張某（孩子）來委托本院進行親子鑒定。

1.2 檢驗過程

1.2.1 初次檢驗

按照中華人民共和國公共安全行業(yè)標準GA/T383-2014抽提血樣DNA，采用GoldenEye 20A DNA身份鑒定系統(tǒng)（北京基點認知公司）進行復合PCR擴增，用3130 XL遺傳分析儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）進行毛細管電泳和基因型分析。所獲得的分型圖譜見圖1～3。

圖1 被檢母親血樣分型圖譜（20A）

圖2 孩子血樣分型圖譜（20A）

圖3 被檢父親血樣分型圖譜（20A）

1.2.2 初檢結(jié)果的分析說明

D19S433等19個STR基因座均為人類的遺傳學標記，遵循孟德爾遺傳定律，聯(lián)合應(yīng)用可進行親權(quán)鑒定，其累積非父（母）排除概率大于0.9999。

分型圖譜顯示，孩子在每個基因座的等位基因均可從被檢母親的基因型中找到來源；除D21S11基因座外，被檢父親均能提供給孩子必需的等位基因。在D21S11基因座（圖 4），孩子的表型為“32.2”，被檢父親的表型為“29”，被檢父親不能提供給孩子必需的等位基因“32.2”，不符合孟德爾遺傳定律。

圖4被檢母親、孩子和被檢父親在D21S11基因座的分型圖譜（20A）

1.2.3 第二次檢驗及結(jié)果分析

采用PowerPlex 21系統(tǒng)（美國Promega公司）進行復合PCR擴增，用3130 XL遺傳分析儀進行毛細管電泳和基因型分析（五色標記的熒光強度閾值均設(shè)定為50RFU）。檢驗結(jié)果顯示，相同基因座的分型結(jié)果與初檢 （GoldenEye 20A DNA身份鑒定系統(tǒng)）相同。但是，在D21S11基因座（圖5），被檢父親的“29”等位基因峰之后存在一小峰，孩子在相同位置亦檢見一小峰，疑似有等位基因漏檢現(xiàn)象。所以，換用其他試劑盒進行核驗。

圖5 被檢母親、孩子和被檢父親在D21S11基因座的分型圖譜（PP21）

1.2.4 第三次檢驗及結(jié)果分析

采用Investigator 24plex QS系統(tǒng)（德國QIAGEN公司）進行復合PCR擴增，用3500 XL遺傳分析儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）進行毛細管電泳和基因型分析（六色標記的熒光強度閾值均設(shè)定為50RFU）。在D21S11基因座（圖6），被檢母親的分型為“31，32.2”，孩子的分型為“29.2，32.2”，被檢父親的分型為“29，29.2”。其檢驗結(jié)果支持“1.2.3”中“等位基因漏檢”的假設(shè)。

圖6 被檢母親、孩子和被檢父親在D21S11基因座的分型圖譜（Investigator 24plex QS）

1.2.5測序驗證

通過UCSC網(wǎng)站查找D21S11基因座核心序列，在STRBase網(wǎng)站查找重復單位，利用Primer 5.0軟件設(shè)計引物序列，在NCBI網(wǎng)站驗證所設(shè)計的引物能否擴增出目標片段。

通過以上方法設(shè)計D21S11基因座的測序引物，將被檢母親、孩子與被檢父親的DNA樣本進行PCR擴增和克隆測序（每個樣本都挑選5個以上克隆進行測序），D21S11基因座核心序列為（TAGACAGA）。測序證實，在D21S11基因座，被檢母親的基因型為“31，32.2”，孩子的基因型為“29.2，32.2”，被檢父親的基因型為 “29，29.2”[1]。使用 GoldenEye 20A DNA身份鑒定系統(tǒng)和PowerPlex 21系統(tǒng)分型時，被檢孩子和父親均漏檢了等位基因“29.2”，而Investigator 24plex QS系統(tǒng)的檢測結(jié)果準確無誤。

1.2.6 結(jié)果與分析

依次選用GoldenEye 20A DNA身份鑒定系統(tǒng)、PowerPlex 21系統(tǒng)和Investigator 24plex QS系統(tǒng)對樣本DNA進行PCR擴增，共獲得24個STR基因座的基因型（D21S11基因座的基因型經(jīng)克隆測序確認）。結(jié)果表明，孩子的等位基因均可從被檢母親和被檢父親的基因型中找到來源，符合孟德爾遺傳規(guī)律。經(jīng)計算，累積親權(quán)指數(shù)分別為175760612.513、17536949184.581。

依據(jù)親權(quán)鑒定技術(shù)規(guī)范GB/T 37223-2018，支持被檢母親是孩子的生物學母親，支持被檢父親是孩子的生物學父親。

2討論

2.1 等位基因漏檢現(xiàn)象

在親權(quán)鑒定中，當發(fā)現(xiàn)被檢父母某一方的某個等位基因不能遺傳給子女時，除了需要考慮該基因座是否存在突變的可能外，還需注意該基因座是否存在等位基因漏檢的現(xiàn)象。此時，可通過更換不同試劑盒進行檢驗判斷，需要時也可進行測序驗證，以免得出錯誤的鑒定意見。

本案中，采用GoldenEye 20A DNA身份鑒定系統(tǒng)對樣本DNA進行PCR擴增，檢驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)被檢父親和孩子僅在D21S11基因座不符合孟德爾遺傳規(guī)律：孩子的表型為“32.2”，被檢父親的表型為“29”。換用PowerPlex 21系統(tǒng)分型后，判別結(jié)果相同，但從分型圖譜看來，被檢父親和孩子均存在等位基因漏檢的可能。因此選用了第三種試劑盒Investigator 24plex QS系統(tǒng)進行核驗，并進一步進行了克隆測序，其結(jié)果證實GoldenEye 20A試劑盒、PowerPlex 21試劑盒均在D21S11基因座漏檢了被檢父親和孩子的等位基因“29.2”，而 Investigator 24plex QS系統(tǒng)的檢測結(jié)果完整無誤。

2.2 D21S11基因座分型結(jié)果的驗證

D21S11基因座的核心序列為TAGACAGA，其串聯(lián)重復區(qū)域的序列構(gòu)成極為復雜，同一等位基因可有多個序列特征，因此，針對測序結(jié)果判讀等位基因時，應(yīng)正確運用參考序列進行比對分析，否則容易導致判讀錯誤。例如，本案被檢孩子的等位基因“29.2”在串聯(lián)重復區(qū)域的序列構(gòu)成為TAGATATA GATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGA TATGGATAGATAGATGATAGATAGATAGATATAG ATAGATAGACAGACAGACAGACAGACAGACAGAT AGATAGATAGATAGATAGA，其核心重復單元為TAGA、CAGA，并不呈現(xiàn)為簡單的串聯(lián)重復，各單元之間存在一些間隔序列如 “TA”、“TATGGA”、“TGA”，數(shù)算重復次數(shù)時該如何取舍，直接關(guān)系到等位基因的判讀結(jié)果是否與毛細管電泳的分型結(jié)果一致。本案鑒定中，對等位基因判讀時參考了John M.Butler所著《法醫(yī)DNA分型專論：方法學》附錄一中的“報道的STR等位基因大小及序列”，其判讀結(jié)果與Investigator 24plex QS系統(tǒng)的分型結(jié)果相符。