陳天朝，王 嬌，馬彥江 ，李瑞穎

(1.河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部，河南 鄭州 450000； 2.河南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，河南 鄭州 450008； 3.許昌市中醫(yī)院藥學(xué)部，河南 許昌 461000)

清代徐靈胎的《醫(yī)學(xué)源流論·方藥·制藥論》上卷第一章記載：“……或制其形，或制其味，或制其性，或制其質(zhì)……”說明古人已經(jīng)認(rèn)識到炮制能改變中藥的形、色、氣、味，從而改變中藥的性能[1]。中藥炮制包括水制、火制、水火共制等多種方法，尤其是火制，即清炒法，包括炒黃、炒焦、炒炭。傳統(tǒng)火制能降低或消除藥物的毒性或副作用，改變或緩和藥物的性能，改變藥物作用的部位或增強(qiáng)對某部位的作用。多糖類藥材白術(shù)為菊科植物白術(shù)的干燥根莖，具有健脾益氣、燥濕利水、止汗、安胎的功效[2]。白術(shù)的炮制方法有麩炒、土炒、炒焦、炒炭、蒸制等，白術(shù)炮制品在臨床上使用較多，如生術(shù)片、焦白術(shù)、炒白術(shù)、土炒白術(shù)、白術(shù)炭和蒸白術(shù)等[3-4]。通過查閱相關(guān)文獻(xiàn)，筆者發(fā)現(xiàn)麩炒白術(shù)報道較多，清炒法白術(shù)炮制研究較少?；诖?，本實(shí)驗(yàn)對白術(shù)進(jìn)行清炒法研究，探究不同清炒前后白術(shù)性質(zhì)發(fā)生的變化，為日后炮制用藥提供指導(dǎo)，并且為白術(shù)清炒法炮制提供新的工藝。前期課題組陳天朝等人研究了黨參清炒前后物性及有效成分變化[5]，探究了細(xì)粉與飲片之間物性傳遞[6]。本實(shí)驗(yàn)以中藥宏觀屬性如中藥飲片物性，分子屬性如大分子、小分子的量變?yōu)橹笜?biāo)，研究生藥飲片-炒黃飲片-炒焦飲片-炒炭飲片和細(xì)粉的動態(tài)過程。

1 藥品、試劑與儀器

白術(shù)，購置安徽普仁中藥飲片有限公司，批號1704093，經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部陳天朝主任藥師鑒定，符合2015版《中國藥典》一部項(xiàng)下的各飲片來源規(guī)定。D(+)-無水葡萄糖，100 mg/瓶，上海源葉生物科技有限公司產(chǎn)品，批號S08J6G1。101AS-1型不銹鋼數(shù)顯電熱鼓風(fēng)干燥箱，功率1.8 kW， 蘇州江東精密儀器有限公司產(chǎn)品；BSA224S-CW電子天平，德國賽多利斯公司產(chǎn)品；KSY可控硅溫控制器，沈陽節(jié)能電爐廠公司產(chǎn)品；A-13箱式電阻爐，沈陽節(jié)能電爐廠公司產(chǎn)品；CMAG HP7德國IKA加熱板，上海子期實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司產(chǎn)品；HH-S4電熱恒溫水浴鍋，北京科偉永興儀器有限公司產(chǎn)品；T11型智能滴定系統(tǒng)，上海晟聲自動化分析儀器有限公司產(chǎn)品；MH-500型可調(diào)式電熱套，功率0.2 kW，北京科偉永興儀器有限公司產(chǎn)品；FW-500高速萬能粉碎機(jī)，北京科偉永興儀器有限公司產(chǎn)品；2015版《中國藥典》藥典篩，浙江上虞市道墟五四儀器廠產(chǎn)品；研缽，江西景德鎮(zhèn)瓷器廠產(chǎn)品。

2 方法與結(jié)果

2.1 飲片制備

根據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)，選擇炒黃、炒焦、炒炭3種炮制方法，根據(jù)飲片炮制的形、色、氣、味、質(zhì)確定實(shí)驗(yàn)溫度和時間，炮制工藝見表1。

表1 白術(shù)最優(yōu)炮制品對應(yīng)炮制工藝

2.2 細(xì)粉制備

取2.1項(xiàng)下所用飲片，在高速萬能粉碎機(jī)中粉碎。對于不能完全粉碎的物料飲片，過篩采用研缽對其進(jìn)行多次研磨，最后以全部通過5號藥典篩為標(biāo)準(zhǔn)。將所得的全部細(xì)粉再次過篩，備用。

2.3 物料參數(shù)的測定

2.3.1 相對密度測定

用100 mL量筒量取50 mL輕質(zhì)液狀石蠟，靜置3 min，待凹液面穩(wěn)定；用電子天平稱取約5 g飲片物料，投入盛有已知體積的輕質(zhì)液狀石蠟的量筒中，靜置3 min；讀取體積，計算飲片物料相對密度。每種飲片平行測定3次，取平均值作為飲片的相對密度值，見表2[7]。

飲片物料相對密度(g/mL)=稱取飲片物料的質(zhì)量g/(飲片投入量筒后體積mL-50)通過SPSS相關(guān)性分析，相對密度(X1)與炮制工藝參數(shù)(X2)相關(guān)性P=0.01，呈顯著性。

表2 白術(shù)及各炮制品的相對密度測定結(jié)果

2.3.2 氧化值測定

按照參考文獻(xiàn)[8-9]方法操作。準(zhǔn)確稱取約5 g中藥飲片和200 mL蒸餾水于500 mL圓底燒瓶，混合均勻后接入蒸餾裝置，精確收集前50 mL餾分。用移液管準(zhǔn)確移取10 mL餾分于滴定瓶內(nèi)，加入25%H2SO45 mL和0.002 mol/L KMnO410 mL溶液，振蕩均勻后室溫下反應(yīng)30 min。加入10% KI 5 mL，滴加Na2S2O3標(biāo)準(zhǔn)溶液，使溶液由黃棕色或深黃色變成淺黃色時，加淀粉溶液為指示劑1mL，用0.02 mol/L Na2S2O3標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至無色，記錄消耗Na2S2O3標(biāo)準(zhǔn)溶液體積為AmL。另以中藥飲片等質(zhì)量水代替樣品重復(fù)操作進(jìn)行空白試驗(yàn)，記錄消耗Na2S2O3標(biāo)準(zhǔn)溶液體積為BmL。見表3。

氧化值：Ox=(B-A)×C×200/(5×0.002×V×M1)。其中,C為硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度(mol/L),200為樣品體積(mL),0.002為高錳酸鉀溶液的濃度(mol/L),V為樣品蒸餾餾分的取樣量(mL),M1為稱取樣品的質(zhì)量。

表3 白術(shù)及各炮制品氧化值測定結(jié)果

通過SPSS相關(guān)性分析，氧化值(X1)與炮制工藝(X2)之間P=0.046，呈顯著性。

2.3.3 吸水率測定

稱取約5 g中藥飲片，精密稱定，置盛有100 mL純化水的磨口錐形瓶中浸泡，分別在累積時間達(dá)到0,10,20,40,60,120,240,480,720,1 440 min后用尼龍網(wǎng)過濾，測定原100 mL浸泡用水剩余體積[6]。以浸泡用水體積幾乎不再減少為時間節(jié)點(diǎn)，對飲片在此時間下測定，每種飲片平行測定3次，取平均值作為飲片吸水率。見表4。中藥飲片吸水率=(100-吸水后浸泡用水剩余體積)/中藥飲片質(zhì)量。

表4 白術(shù)及各炮制品吸水率測定結(jié)果

通過上述數(shù)據(jù)可知，吸水率變化不明顯，運(yùn)用SPSS軟件分析，得出吸水率與炮制工藝之間無顯著性差異。

因炮制后飲片吸水率呈上升趨勢，根據(jù)經(jīng)驗(yàn)，炮制后飲片內(nèi)有空隙，存在空腔。精密稱取約1.0 g物料細(xì)粉置于濾紙中，靜置1 h，過濾3 min，同法處理帶有物料細(xì)粉濾紙。每種物料細(xì)粉平行測定3次，取平均值，結(jié)果見表5。中藥細(xì)粉吸水率W2=(吸水飽和物料細(xì)粉和濾紙質(zhì)量-吸水飽和濾紙質(zhì)量)/吸水前物料細(xì)粉質(zhì)量。

表5 白術(shù)及各炮制品細(xì)粉吸水率測定結(jié)果

對白術(shù)中藥飲片與細(xì)粉的吸水率進(jìn)行相關(guān)性檢驗(yàn)，結(jié)果P=0.007，表明中藥飲片炮制工藝與細(xì)粉的吸水率相關(guān)性顯著。

通過表4、表5得出飲片吸水率、細(xì)粉吸水率，以白術(shù)不同炮制品飲片吸水率為橫坐標(biāo)、白術(shù)不同炮制細(xì)粉吸水率為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，采用SPSS 20．0軟件處理，得到回歸方程[8]。結(jié)果如圖1。

圖1 白術(shù)飲片吸水率對細(xì)粉吸水率線性回歸分析

2.3.4 pH值測定

準(zhǔn)確稱取約5 g中藥飲片，加水100 mL在室溫條件下，2.2.3項(xiàng)下測定時間浸泡。取濾液，測定pH值，每種飲片平行測定3份，取平均值，作為該飲片pH值。見表6。

表6 白術(shù)及各炮制品PH測定結(jié)果

2.3.5 飲片色差測定

2.4 物料多糖含量測定

2.4.1 對照品溶液的制備

精密稱取105 ℃干燥至恒重的無水葡萄糖對照品5.57 mg，加蒸餾水使之溶解于50 mL容量瓶中，稀釋至刻度，搖勻，配制成0.111 4 mg/mL的葡萄糖對照品溶液[11]。

2.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備

精密吸取葡萄糖對照品溶液0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL置于具塞刻度的比色管中，補(bǔ)加純水至1 mL，置于10 mL試管中，加入的6%苯酚1 mL，搖勻，滴加濃硫酸5 mL，混勻后置沸水浴25 min，于冰水浴中15 min取出，在300～900 nm范圍內(nèi)測定吸光度最大吸收波長。結(jié)果：葡萄糖最大吸收波長為490 nm。見圖2[12]。以葡萄糖含量為橫坐標(biāo)，最大吸收波長下吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。見表8、圖3。

圖2 葡萄糖全波長掃描結(jié)果

葡萄糖溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)/(g·L-1)吸光度/Abs0.001 10.3800.002 20.4400.004 50.5500.006 70.6770.008 90.7830.011 40.881

圖3 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

回歸方程:Y=50.503X+0.327 8(R2=0.998 6)。結(jié)果表明：葡萄糖含量在0.001 1～0.011 4 g/L之間線性良好。

2.4.3 樣品粗多糖提取

精密稱取藥材細(xì)粉1.00 g加入16倍量蒸餾水，78 ℃超聲提取48 min，離心，上清液用氯仿-正丁醇(4∶1)萃取2次，水層加4倍量950 mL/L乙醇，放入冰箱靜置過夜，濾過，殘渣用950 mL/L 乙醇、丙酮、乙醚依次洗滌，干燥[13]。

2.4.4 樣品含量測定

將所得各粗多糖加蒸餾水定容至50 mL，再精密吸取1 mL加蒸餾水定容至25 mL得樣品溶液。精密吸取1 mL置于10 mL試管中[14]。按2.3.2項(xiàng)下操作，在最大吸收波長下，測定供試液的吸光度值，計算各粗多糖提取率。見表9。

表9 白術(shù)及各炮制品多糖含量測定結(jié)果

通過SPSS相關(guān)性分析，多糖含量與炮制工藝之間P=0.04，呈顯著性。

2.4.5 精密度試驗(yàn)

分別取濃度為0.004 3,0.005 7,0.007 2 g/L葡萄糖對照品溶液，在490 nm波長處測定吸光度，分別連續(xù)測定5次，RSD值均小于3%。結(jié)果表明：該儀器在490 nm下進(jìn)行比色法精密度良好。

2.4.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

分別取白術(shù)生品供試品溶液，按照2.3.1項(xiàng)下方法，在490 nm處波長運(yùn)用比色法分別于0，10，20，30，40，50，60 min后，測定吸光度，其RSD為1.65%。

2.4.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取白術(shù)生品細(xì)粉5份，按照2.3.2項(xiàng)下制備供試品溶液，按照2.3項(xiàng)下方法，在490 nm處波長采用比色法處測定吸光度，RSD為1.64%。

3 討 論

3.1 飲片炮制工藝對相對密度、吸水率、pH值的影響

中藥清炒炮制工藝通過對物性參數(shù)變化的影響而表現(xiàn)為動態(tài)傳遞過程，主成分含量經(jīng)清炒炮制后存在主成分之間的相互轉(zhuǎn)化，物性與炮制工藝之間存在某種傳遞性。炒制火候?qū)Π仔g(shù)藥材的外觀性狀和內(nèi)在質(zhì)量有顯著影響。隨著火候的加深，白術(shù)相對密度逐漸下降，飲片吸水率呈上升趨勢，細(xì)粉吸水率呈下降趨勢，由此可得出：炮制改變了白術(shù)飲片內(nèi)部結(jié)構(gòu)，炮制程度越深，內(nèi)部結(jié)構(gòu)改變程度越大，使得飲片內(nèi)部形成空腔越多。飲片大小影響其表面積。飲片被粉碎后，比表面積增大，對水的吸附性增加，對吸水率影響大，因此，有必要通過吸水率這一物性指標(biāo)對清炒法進(jìn)行數(shù)字化評價。白術(shù)pH值呈下降趨勢，證明隨著火候加深，藥材中離子解離度變大，電離出H+增多。通過測定藥材的pH值，可對中藥方劑學(xué)和藥物制劑學(xué)的研究提供某些參考[14]。

3.2 飲片炮制工藝對氧化值變化的影響

揮發(fā)油為白術(shù)的主要活性成分，油脂經(jīng)高溫和氣流的作用會加速氧化，形成小分子有機(jī)酸。經(jīng)不同炮制方法的白術(shù)揮發(fā)油含量會發(fā)生變化，飲片回流時有機(jī)酸會被氣流帶入裝有冷凝水的回流管中。利用油脂中的過氧化物與試劑發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，可測定油脂中的過氧化值。白術(shù)炒黃氧化值最大，可推測經(jīng)炮制(炒黃)揮發(fā)油成分開始不穩(wěn)定，大量油脂成分變成小分子有機(jī)酸，經(jīng)回流被帶出，回流液中含大量揮發(fā)性成分，氧化值上升；當(dāng)溫度繼續(xù)升高(炒焦、炒炭)，白術(shù)揮發(fā)性成分開始大量流失，飲片中小分子酸成分也減少，回流液中含有的有機(jī)酸降低，使其氧化值降低。這與炒白術(shù)可緩和其辛燥之性相吻合，亦與后術(shù)炒焦后有“焦香健脾”作用相一致。測定發(fā)現(xiàn)炒白術(shù)的氧化值較生品降低，從美拉德反應(yīng)來看，白術(shù)炒焦產(chǎn)生了令人增加食欲的愉悅香味[15]。

3.3 飲片炮制工藝對多糖含量的影響

多糖是由10個以上的單糖分子通過糖苷鍵聚合而成的，是分子量較大的多聚物。經(jīng)炒制后白術(shù)多糖含量顯著升高(除炒炭下降外)，說明還原糖含量隨炮制程度的加深含量增多，水溶性糖隨炮制程度加深含量減少。白術(shù)物料基礎(chǔ)為葡萄糖分子，受熱之后動態(tài)轉(zhuǎn)化，分子重新排列組合后可以相互轉(zhuǎn)化。同時隨著炒制程度的加大，揮發(fā)油的散失也在加大[16]。有研究表明土炒對白術(shù)多糖含量影響無統(tǒng)計學(xué)意義；白術(shù)炮制過程中多糖含量增加主要由炒制引起，輔料土無實(shí)質(zhì)作用[17]。炮制是中醫(yī)藥的特色，經(jīng)炮制產(chǎn)生的多種飲片規(guī)格在臨床的功用側(cè)重不同，其機(jī)制尚不完全清楚。清炒炮制不僅可以通過指標(biāo)性成分判斷飲片是否合格達(dá)標(biāo)，同時也可以通過物性指標(biāo)來判斷。炮制程度與指標(biāo)性成分之間具有一定的關(guān)聯(lián)性，間接影響飲片的臨床療效[18]。