張 健，張蒙蒙

(開封市食品藥品檢驗(yàn)所，河南 開封475002 )

黃連降糖片為開封市某醫(yī)院自制制劑，由黃連、酒大黃、知母、麥冬、地黃、牡丹皮組成，具有清熱生津、降糖止渴的功效，主治熱盛津傷型消渴病。方中黃連清熱保津、瀉火解毒，是為君藥，其有效成分為小檗堿。已有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究表明作為異喹啉類生物堿，小檗堿具有多種藥理作用[1]，可通過促進(jìn)胰島B細(xì)胞修復(fù)作用、拮抗腎上腺素、抑制糖異生、促進(jìn)葡萄糖酵解、降低胰高血糖素等途徑降低血糖，從而改善高血糖癥，改善胰島素耐受性[2]；可降低血清三酰甘油、膽固醇、極低密度脂蛋白，升高SOD活性、抑制醛糖還原酶活性等[3]。 現(xiàn)用質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)為醫(yī)院自定標(biāo)準(zhǔn)，標(biāo)準(zhǔn)中無含量測(cè)定項(xiàng)。為更好控制其質(zhì)量、完善標(biāo)準(zhǔn)，本研究采用高效液相法對(duì)制劑中鹽酸小檗堿進(jìn)行了含量測(cè)定[4-5]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本法簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確，可用于該制劑的含量測(cè)定。

1 藥品、試劑與儀器

黃連降糖片，0.3 g/片，60片/瓶，編號(hào)001，002，003，由開封市某醫(yī)院提供。鹽酸小檗堿對(duì)照品，含量為86.8%，由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供，批號(hào)110713-201613；乙腈、甲醇，均為色譜純，北京迪瑪歐泰科技發(fā)展中心產(chǎn)品；磷酸二氫鉀，分析純?cè)噭?，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；庚烷磺酸鈉，分析純?cè)噭旖蚴泄鈴?fù)精細(xì)化工研究所生產(chǎn)；磷酸，分析純?cè)噭?，洛?yáng)昊華化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；水為純化水，本實(shí)驗(yàn)室自制。戴安U-3000型高效液相色譜儀，美國(guó)賽默飛世爾公司產(chǎn)品；UVIKON-XL紫外分光光度計(jì)，法國(guó)SECOMAM公司電子天平，量程0.01 mg～220 g，德國(guó)Sartorius CP225D產(chǎn)品；C18色譜柱(Agela Promsil，4.6 mm×250 mm，5 μm)，天津博納艾杰爾科技有限公司產(chǎn)品。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

按照文獻(xiàn)[6-7]操作。色譜柱為Agela C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相為乙腈-磷酸鹽緩沖液[0.05 mol/L 磷酸二氫鉀溶液和0.05 mol/L庚烷磺酸鈉溶液(1∶1)，含0.2%(L/L)三乙胺，用磷酸調(diào)pH值至3.0](41∶59)，流速1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)263 nm，柱溫35.0 ℃，進(jìn)樣量20 μL。理論塔板數(shù)按鹽酸小檗堿峰計(jì)算應(yīng)不低于3 000。對(duì)照品、陰性對(duì)照品和供試品色譜圖見圖1 。

1.鹽酸小檗堿；A.對(duì)照品; B.缺黃連陰性對(duì)照品; C.供試品圖1 對(duì)照品、陰性對(duì)照品和供試品的HPLC色譜圖

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取鹽酸小檗堿對(duì)照品23.87 mg，置25 mL量瓶中，加沸水溶解，放冷至室溫，加水稀釋至刻度，搖勻，制成0.954 8 g/L的對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密量取該儲(chǔ)備液1 mL，置25 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，即得含量為38.19 mg/L的對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備

取供試品10片，精密稱定，研細(xì)，精密稱取細(xì)粉0.30 g(約相當(dāng)于1片)，置50 mL量瓶中，加甲醇約10 mL，超聲處理并用甲醇稀釋至刻度，搖勻，精密量取1 mL，置25 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，作為供試品溶液。

2.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取2.2.2項(xiàng)下供試品溶液，于制備完成后0，1，2，4，6，8，12，24 h分別進(jìn)樣20 μL，結(jié)果峰面積RSD=0.6%(n=8)。結(jié)果表明:供試品溶液在室溫24 h內(nèi)穩(wěn)定性較好。

2.4 線性關(guān)系考察

分別精密量取對(duì)照品溶液2，5，10，20，30，40 μL，按上述色譜條件進(jìn)行分析，以對(duì)照品進(jìn)樣量(X，mg/L)對(duì)峰面積(Y)作線性回歸，回歸方程為：Y=82.40X-0.035(R=0.999 5)。結(jié)果表明：鹽酸小檗堿在0.076～1.528 μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批樣品(批號(hào)001)，按2.2.2項(xiàng)下方法制得供試品溶液5份，分別測(cè)定鹽酸小檗堿含量，平均含量為34.77 mg/片，RSD為0.6%。結(jié)果表明：本方法重復(fù)性良好。

2.6 精密度試驗(yàn)

取對(duì)照品溶液，按2.1 色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6針，以鹽酸小檗堿峰面積計(jì)算RSD為0.1%。結(jié)果表明：儀器精密度良好。

2.7 加樣回收率試驗(yàn)

稱取已知含量的樣品(批號(hào)001，測(cè)得含鹽酸小檗堿34.77 mg /片)細(xì)粉6份，每份15 mg，分為3組，每組2份；置10 mL容量瓶，每組分別精密量取對(duì)照品儲(chǔ)備液(0.954 8 g/L)1.5 ，1.8 ，2.0 mL，加甲醇適量，超聲處理并用甲醇稀釋至刻度，搖勻；精密量取1 mL，置25 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，作為加樣回收供試品溶液；按2.1項(xiàng)下條件測(cè)定，結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.8 樣品含量測(cè)定

分別精密量取3批樣品，按供試品溶液制備方法制備溶液，分別進(jìn)樣20 μL，測(cè)定鹽酸小檗堿含量，結(jié)果見表2。

表2 樣品含鹽酸小檗堿測(cè)定結(jié)果

3 討 論

筆者在選擇提取溶劑時(shí)，根據(jù)鹽酸小檗堿性質(zhì)，比較了甲醇、80%甲醇、50%甲醇和水，因甲醇提取效果較好，回收率高，確定其為提取溶劑。在選擇檢測(cè)波長(zhǎng)時(shí)，取鹽酸小檗堿對(duì)照品溶液，在200～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描，結(jié)果在263 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，故選擇263 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。在選擇流動(dòng)相時(shí)，分別以甲醇-水 (45∶55)、乙腈-0.05%磷酸水溶液(30∶70)、乙腈-磷酸鹽緩沖液[0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液和0.05 mol/L庚烷磺酸鈉溶液(1∶1)，含0.2%三乙胺，用磷酸調(diào)pH值至3.0](41∶59)為流動(dòng)相對(duì)樣品進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)使用乙腈-磷酸鹽緩沖液(41∶59)為流動(dòng)相時(shí)，色譜峰的分離度大于1.5，峰形較好，理論塔板數(shù)以鹽酸小檗堿峰計(jì)算不低于3 000，故以此為流動(dòng)相。