趙振山, 李海洋，趙振興，代 岱，郝孟輝

目前，肺癌已成為中國(guó)發(fā)病率最高的癌癥，病死率位居惡性腫瘤第一位[1]。肺癌大多發(fā)生于中老年人，但隨著煙草暴露、空氣污染、職業(yè)暴露、肺部疾病史、家族史等情況，逐年呈低齡化趨勢(shì)發(fā)展[2，3]。目前，肺癌5年生存率依舊較低，預(yù)后較差[4，5]，臨床缺乏較高靈敏度和特異度的早期篩查手段。腫瘤蛋白53(protein 53，p53)作為腫瘤抑癌基因之一，可調(diào)節(jié)一系列靶基因的活性，影響細(xì)胞生物學(xué)特性，參與眾多腫瘤發(fā)展進(jìn)程[6- 8]。信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子(signal transducer and activator of transcription，STAT)家族是一組介導(dǎo)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子[9]。臨床已有研究，STAT3過度激活或表達(dá)介導(dǎo)多種惡性腫瘤，具有抑制其增殖和凋亡能力[10]。本研究旨在探討p53調(diào)控信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子3(STAT3)信號(hào)通路在肺癌中的表達(dá)及其對(duì)肺癌增殖及凋亡的影響，從而驗(yàn)證p53作為肺癌治療的候選靶點(diǎn)的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549(購(gòu)自美國(guó)模式菌種收集中心)；洛斯維·帕克紀(jì)念研究所(RPMI)-1640培養(yǎng)液(invitrogen，gaitherburg，MD，USA)；CO2培養(yǎng)箱(美國(guó)Forma公司)；p53 siRNA(上海吉瑪公司，中國(guó))；Opti-MEM、lipo2000試劑(Invitrogen公司，USA)；蛋白酶抑制劑混合物(Roche公司，瑞典)；聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene difluoride，PVDF)購(gòu)自(Amersham pharmacia biotech公司)；鼠抗人p53、STAT3(購(gòu)自艾博抗貿(mào)易有限公司)；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8(CCK-8)試劑盒(Dojindo 研究所，日本)；自動(dòng)酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(上海酶聯(lián)生物科技有限公司)；FACS Calibur流式細(xì)胞儀分析(BD公司，USA)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人肺癌細(xì)胞系培養(yǎng)于37 ℃、5%CO2、濕度95%的CO2培養(yǎng)箱。細(xì)胞傳代貼壁率應(yīng)達(dá)90%。磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer solution，PBS)沖洗2次，0.25%胰酶消化，吹打成單細(xì)胞懸液。

1.2.2 細(xì)胞分組及轉(zhuǎn)染 細(xì)胞分組：空白對(duì)照組(不轉(zhuǎn)染任何序列)、陰性對(duì)照組[轉(zhuǎn)染無義小干擾RNA(small interference RNA，siRNA)對(duì)照，用于做p53的對(duì)照]、p53 siRNA組(轉(zhuǎn)染p53 siRNA)、p53 siRNA+STAT3 siRNA組(同時(shí)轉(zhuǎn)染p53 siRNA和STAT3 siRNA)。吸取15 μl(50 μmol/L)siRNA，加入100 μl Opti-MEM中，加入lipo2000試劑進(jìn)行稀釋并混勻，靜置5 min，siRNA與lipo2000混合，室溫20 min。加入800 μl無血清培養(yǎng)液，將混合物加到細(xì)胞中。細(xì)胞培養(yǎng)6 h，更換全新培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)染48 h，收獲細(xì)胞。

1.2.3 Western Blot檢測(cè)p53、STAT3表達(dá) 取細(xì)胞，加蛋白裂解液，靜置冰上30 min。4 ℃，1200 r/min，離心10 min，取上清液分裝于離心管，-20 ℃保存。電泳80 V轉(zhuǎn)120 V，電泳至溴酚藍(lán)達(dá)凝膠底邊。濕轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)移到PVDF膜。取PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉。加入一抗(鼠抗人p53，STAT3)，4 ℃過夜，Tris緩沖鹽水-Tween(TBST)緩沖液洗3次，每次10 min，加入二抗，室溫旋轉(zhuǎn)孵育1 h，TBST洗3次；以β-actin為對(duì)照，進(jìn)行化學(xué)發(fā)光，X線片壓片、顯影、定影，數(shù)據(jù)分析。

1.2.4 細(xì)胞增殖試驗(yàn) 新鮮完全培養(yǎng)液中重懸，接種于 96 孔板中，每組 5 個(gè)重復(fù)孔。使用 CCK-8 試劑盒，按說明書操作實(shí)驗(yàn)流程。于轉(zhuǎn)染后 0、24、48、72 和 96 h 時(shí)，選擇波長(zhǎng)為450 nm處測(cè)定各孔的吸光度(D)值。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)AV-PI雙染法檢測(cè)A549細(xì)胞凋亡水平 利用siRNA對(duì)A549細(xì)胞中p53和STAT3進(jìn)行敲減，于48 h獲待測(cè)細(xì)胞，制成單個(gè)細(xì)胞懸液，收集細(xì)胞沉淀，加入200 μl染液[1 ml 結(jié)合緩沖液 + 50 μl 膜聯(lián)蛋白Ⅴ(Annexin V)]；將樣品置于冰上染色30 min，后采用FACS Calibur流式細(xì)胞儀分析。

1.2.6 細(xì)胞劃痕試驗(yàn) 待細(xì)胞融合度為 80%～90% 時(shí)，于培養(yǎng)板各孔底部使用 200 μl 微量移液器滴頭劃?rùn)M線傷口。隨后使用PBS 清洗1次，更換無血清培養(yǎng)液，使用倒置顯微鏡觀察不同時(shí)間(0、12、24、36 h )劃痕情況并拍照。

1.2.7 Transwell小室遷移實(shí)驗(yàn) 備置單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度(1×105/ml)。上室滴入100 μl細(xì)胞懸液，下室加入500 μl含10%胎牛血清完全培養(yǎng)液， 37 ℃,5% CO2飽和濕度進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。20～22 h后終止培養(yǎng)取出，洗滌上室未穿透膜細(xì)胞(×3)，甲醇固定15 min。蘇木精(HE)染色10 min，風(fēng)干，中性樹膠封片。正置熒光顯微鏡觀察細(xì)胞穿膜數(shù)(5個(gè)高倍視野)。

2 結(jié) 果

2.1 Western blot檢測(cè)p53，STAT3蛋白的表達(dá) p53蛋白表達(dá)在p53 siRNA組、p53 siRNA+STAT3 siRNA組明顯上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.340)。p53siRNA組、p53siRNA+STAT3 siRNA組均明顯抑制了 STAT3的表達(dá)，與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖1)?？瞻讓?duì)照組和陰性對(duì)照組STAT3蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.364)。

圖1 p53和STAT3電泳條帶

2.2 p53靶向STAT3對(duì)A549生長(zhǎng)的影響 CCK8檢測(cè)結(jié)果表明，與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組比較， p53 siRNA組，48、72、96 h細(xì)胞生長(zhǎng)速度增長(zhǎng)明顯，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與p53 siRNA組相比，p53 siRNA+STAT3 siRNA組利用siRNA敲減STAT3后，48、72、96 h細(xì)胞生長(zhǎng)速度顯著受到抑制，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表1)。

時(shí)間空白對(duì)照組陰性對(duì)照組p53siRNA組p53 siRNA+STAT3 siRNA組0 h0.245±0.0080.240±0.0050.518±0.0070.231±0.00624 h0.288±0.0090.281±0.0100.576±0.0110.267±0.00948 h0.574±0.0090.568±0.0090.832±0.006①0.313±0.010②72 h0.858±0.0110.851±0.0101.415±0.014①0.583±0.012②96 h1.220±0.0121.215±0.0131.611±0.010①0.755±0.010②

注：與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組比較，①P<0.05；與p53 siRNA組比較，②P<0.05

2.3 p53表達(dá)水平改變后細(xì)胞各項(xiàng)能力的對(duì)比

2.3.1 流式細(xì)胞術(shù)AV-PI雙染法檢測(cè)p53對(duì)A549細(xì)胞的影響 流式細(xì)胞術(shù)AV-PI雙染法檢測(cè)結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染p53的siRNA 48 h后， p53 siRNA組、p53 siRNA+STAT3 siRNA組A549細(xì)胞的凋亡率明顯高于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表2)。

2.3.2 p53表達(dá)水平改變后細(xì)胞遷移能力的影響 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組比較，p53 siRNA組和p53 siRNA+STAT3 siRNA組p53過表達(dá)后A549細(xì)胞的遷移速度均呈顯著上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表2)；空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組細(xì)胞遷移速度相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.770)。

2.3.3 p53表達(dá)水平改變后細(xì)胞侵襲能力的影響 Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：p53過表達(dá)后，空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組比較，組間穿膜細(xì)胞數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.517)，p53 siRNA組和p53 siRNA+STAT3 siRNA組A549細(xì)胞的穿膜細(xì)胞數(shù)較空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組明顯增多，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表2)。

組別凋亡率(%)遷移速度(μm/h)穿膜細(xì)胞數(shù)(n)空白對(duì)照組7.33±0.4330.10±6.2743.00±6.45陰性對(duì)照組7.65±0.43029.31±5.6341.15±6.06p53 siRNA組17.91±0.67①55.16±6.50①58.23±7.12①p53 siRNA+STAT3 siRNA組22.51±0.56①63.30±5.98①68.23±7.14①

注：與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組比較，①P<0.055

3 討 論

目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)肺癌的治療研究逐漸向研發(fā)新的治療靶點(diǎn)與利用多種免疫靶向治療結(jié)合多種小分子靶向治療等模式發(fā)展[11]。已有研究人員從各個(gè)角度研究影響A549細(xì)胞的增殖、遷移、凋亡及侵襲的復(fù)雜機(jī)制[12]，并發(fā)現(xiàn)許多種基因與A549細(xì)胞有密切關(guān)系。其中p53就是一種真正的原癌基因，在刺激性環(huán)境下，p53表達(dá)的上調(diào)可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。

p53基因的表達(dá)一般受轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后兩種水平調(diào)控，其表達(dá)一般較低，而經(jīng)刺激后水平顯著上升。異常p53表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞周期失控，促進(jìn)某些癌基因激活，使細(xì)胞無限增長(zhǎng)，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤侵襲能力增加。同時(shí)，在多種腫瘤細(xì)胞中，STAT3在缺氧條件下活化，刺激多種促腫瘤血管生成因子的形成，例如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)，從而促進(jìn)腫瘤血管的生長(zhǎng)，導(dǎo)致癌細(xì)胞的生長(zhǎng)[13,14]。STAT3的活化能夠增強(qiáng)免疫逃逸，提示我們抑制STAT3活性(表達(dá))可抑制免疫逃逸，增強(qiáng)機(jī)體抗腫瘤的免疫功能。下調(diào)STAT3的表達(dá)可顯著抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)[15]。

本研究設(shè)計(jì)構(gòu)建了STAT3 siRNA片段和p53 siRNA片段，通過流式細(xì)胞術(shù)AV-PI雙染法、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，p53 siRNA組和p53 siRNA+STAT3 siRNA組A549細(xì)胞各項(xiàng)能力與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明肺癌中p53呈高表達(dá)，且與STAT3表達(dá)呈負(fù)相關(guān)， p53通過靶向STAT3，下調(diào)其表達(dá)，可促進(jìn)A549細(xì)胞生長(zhǎng)與侵襲，抑制其凋亡。推測(cè)STAT3可在某種機(jī)制下對(duì)腫瘤生長(zhǎng)產(chǎn)生干預(yù)效應(yīng)，可作用于肺癌的變化發(fā)展上。文獻(xiàn)[6]在研究中指出，STAT3能夠激活抗凋亡基因[如B淋巴細(xì)胞瘤-2基因(B-cell lymphoma，Bcl-2)]和細(xì)胞周期控制基因[如G1/S-特異性周期蛋白-D1(cyclinD1)]等基因的表達(dá)，進(jìn)而影響腫瘤細(xì)胞周期變化，創(chuàng)造利于腫瘤生長(zhǎng)的環(huán)境[16]。

國(guó)外研究證實(shí)，STAT3在膽管癌的發(fā)生發(fā)展中可成為p53的直接靶點(diǎn)，p53功能的喪失可激活JAK2-STAT3信號(hào)傳導(dǎo)，從而促進(jìn)腫瘤基質(zhì)的改變和腫瘤生長(zhǎng)及對(duì)吉西他濱的抵抗[17]，可進(jìn)一步推測(cè)p53通過靶向調(diào)控STAT3表達(dá)產(chǎn)生相關(guān)協(xié)同效應(yīng)而導(dǎo)致肺癌細(xì)胞的增殖、遷移及凋亡。結(jié)果提示，通過探究p53靶向STAT3的機(jī)制及潛在作用，可有助于我們尋找減緩腫瘤生長(zhǎng)、改變細(xì)胞浸潤(rùn)的治療方案。

綜上所述，p53在肺癌中高表達(dá)，與STAT3蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，從而促進(jìn)A549細(xì)胞生長(zhǎng)與侵襲，抑制其凋亡。因此，p53可能作為一種新的肺癌治療靶向分子，為惡性腫瘤的診斷及預(yù)后提供了一個(gè)新的渠道。但本研究只進(jìn)行了體外細(xì)胞系的驗(yàn)證，下一步需增加體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證。另外p53是否還會(huì)通過其他途徑影響肺癌的增殖、遷移和凋亡，還需進(jìn)行深入地研究。