黃 凱，王大寧，彭 朋，秦永生，李學(xué)恒

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)是特發(fā)于結(jié)腸的慢性非特異性炎性反應(yīng)，屬消化系統(tǒng)常見病，其病程較長且易復(fù)發(fā)，可使患者生活質(zhì)量明顯下降。UC在歐美國家較為常見，近年來在我國的發(fā)病率也呈持續(xù)上升趨勢，目前臨床上尚無根治UC的藥物和方法，且易復(fù)發(fā)。因此，探索作用持久且不良反應(yīng)小的藥物及非藥物治療手段與有效的預(yù)防策略勢在必行[1]。目前已證實(shí)，運(yùn)動(dòng)是防治多種慢性病(肥胖、糖尿病、高血壓等)的重要手段，同時(shí)也是臨床治療的有益補(bǔ)充。前期的研究發(fā)現(xiàn)，中低強(qiáng)度持續(xù)有氧運(yùn)動(dòng)(continuous aerobic training，CAT)可減輕緩解期UC患者及UC小鼠的臨床癥狀并降低炎性反應(yīng)[2，3]。高強(qiáng)度間歇運(yùn)動(dòng)(high-intensity interval training，HIIT)是近年來新興的一種運(yùn)動(dòng)模式，與傳統(tǒng)CAT相比，具有省時(shí)有效等特點(diǎn)。Ploeger等[4]以克羅恩病(與UC同屬炎性反應(yīng)性腸病)患者為受試對象，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HIIT并未顯著上調(diào)血漿炎性反應(yīng)因子水平，且患者并無不良反應(yīng)，初步證實(shí)了HIIT的安全性，然而長期HIIT對UC的作用尚未明確。本研究旨在探討8周HIIT預(yù)適應(yīng)對葡聚糖硫酸鈉(dextran sulfate sodium，DSS)誘導(dǎo)C57BL/6小鼠實(shí)驗(yàn)性UC臨床癥狀和炎性反應(yīng)的影響，為制定針對UC的最佳運(yùn)動(dòng)處方提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 45只8周齡雄性C57BL/6小鼠，體重18～20 g，購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。分籠飼養(yǎng)(5只/籠)，自由進(jìn)食水。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物適應(yīng)1周后將其隨機(jī)分為3組，安靜對照組(rest control，RC)、安靜造模組(rest model，RM)和運(yùn)動(dòng)造模組(exercise model，EM)，每組15只。

1.2 干預(yù)方法 RC組安靜飼養(yǎng)8周后自由飲用蒸餾水7 d；RM組安靜飼養(yǎng)8周后自由飲用3.5% DSS溶液(w/v)7 d進(jìn)行UC造模；EM組進(jìn)行8周HIIT后行UC造模(造模方法同RM組)。EM組運(yùn)動(dòng)預(yù)適應(yīng)方案為：先進(jìn)行5 min跑臺(tái)熱身運(yùn)動(dòng)(10 m/min)，之后以15～28 m/min速度運(yùn)動(dòng)4 min(8周內(nèi)跑速逐漸增加)、間歇2 min為1個(gè)循環(huán)，共完成10個(gè)循環(huán)，5周/次，共8周。

1.3 觀察與評分 (1)疾病活動(dòng)指數(shù)(disease activity index，DAI)評分：每天記錄動(dòng)物體重、大便性狀和便血情況(臨床癥狀)，按參照文獻(xiàn)[5]將上述三個(gè)方面的評分相加后取平均數(shù)作為DAI。(2)動(dòng)物取材：末次實(shí)驗(yàn)結(jié)束后48 h麻醉動(dòng)物，灌腸，取盲腸遠(yuǎn)端至肛門部分結(jié)腸組織，測量其長度。隨后沿腸系膜剪開腸腔，生理鹽水沖洗后留取遠(yuǎn)端結(jié)腸，將組織分為兩部分，一部分制作病理組織切片，另一部分用錫紙包裹投入液氮中并迅速轉(zhuǎn)入-80 ℃低溫冰箱凍存，待測炎性反應(yīng)因子基因表達(dá)。(3)結(jié)腸組織病理學(xué)觀察與評分：取結(jié)腸組織用10%中性甲醛固定，石蠟包埋，5 μm切片后行蘇木精-伊紅(hematoxylin and eosin，HE)染色，中性樹膠封固。于光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行組織病理學(xué)觀察(結(jié)構(gòu)破壞、隱窩丟失狀況、炎性浸潤等)并參照文獻(xiàn)[5]進(jìn)行組織病理學(xué)評分。(4)結(jié)腸炎性反應(yīng)因子mRNA表達(dá)量：利用電動(dòng)勻漿器將結(jié)腸組織勻漿后，使用Trizol試劑盒提取組織總RNA，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)獲得cDNA，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(9600，美國PE)測定結(jié)腸炎性反應(yīng)因子-白細(xì)胞介素1β(interleukin 1β，IL-1β)、IL-6和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factorα，TNF-α)mRNA表達(dá)量，以β-actin作為內(nèi)參基因，各組mRNA相對表達(dá)量以RC組的倍數(shù)表示。

2 結(jié) 果

2.1 樣本量分析 造模期間，EM組拒跑1只，死亡2只，RM組死亡1只，最終樣本量為41只，各組分別為：RC組15只，RM組14只，EM組12只。

2.2 各組體重和DAI評分的變化 體重：造模期間，RC組體重?zé)o顯著性變化(P>0.05)，RM和EM組體重從第5 天開始下降并持續(xù)至第7天，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，EM組體重在第6天和第7天均低于RM組(P<0.05，圖1)。DAI評分：造模期間，RC組DAI評分均為0，第3天開始，RM和EM組DAI評分開始升高并持續(xù)至第7 天，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，EM組DAI評分在第5～7 天高于RM組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖2)。

圖1 3組小鼠造模期體重的變化

與RC組比較，①P<0.05；與RM組比較，②P<0.05

2.3 結(jié)腸長度及組織病理學(xué)觀察 (1)結(jié)腸長度：與RC組[(8.2±1.5)cm]比較，RM組[(7.1±1.3)cm]和EM組[(5.7±1.6)cm]結(jié)腸長度縮短, 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；EM組結(jié)腸長度低于RM組, 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。(2)結(jié)腸組織病理學(xué)觀察與組織病理學(xué)評分：RC組細(xì)胞排列整齊、結(jié)構(gòu)完整、腺體豐富, 無杯狀細(xì)胞缺失及炎性細(xì)胞浸潤；RM組小鼠腸黏膜水腫、細(xì)胞排列紊亂、炎性反應(yīng)細(xì)胞浸潤、杯狀細(xì)胞缺失、潰瘍形成，組織病理學(xué)評分為(2.8±0.6)高于RC組的(0.3±0.1)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；EM組較RM損傷程度加重，組織病理學(xué)評分(3.6±1.0)高于RM和RC組, 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,圖3)。

圖2 各組DAI評分的變化

與RC組比較，①P<0.05；與RM組比較，②P<0.05

圖3 結(jié)腸病理組織HE染色(×200)

2.4 結(jié)腸炎性反應(yīng)因子表達(dá)的變化 與RC組比較，RM和EM各組炎性反應(yīng)因子(IL-1β、IL-6和TNF-α)mRNA表達(dá)量升高(P<0.05)；與RM組比較，EM組IL-1β和TNF-α mRNA表達(dá)量進(jìn)一步上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表1)。

表1 各組結(jié)腸炎性反應(yīng)因子mRNA表達(dá)水平

注：與RC組比較，①P<0.05；與RM組比較，②P<0.05

3 討 論

研究發(fā)現(xiàn)，規(guī)律運(yùn)動(dòng)具有抗炎效應(yīng)，能夠?qū)ρ仔苑磻?yīng)相關(guān)疾病(如肥胖、動(dòng)脈粥樣硬化、哮喘等)產(chǎn)生治療或預(yù)防作用，然而關(guān)于體力活動(dòng)與UC的關(guān)系至今尚無定論。橫斷面調(diào)查發(fā)現(xiàn)，久坐少動(dòng)生活方式是UC的重要危險(xiǎn)因素[6]，但隊(duì)列研究的結(jié)果卻相反。針對緩解期UC患者的臨床研究發(fā)現(xiàn)，傳統(tǒng)CAT能夠緩解患者癥狀或無明顯作用[2, 6，7]，因此針對UC患者特異性運(yùn)動(dòng)處方(運(yùn)動(dòng)方式、運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度、運(yùn)動(dòng)時(shí)間及運(yùn)動(dòng)頻率等)仍未確定。

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)一般采用運(yùn)動(dòng)預(yù)適應(yīng)方案，其機(jī)制在于反復(fù)運(yùn)動(dòng)刺激誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生適應(yīng)性變化，機(jī)體對于隨后的不良應(yīng)激源(生物、物理、化學(xué)、心理、社會(huì)等)耐受性增強(qiáng)。前期的研究證實(shí)，隨意轉(zhuǎn)輪運(yùn)動(dòng)[3, 8](屬CAT模式)可改善實(shí)驗(yàn)性UC模型炎性反應(yīng)與臨床癥狀。HIIT作為一種省時(shí)有效的運(yùn)動(dòng)模式，與CAT相比，其對心肺和代謝系統(tǒng)的影響相似，對骨骼肌的作用更佳，然而HIIT與腸道的關(guān)系鮮有關(guān)注。我們推測，HIIT理應(yīng)對UC產(chǎn)生有益效應(yīng)。本研究以C57BL/6小鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，以DSS為誘導(dǎo)劑成功制作UC模型(即與RC組比較，RM組小鼠結(jié)腸長度縮短，DAI、組織病理學(xué)評分及炎性反應(yīng)因子IL-1β、IL-6和TNF-α表達(dá)量升高)，以跑臺(tái)HIIT為運(yùn)動(dòng)模式，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與RM組比較，EM組結(jié)腸長度縮短，DAI、組織病理學(xué)評分及炎性反應(yīng)因子IL-1β和TNF-α mRNA含量進(jìn)一步上調(diào)，提示8周HIIT預(yù)適應(yīng)加重UC臨床癥狀與炎性反應(yīng)。

Cook等[9]同樣以DSS誘導(dǎo)小鼠UC為模型證實(shí)，隨意轉(zhuǎn)輪運(yùn)動(dòng)減輕而持續(xù)跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)則加重結(jié)腸炎病情。他們認(rèn)為，跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)屬于被動(dòng)運(yùn)動(dòng)，可造成實(shí)驗(yàn)動(dòng)物心理應(yīng)激。Reber等[10]發(fā)現(xiàn)，小鼠接受擁擠應(yīng)激后再飲用DSS溶液進(jìn)行UC造模，使結(jié)腸炎的癥狀進(jìn)一步加重。由此推測，跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)方式造成動(dòng)物慢性心理應(yīng)激是本研究中EM組UC癥狀加重的原因之一。然而Bilski等[11]研究發(fā)現(xiàn)，持續(xù)跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)可減輕三硝基苯磺酸(trinitrobenzenesulfonic acid，TNBS)誘導(dǎo)的大鼠UC臨床癥狀并下調(diào)炎性反應(yīng)因子表達(dá)水平。研究結(jié)果存在差異可能與動(dòng)物種屬及造模方式(DSS vs. TNBS)等因素有關(guān)。

劇烈運(yùn)動(dòng)或力竭運(yùn)動(dòng)可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生暫時(shí)性炎性反應(yīng)并伴隨細(xì)胞因子含量上調(diào)，這一效應(yīng)與運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度和運(yùn)動(dòng)時(shí)間呈劑量-反應(yīng)關(guān)系，因此運(yùn)動(dòng)療法的健康效應(yīng)具有運(yùn)動(dòng)負(fù)荷(運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度×運(yùn)動(dòng)時(shí)間)依賴性，長時(shí)間高強(qiáng)度劇烈運(yùn)動(dòng)可導(dǎo)致胃腸功能紊亂，而中等強(qiáng)度則產(chǎn)生保護(hù)效應(yīng)。針對緩解期UC患者的研究顯示，12周HIIT和CAT均可改善患者運(yùn)動(dòng)能力和生活質(zhì)量，但以HIIT的作用更佳[12，13]，但該研究并未測定炎性反應(yīng)因子水平。本研究中運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度、持續(xù)時(shí)間、完成組數(shù)及運(yùn)動(dòng)頻率均明顯優(yōu)于張艷等[13]的研究，因此運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度過高、持續(xù)時(shí)間過長造成的運(yùn)動(dòng)負(fù)荷過重是UC小鼠病情惡化的另一原因。Moraska等[14]發(fā)現(xiàn)，8周高強(qiáng)度跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)造成健康大鼠腎上腺肥大和胸腺萎縮，提示高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)身體應(yīng)激反應(yīng)，與上述提及的心理應(yīng)激共同作用于機(jī)體，導(dǎo)致免疫-內(nèi)分泌系統(tǒng)功能紊亂，進(jìn)而引起UC小鼠炎性反應(yīng)加重。

此外，與其他組織器官不同，腸道內(nèi)存在多種微生物并外界相通，其特殊的解剖結(jié)構(gòu)決定易受應(yīng)激性損傷[15]，人類腸易激綜合征也證實(shí)了這一點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，腸道微生物多樣性下降是UC的重要發(fā)病機(jī)制[16]。橫斷面研究證實(shí)，規(guī)律有氧運(yùn)動(dòng)能夠增加腸道微生物多樣性，進(jìn)而對多種炎性反應(yīng)性疾病具有預(yù)防及治療作用[17]。Allen等[18]指出，不同運(yùn)動(dòng)方式對腸道菌群的調(diào)控存在顯著差異。隨后的研究進(jìn)一步證實(shí)，UC小鼠被動(dòng)運(yùn)動(dòng)(跑臺(tái))通過上調(diào)腸道上皮細(xì)胞趨化因子配體表達(dá)而促進(jìn)細(xì)菌微生物從腸腔面向黏膜層轉(zhuǎn)移，同時(shí)對巨噬細(xì)胞產(chǎn)生趨化效應(yīng)，進(jìn)而誘導(dǎo)炎性反應(yīng)[9]。因此推測本研究中跑臺(tái)HIIT造成的腸道菌群失衡可能也是UC癥狀惡化的原因之一。

總之，長期HIIT預(yù)適應(yīng)加重DSS誘導(dǎo)UC小鼠臨床癥狀和炎性反應(yīng)，因此HIIT的健康效應(yīng)及安全性尚需更多實(shí)驗(yàn)證實(shí)。