張青霞 吳龍芬 苗貴東

摘 要：從技術(shù)發(fā)展、原理及應(yīng)用等方面進行闡述，并對CRISPR-Cas9應(yīng)用前景進行展望，旨在為農(nóng)作物的基因功能研究提供一定的參考價值。

關(guān)鍵詞：農(nóng)作物；Cas9系統(tǒng)；RNA干擾；人工核酸酶技術(shù)；基因組

文章編號：1004-7026（2019）01-0111-02 中國圖書分類號：D033 文獻標(biāo)志碼：A

Cas9系統(tǒng)是最新發(fā)現(xiàn)的一種可以與分子克隆和PCR等技術(shù)相媲美的、簡單高效的、由RNA指導(dǎo)的第三代核酸內(nèi)切酶技術(shù)，由相關(guān)蛋白、重復(fù)序列和間隔序列交替排列組成，使大部分細菌和古細菌避免受外來核酸、噬菌體入侵的一種獲得性免疫系統(tǒng)。其設(shè)計簡單，成本較低，具有特異性、適用范圍廣、與多位點同時編輯等特點，使研究者實現(xiàn)特定目標(biāo)基因高效精準(zhǔn)的定點敲除、插入和替換[1]，對控制作物重要性狀基因的功能鑒定及遺傳改良具有巨大的應(yīng)用潛力。

目前，農(nóng)作物基因編輯技術(shù)主要有ZFNS、TALEN和CRISPR/Cas系統(tǒng)等，其中Ⅱ型CRISPR相關(guān)系統(tǒng)應(yīng)用最多。Cas9系統(tǒng)首次在人類與動物細胞系中建立，經(jīng)過不斷改造后被廣泛應(yīng)用于多種模式生物（線蟲[2]、果蠅[3]、水稻[4]等）的基因組學(xué)和基因功能等各方面研究中。Cas9系統(tǒng)具有簡單性、高效性和多功能性等特點，成為繼ZFNs和TALENs之后的第三代SSNs技術(shù)。

為順應(yīng)農(nóng)作物全基因組學(xué)、基因功能、基因調(diào)控機制研究及第二代高通量測序技術(shù)的快速發(fā)展，煙草、水稻、玉米等作物的基因組測序已順利完成，為研究者提供比以往更為豐富的遺傳信息庫。利用Cas9系統(tǒng)調(diào)控“產(chǎn)量”相關(guān)性狀基因，產(chǎn)生有益變異，打破產(chǎn)量壁壘，實現(xiàn)對數(shù)量性狀的控制，比直接刪除或失活其編碼蛋白質(zhì)更可觀。因此，開展農(nóng)作物基因功能研究，揭示其遺傳發(fā)育規(guī)律，發(fā)掘和利用遺傳資源，培育高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)、抗病抗蟲的最佳品種，具有重要的科學(xué)意義與巨大的經(jīng)濟效益。

1 農(nóng)作物主要基因編輯技術(shù)

基因組編輯技術(shù)被《Science》評為2012年十大重要科學(xué)進展之一，利用基因組編輯技術(shù)對植物基因進行改造，是進行農(nóng)作物遺傳改良的重要輔助手段。在開展功能基因組分析和反向遺傳學(xué)研究過程中，誕生了基因重組、RNAi干擾、基因敲降和人工核酸酶技術(shù)。目前農(nóng)作物基因編輯技術(shù)主要有轉(zhuǎn)錄水平中的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控技術(shù)RNAi和核酸水平人工核酸酶技術(shù)，當(dāng)前作物在遺傳改良方面應(yīng)用的人工核酸酶技術(shù)主要包括ZFNs、TALEN和CRISPR/Cas系統(tǒng)。

2 農(nóng)作物基因編輯技術(shù)的發(fā)展與建立

2.1 RNA干擾技術(shù)

RNA干擾是指在進化過程中高度保守，由雙鏈RNA誘發(fā)的同源mRNA高效特異性降解的現(xiàn)象，是轉(zhuǎn)錄后基因沉默的機制，在基因功能研究和藥物開發(fā)中具有重要作用。CropDesiRn公司通過RNA干擾技術(shù)，對谷物的個別有益農(nóng)藝性狀基因進行改造，增加谷物的產(chǎn)量，該技術(shù)也被用于改造模式生物秀麗線蟲的基因組。

2.2 人工核酸酶技術(shù)

人工核酸酶技術(shù)是最近幾年發(fā)展起來的一類全新的基因編輯技術(shù)。第一代（ZFNs）是由人工改造應(yīng)用的，含有鋅指結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子和非特異性的核酸內(nèi)切酶FokI的切割結(jié)構(gòu)域組成，組裝昂貴、設(shè)計困難、耗時長等劣勢限制其發(fā)展。第二代（TALENs）是類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域與非特異性的核酸內(nèi)切酶FokI的切割結(jié)構(gòu)域相融合，使蛋白質(zhì)與核苷酸一一對應(yīng)，比ZFNs更易打靶和組裝設(shè)計。Li等在2012年利用該技術(shù)破壞水稻感病基因Os11N3的啟動子序列而提高了水稻的抗病能力。逐步取代ZFNs和TALEN的第三代全新CRISPR/Cas9技術(shù)，只需設(shè)計和目標(biāo)核苷酸對應(yīng)的RNA序列，更易實現(xiàn)多基因編輯優(yōu)勢，廣泛應(yīng)用于生物界各個領(lǐng)域。

1987年日本石野良純[5]在E.coli堿性磷酸酶序列時發(fā)現(xiàn)5個重復(fù)成簇間隔短回文結(jié)構(gòu)的DNA片段，后來Jansen[6]利用生物信息工具對這個片段進行命名并分析功能，直到20年后，Barrangou [7]才首次使用CRISPR-associated（Cas）概念并用實驗證明CRISPR是與細菌免疫功能有關(guān)的結(jié)構(gòu)。CRISPR/Cas9是單個Cas蛋白行使生物學(xué)功能，由成熟的反式激活tracrRNA、Cas基因和CRISPR序列區(qū)組成，其工作原理是crRNA通過堿基配對與tracrRNA結(jié)合形成tracrRNA/crRNA復(fù)合物，引導(dǎo)核酸酶Cas9蛋白在與crRNA配對的序列靶位點處剪切雙鏈DNA對基因組DNA序列進行精準(zhǔn)編輯。

4 CRISPR-Cas9技術(shù)在農(nóng)作物領(lǐng)域的應(yīng)用

采用輔助標(biāo)記選擇并構(gòu)建遺傳圖譜，通過數(shù)量性狀定位尋找農(nóng)作物基因組中的目的基因，該方法育種耗時耗力，且難以鑒定基因功能，但如果將數(shù)量性狀定位與CRISPR/Cas9技術(shù)相結(jié)合，就可以對1個或同時對多個基因功能進行精確編輯并控制，省時省力，在農(nóng)作物品種改良中起到重要作用。高通量二代測序技術(shù)的快速發(fā)展，使得40多種植物基因組（擬南芥和水稻各2.5萬、3～5萬個基因）測序完成[8]，獲得的大量遺傳信息為研究植物適應(yīng)各種生態(tài)環(huán)境提供幫助。聶云夢[9]利用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建NtDXR敲除載體，獲得DXR基因突變的植株能阻斷色素合成，推測該基因參與煙草葉綠素等色素合成。各種生物和非生物脅迫造成產(chǎn)量和品質(zhì)的重大損失，傳統(tǒng)抗病蟲育種主要是利用抗病蟲雜交育種和誘變育種誘發(fā)新的抗病蟲基因，但由于作物遺傳多樣性單一且存在生殖隔離，很難有預(yù)期性狀的突變體，而利用CRISPR/Cas9技術(shù)對植物基因序列進行高效定點剪輯，可以定向育種，培育出高產(chǎn)抗病、抗逆或一些具有特殊應(yīng)用價值的農(nóng)作物。2014年高彩霞課題組[10]就是利用CRISPR/Cas9技術(shù)首次獲得廣譜抗白粉病的六倍體小麥。

隨著作物輕簡化栽培技術(shù)和除草劑的廣泛使用，培育抗除草劑的作物新品種尤為重要。2015年，杜邦先鋒公司利用ALS中特定氨基酸突變提高玉米對乙酰乳酸合酶抑制類除草劑的抗性，是通過Cas9技術(shù)將脯氨酸突變?yōu)榻z氨酸獲得抗氯磺隆玉米突變體。夏蘭琴團隊將ALS編碼區(qū)特定堿基定點替換，使2個氨基酸變異而獲得抗磺酰脲類除草劑的水稻。同時，ENDO也通過類似方法獲得ALS編碼區(qū)W548L和S627I位置處堿基定點替換的水稻突變體，從而提高水稻對乙酰羥酸合酶抑制類除草劑的抗性。最近，SHIMATANI利用CRISPR/Cas9的Target-AID方法將水稻ALS編碼區(qū)的第96位丙氨基酸突變成纈氨酸，獲得抗磺酰脲類除草劑水稻突變體。

總之，通過CRISPR/Cas9系統(tǒng)定點敲除作物抗性負調(diào)控因子基因，或定點修飾抗逆性正調(diào)控基因的啟動子，以增強基因的表達，或?qū)剐韵嚓P(guān)基因編碼區(qū)定點替換改變基因功能，都能在不同程度上改良作物的抗病或抗逆性，是作物抗性分子育種的有效途徑。

5 CRISPR/Cas9技術(shù)在農(nóng)作物領(lǐng)域的應(yīng)用前景

Cas9系統(tǒng)在農(nóng)作物中的應(yīng)用已成為一種趨勢，由于重要農(nóng)藝性狀的不利基因被發(fā)現(xiàn)，Cas9技術(shù)必將在遺傳改良和作物育種上發(fā)揮重大作用。但由于CRISPR技術(shù)存在脫靶效應(yīng)及如何合理設(shè)計sgRNA等限制因素，全基因組篩選工作處于初級階段，有待改善。雖然轉(zhuǎn)基因育種已有多年歷史且在多個國家種植，但令人擔(dān)憂的是轉(zhuǎn)基因的生物安全問題。美國認為基因編輯誘導(dǎo)的突變與自然突變以及物理和化學(xué)誘導(dǎo)突變性質(zhì)相同，即通過CRISPR/Cas9技術(shù)創(chuàng)制的抗褐化雙孢菇不屬于轉(zhuǎn)基因育種。即使存在劣勢，也比其他分子技術(shù)在植物基因功能研究和作物遺傳改良上更有優(yōu)勢。

參考文獻：

[1]景潤春，盧洪.CRISPR/Cas9基因組定向編輯技術(shù)的發(fā)展與在作物遺傳育種中的應(yīng)用[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，49（7）：1 219-1 229.

[2]FriedlandAE，TzurYB，EsveltKM，etal.HeritablegenomeeditinginC.elegansviaaCRISPR-Cas9system[J].Nature Methods，2013，10（8）：741.

[3]AndrewR.Bassett，TibbitC，ChrisP.Ponting，etal.HighlyEfficient Targeted Mutagenesisof Drosophila withthe CRISPR/Cas9System[J].CellReports，2013，4（1）：220-228.

[4]王丹，周美亮，李金博，等.CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)及其在草類植物中的應(yīng)用[J].草業(yè)科學(xué)，2017，34（6）：1 204-1 214.

[5]IshinoY，ShinagawaH，MakinoK，etal.Nucleotidesequenceoftheiapgene，responsibleforalkalinephosphataseisozymeconversioninEscherichiacoli，andidentificationofthegeneproduct.[J].JournalofBacteriology，1987，169（12）：5 429-5 433.

[6]JansenR，vanEmbdenJD，GaastraW，etal.Identificationofanovelfamilyofsequencerepeatsamongprokaryotes[J].OmicsAJournalofIntegrativeBiology，2002，6（1）：23.

[7]BarrangouR，F(xiàn)remauxC，DeveauH，etal.CRISPRProvidesAcquiredResistanceAgainstVirusesinProkaryotes[J].Science，2007，315（5 819）：1 709.

[8]吳健，劉學(xué)，王永紅.植物重要功能基因研究進展及其應(yīng)用[J].生命科學(xué)，2011，23（2）：168-178.

[9]聶夢云，高軍平，羅培，等.基于CRISPR/Cas9技術(shù)的煙草NtDXR基因敲除及功能分析[J].煙草科技，2016，49（6）：1 243-1 249.

[10]柴帆.高彩霞：植物基因“剪刀手”[J].中國農(nóng)村科技，2018（5）：74-76.