何朋杰 崔文艷 何鵬飛 袁海

摘要為了建立簡易、有效的根腫病生防體系，本研究采用澆灌和噴施枯草芽胞桿菌XF1的綠色熒光蛋白標(biāo)記菌株XF1gfp，測定其在大白菜植株內(nèi)的定殖能力，并用野生型菌株XF1發(fā)酵液研究其防治根腫病和挽回產(chǎn)量效果。結(jié)果表明，葉面噴施XF1gfp發(fā)酵液后，標(biāo)記菌在大白菜根、莖、葉等組織內(nèi)的密度呈現(xiàn)出“先上升后下降最后趨于平穩(wěn)”的趨勢，最終穩(wěn)定在約103 cfu/g組織;盆栽試驗結(jié)果表明，與空白對照相比，所有處理發(fā)病率和病情指數(shù)均顯著下降，噴施XF1發(fā)酵液后最佳防治效果為56.4%，澆灌化學(xué)殺菌劑10%氰霜唑懸浮劑2 000倍液及1×107 cfu/mL的XF1發(fā)酵液防效分別為78.6%與70.7%。大田試驗結(jié)果表明，噴施XF1發(fā)酵液后防治效果達(dá)52.6%，與澆灌化學(xué)殺菌劑10%氰霜唑懸浮劑（64.6%）及XF1發(fā)酵液（74.0%）相比無顯著差異。此外，與空白對照、澆灌10%氰霜唑懸浮劑及XF1發(fā)酵液相比，噴施XF1發(fā)酵液后大白菜單株產(chǎn)量分別增加了74.0%、35.1%及23.6%。試驗結(jié)果表明葉面噴施XF1發(fā)酵液是一種有效的防控大白菜根腫病及增產(chǎn)增收的方法。

關(guān)鍵詞根腫病;枯草芽胞桿菌XF1;氰霜唑;病害管理;土傳病害;生物防治

中圖分類號：S 476

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

DOI：10.16688/j.zwbh.2018103

十字花科根腫病是由蕓薹根腫菌Plasmodiophora brassicae Woronin侵染所引起的一種世界性土傳病害，尤其在歐洲、北美和中國的西南、東南及華中地區(qū)危害嚴(yán)重[12]。近年來國內(nèi)根腫病發(fā)病面積急劇增加，嚴(yán)重危害大白菜、油菜等重要蔬菜、油料作物的產(chǎn)量與品質(zhì)[3]，發(fā)生面積占十字花科作物總種植面積的1/3以上，嚴(yán)重發(fā)病區(qū)域損失可達(dá)2/3以上，甚至完全絕收[4]。蕓薹根腫菌屬于活體營養(yǎng)專性寄生菌，休眠孢子在土壤中存活可達(dá)十幾年，田間土壤一旦被污染，就不再適宜種植十字花科作物[5]。在田間環(huán)境下防控根腫病極其困難，培育抗病品種很多時候是對抗根腫病最好的選擇，但是我國主栽大白菜品種對根腫病的抗病性并不理想[6]，化學(xué)防治因其對環(huán)境和農(nóng)產(chǎn)品安全問題難以成為首選，所以生物防治已成為經(jīng)濟(jì)有效的防控手段之一。

枯草芽胞桿菌Bacillus subtilis XF1（CGMCC No.2357）（下稱XF1）分離自根腫病重病田的大白菜根際土壤，對十字花科根腫病有良好的生防效果，應(yīng)用潛力巨大[7]。目前有關(guān)XF1及其他生防菌防治根腫病的主要施用方法是澆灌、浸種和包衣等[2，89]，國內(nèi)外尚無使用葉面噴施生防菌株來防治根腫病這類根部病害的報道。為了研究噴施XF1菌株對根腫病的防治效果及相關(guān)機(jī)制，進(jìn)一步為應(yīng)用提供試驗依據(jù)，本文就葉面噴施后XF1在植株內(nèi)的定殖、盆栽防治根腫病條件優(yōu)化和大田防效驗證進(jìn)行了初步研究。

1材料與方法

1.1材料

供試殺菌劑：10%氰霜唑懸浮劑（科佳），浙江金牛石原化學(xué)有限公司產(chǎn)品。

供試菌株及大白菜：枯草芽胞桿菌 XF1和XF1的綠色熒光蛋白（GFP）標(biāo)記菌株XF1gfp（下稱XF1gfp）均系本實驗室自有知識產(chǎn)權(quán)保存菌株（-80℃）。根腫病樣本來自云南省昆明市阿子營鎮(zhèn)，-20℃保存?zhèn)溆?。對十字花科根腫病高感的大白菜品種‘青島831 種子（生長期60 d）購自昆明市農(nóng)貿(mào)市場。

1.2方法

1.2.1接種體與 XF1 發(fā)酵液的制備

參考McGrann等[10]的方法制備根腫菌休眠孢子懸浮液， 使用磷酸鹽緩沖液（pH 6.2）調(diào)整孢子濃度至1×108個/mL保存于4℃冰箱備用。

分別挑取XF1和XF1gfp單菌落于LB與含10 μg/mL氯霉素的LB液體選擇性培養(yǎng)基中，37℃、170 r/min的條件下振蕩培養(yǎng)48 h，使用涂板梯度稀釋法檢測菌落數(shù)量后調(diào)整至1×108 cfu/mL備用。

1.2.2枯草芽胞桿菌在大白菜根圍和植株內(nèi)的動態(tài)監(jiān)測與回收

挑取XF1gfp單菌落于LB（含10 μg/mL氯霉素）液體選擇性培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)72 h后于12 000 r/min的條件下室溫離心4 min，棄上清收集菌體，使用等體積的無菌雙蒸水重懸菌體，相同條件下再離心1次，棄上清并使用PBS緩沖液（pH 7.0）重懸收集的菌體至1×107 cfu/mL，保存?zhèn)溆谩?/p>

將無菌自然土混勻分裝入21 cm×21 cm的營養(yǎng)缽內(nèi)，將健康飽滿的大白菜種子表面消毒[11]后播種于營養(yǎng)缽中每盆7粒。出苗7 d后，每盆保留長勢一致的大白菜幼苗2株作為試驗材料，分別采用澆灌和噴施的方法接種枯草芽胞桿菌菌體懸浮液。澆灌：每盆均勻澆灌100 mL XF1gfp的重懸液，澆灌時須保持土壤浸潤但不能有水從缽底流出;噴施：先取適量的無菌吸水紙輕柔地包裹住幼苗莖基部至完全覆蓋盆栽土壤，然后用無菌棉球蘸取XF1gfp的重懸液輕輕擦拭大白菜幼苗的全部葉片表面，須完全潤濕但不能有液滴滴下，5 min后小心移除吸水紙。本試驗同時設(shè)立野生型XF1和無菌水兩個處理，每個處理設(shè)置3個重復(fù)。

在處理后1、3、5、7、10、15、25、35、45 d分別取樣，結(jié)合選擇性培養(yǎng)與光電折射儀，采用梯度稀釋涂板法回收監(jiān)測標(biāo)記菌在大白菜的根際、根表、根、莖以及葉的定殖數(shù)量[1213]。

1.2.3盆栽防病試驗

試驗于2015年5月至9月在云南省微生物菌種篩選與應(yīng)用發(fā)酵工程中心室外進(jìn)行。將根腫菌孢子懸浮液拌入無菌土內(nèi)作為盆栽土，孢子終濃度為1×105個/g土，裝入營養(yǎng)缽（21 cm×21 cm）內(nèi)澆足底水，將健康飽滿的大白菜種子表面消毒后播種于上述營養(yǎng)缽中每盆7粒。待大白菜出苗后按照以下6種方式處理：空白對照，每盆澆灌100 mL清水;化學(xué)殺菌劑處理，分別于出苗后7、14 d每盆澆灌100 mL 2 000倍的10%氰霜唑懸浮劑;T1，分別于出苗后1、4、7、10 d每盆澆灌100 mL XF1發(fā)酵液（1×107 cfu/mL）;T2，分別于出苗后1、3、5、7、9 d使用小型噴霧器噴施一定量的XF1發(fā)酵液（1×107 cfu/mL）至幼苗葉片完全潤濕，液滴不下落為宜;T3，分別于1、4、7、10、13 d 噴施XF1發(fā)酵液;T4、T5分別與T2、T3的處理方式類似，但噴施次數(shù)減少為4次。每個處理種植10盆，每盆保苗3株。

出苗42 d后采收大白菜，將所有大白菜小心拔起，用清水沖洗干凈后統(tǒng)計發(fā)病率、病情指數(shù)、防治效果[11]、大白菜植株地上部鮮重，并計算增產(chǎn)率。

大白菜根腫病的分級標(biāo)準(zhǔn)按發(fā)病程度分為0～5級[14]。0級：根部無腫瘤;1級：大部分根系健康，僅側(cè)根有少量細(xì)小腫瘤;2級：肉眼可見主根和側(cè)根腫瘤，但腫瘤小;3級：主根腫瘤明顯但依舊有大量健康側(cè)根存在;4級：主根腫瘤明顯，少量健康側(cè)根存在，地上部出現(xiàn)萎蔫癥狀;5級：整個根系系統(tǒng)嚴(yán)重腫瘤，腫瘤龜裂，地上部分停止生長或枯黃或死亡。

大白菜增產(chǎn)率（%）=[（處理區(qū)地上部鮮重-空白對照區(qū)地上部鮮重）/空白對照區(qū)地上部鮮重]×100。

1.2.4大田防病試驗

試驗于2016年5月至8月在云南省微生物菌種篩選與應(yīng)用發(fā)酵工程中心根腫病重病區(qū)紅土試驗田進(jìn)行，其中5月2日至7月1日為第一季，7月2日至8月31日為第二季。試驗田按面積劃分為20個小區(qū)，小區(qū)面積18 m2，5種處理均勻分布在試驗田內(nèi)。待大白菜出苗后每個小區(qū)保苗約100株，處理方式如下：空白對照和化學(xué)殺菌劑處理與盆栽試驗相同;FT1：同盆栽試驗的T1，每穴澆灌100 mL XL1發(fā)酵液（1×107 cfu/mL）;FT2：同盆栽試驗的T5;FT3，同時澆灌與噴施XF1發(fā)酵液（同F(xiàn)T1與FT2）。出苗60 d后采收大白菜，統(tǒng)計植株發(fā)病率、病情指數(shù)、防治效果[11]、地上部鮮重，并計算增產(chǎn)率。

1.3數(shù)據(jù)分析

運(yùn)用SPSS 22.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，采用Duncan 氏新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性檢驗。

2結(jié)果與分析

2.1XF1gfp在大白菜根系及植株內(nèi)的定殖能力

2.1.1澆灌處理后XF1gfp的定殖能力檢測

在澆灌生防菌XF1gfp 發(fā)酵液1 d后，大白菜的根內(nèi)即可檢測到XF1菌株的存在，密度達(dá)1.7×103 cfu/g根，隨著取樣時間的推移，根內(nèi)菌落密度呈現(xiàn)出“先上升后下降，最后維持穩(wěn)定”的趨勢（圖1）。澆灌標(biāo)記菌后第5天，大白菜根系內(nèi)XF1菌落密度達(dá)到頂峰（104 cfu/g），此后逐漸下降并在澆灌處理10 d后數(shù)量穩(wěn)定在2×103～4×103 cfu/g 左右。在大白菜的根表土壤中，XF1菌株表現(xiàn)出相似的定殖規(guī)律，澆灌處理45 d后菌落定殖密度仍然穩(wěn)定在105 cfu/g土壤。此外，標(biāo)記菌在根表土壤的定殖數(shù)量始終高于根際土且在接種25 d后要高出約一個數(shù)量級，這可能與大白菜的根系分泌物的分泌速率和分布范圍有關(guān)。

2.1.2葉面噴施XF1gfp后定殖能力檢測

葉面噴施XF1gfp懸浮液后，第1天取樣時，大白菜葉片和莖內(nèi)已有標(biāo)記菌的大量侵入（104 cfu/g），但尚未入侵至根內(nèi)（圖2）。此后隨著取樣時間的推移，標(biāo)記菌在大白菜根、莖、葉等組織內(nèi)的密度呈現(xiàn)出“先上升后下降最后趨于平穩(wěn)”的趨勢，最后穩(wěn)定在約103 cfu/g，表明XF1可以通過葉面噴施的方式，進(jìn)入根、莖、葉，且3種組織內(nèi)均保持基本一致的菌量。

2.2XF1對根腫病防治效果

2.2.1盆栽試驗中XF1對根腫病的防治效果

與空白對照相比，澆灌化學(xué)農(nóng)藥10%氰霜唑懸浮劑和XF1發(fā)酵液后，病害的發(fā)病率和病情指數(shù)均顯著下降（P<0.05），防治效果分別達(dá)到78.6%和70.7%，有效地減輕了根腫病的危害。葉面噴施XF1發(fā)酵液后，隨著噴施次數(shù)的增加，病害的發(fā)病率和病情指數(shù)顯著下降，其中連續(xù)噴施5次、噴施間隔為3 d時（T3），根腫病的發(fā)病率、病情指數(shù)和防治效果分別為70.0%、40.7和56.4%，防控效果最為理想，連續(xù)噴施4次噴施間隔為2 d（T4）時，防治效果略有下降，表明連續(xù)多次噴施更有利病害防控。

與空白對照相比，不同處理的大白菜地上部產(chǎn)量總體上與其防病效果呈正相關(guān)，澆灌和噴施XF1菌株的增產(chǎn)效果顯著高于化學(xué)殺菌劑10%氰霜唑懸浮劑處理的產(chǎn)量，其中T2和T3增產(chǎn)55.5%和40.1%。與T2和T3的增產(chǎn)效果相比，10%氰霜唑懸浮劑2 000倍的增產(chǎn)效果只有18.9%，增產(chǎn)效果不明顯。

2.2.2大田試驗中XF1對根腫病的防治效果

大田試驗兩季結(jié)果一致，表明本試驗有較好的重復(fù)性，本文僅展示第一季數(shù)據(jù)。在田間自然環(huán)境條件下，空白對照的發(fā)病率和病情指數(shù)低于盆栽環(huán)境（表2），分別為82.4%和48.9，這可能與田間土壤內(nèi)休眠孢子均勻性低于盆栽有關(guān)。與空白對照相比，澆灌XF1的FT1防效最好，達(dá)74.0%，同時澆灌與噴施XF1的FT3的防效達(dá)71.1%，噴施XF1的FT2的防效為52.6%，澆灌2 000倍10%氰霜唑懸浮劑的防效為64.6%，化學(xué)藥劑與XF1處理間的防效差異不顯著，它們的病情指數(shù)均顯著地低于空白對照。

各處理間大白菜地上部單株鮮重差異顯著（表2）。與空白對照相比，各處理組的大白菜單株鮮重均高于空白對照，其中FT2的單株鮮重最高，為175.1 g，增產(chǎn)74.1%，顯著高于空白對照的100.6 g，高于化學(xué)殺菌劑的129.6 g（增產(chǎn)28.8%），保產(chǎn)增收效應(yīng)明顯。

3討論

枯草芽胞桿菌XF1是一株應(yīng)用潛力巨大的優(yōu)良生防菌株，并且被正式登記為防治根腫病的生防制劑（登記號：PD20152110）。本實驗室的前期工作主要基于該菌株防治根腫病的功能基質(zhì)開發(fā)、可濕性粉劑用于田間澆灌來控制根腫病[8]和防病機(jī)制研究[11，1516]。近年來，大量具有促生效應(yīng)的微生物被開發(fā)成葉面肥制劑用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)[17]，而植物土傳病害防控基本上采用拌種和土壤處理，如撒施或澆灌土壤，采用葉面噴施的方法來防治根部病害還鮮見報道。XF1是一株大白菜內(nèi)生枯草芽胞桿菌，本文采用綠色熒光蛋白標(biāo)記菌株XF1gfp，證明它不僅可以通過澆灌進(jìn)入到大白菜植株體內(nèi)，還可以通過噴施的方式，在24 h內(nèi)自葉表進(jìn)入植株內(nèi)部，沿葉莖根的順序定殖入大白菜的根內(nèi)，在45 d后，細(xì)菌數(shù)量仍能穩(wěn)定在103 cfu/g組織。盡管噴施進(jìn)入到植株根部的菌量比澆灌的少，但澆灌所用的劑量要比噴施大得多。故在大白菜出苗后1 d，隔2～3 d連續(xù)澆灌4次，在盆栽試驗時防效達(dá)70.7%，在大田試驗時防效達(dá)74.0%，均與化學(xué)藥劑10%氰霜唑懸浮劑2 000倍液出苗后7 d與14 d兩次施藥防效相當(dāng);它們的防治效果均高于噴施1×107 cfu/mL的XF1發(fā)酵液至大白菜葉片的處理，噴施防治在盆栽試驗的防效為40.7%～56.4%，在大田的防效達(dá)52.6%。無論是盆栽試驗，還是大田小區(qū)試驗，澆灌和噴施均可以挽回大白菜的產(chǎn)量損失24.44%～74.06%，高于化學(xué)藥劑的18.92%～28.83%，表明XF1具有很好的促生長肥效功能。然而，大田小區(qū)試驗表明，澆灌與噴施同時進(jìn)行時，其防效達(dá)71.1%，與僅澆灌處理防效（74.0%）無顯著差異，未出現(xiàn)雙重疊加防效，這可能與根腫病菌在大白菜胚根伸出后，根腫病菌很快萌發(fā)和侵入根毛，而生防菌從澆灌和噴施到進(jìn)入植株根系內(nèi)需要一定的時間有關(guān)。此外，即使植株組織內(nèi)XF1菌量達(dá)到103 cfu/g時，對于已侵入到根內(nèi)的根腫病病菌控制效果不顯著，即抑制根腫病菌要有足夠的細(xì)菌量才起作用，或者它對根腫病菌的作用主要發(fā)生在根表或未侵入之前，但究竟多少菌量，在寄主體內(nèi)或體外發(fā)生作用？還有待進(jìn)一步研究。

澆灌XF1比僅噴施的效果更好。噴施兼有防病和增加肥效的功能。本文不僅為根腫病的有效防控提供了一種良好方法，同時，也為具有噴灌設(shè)施的十字花科蔬菜基地防控根腫病提供了試驗依據(jù)，可以節(jié)省人力和費(fèi)用，還為其他作物根部難防病害提供一個范例，即減少化學(xué)農(nóng)藥的使用，采用有益內(nèi)生菌，結(jié)合田間噴灌設(shè)施，簡化施用生防制劑程序和勞動強(qiáng)度，亦能起到防病效果。

參考文獻(xiàn)

[1]LDERS W， FRIEDT W， KOPAHNKE D， et al. Auftreten von Plasmodiophora brassicae als erreger der kohlhernie im winterrapsanbau in europa sowie identifizierung， charakterisierung und molekulare kartierungneuer kohlhernieresistenzgene aus genetischen ressourcen[J]. Berichteausdem Julius KühnInstitut， 2010，157： 27.

[2]王靖，黃云，姚佳，等.兩株根腫病生防放線菌的鑒定及其防病效果[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，44（13）：26922700.

[3]REN L， JIA J G， LI M， et al. Distribution of rapeseed clubroot disease in Hubei Province and evaluation of yield loss [J].Agricultural Science & TechnologyHunan，2012，13（4）：775777.

[4]王靖，黃云，李小蘭，等.十字花科根腫病研究進(jìn)展[J].植物保護(hù)，2011，37（6）：153158.

[5]WALLENHAMMAR A C. Prevalence of Plasmodiophora brassicae in a spring oilseed rape growing area in central Sweden and factors influencing soil infestation levels [J]. Plant Pathology， 1996， 45（4）： 710719.

[6]劉勇，黃小琴，柯紹英，等.四川主栽油菜品種根腫病抗性研究[J].中國油料作物學(xué)報，2009，31（1）：9093.

[7]熊國如，張翠英，劉慶豐，等.枯草芽胞桿菌XF1粗蛋白抑菌活性初步研究[J].植物保護(hù)，2009，35（4）：9295.

[8]熊國如.枯草芽孢桿菌XF1防治根腫病及其生防特性研究[D].昆明：云南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2009.

[9]ZHOU L， ZHANG L， HE Y， et al. Isolation and characterization of bacterial isolates for biological control of clubroot on Chinese cabbage[J]. European Journal of Plant Pathology，2014，140（1）：159168.

[10]MCGRANN G R D，GLADDERS P，SMITH J A，et al.Control of clubroot （Plasmodiophora brassicae） in oilseed rape using varietal resistance and soil amendments[J].Field Crops Research，2016，186：146156.

[11]LIU C， YANG Z， HE P， et al.Deciphering the bacterial and fungal communities in clubrootaffected cabbage rhizosphere treated with Bacillus subtilis XF1 [J].Agriculture， Ecosystems & Environment，2018，256：1222.

[12]SHAO J， XU Z， ZHANG N，et al.Contribution of indole3acetic acid in the plant growth promotion by the rhizospheric strain Bacillus amyloliquefaciens SQR9 [J].Biology and Fertility of Soils，2015，51（3）：321330.

[13]何鵬飛.B9601Y2菌株的基因組解析及部分功能驗證[D].武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2014.

[14]MCGRANNG R D， YOXALL T， PATERSON L J， et al. Control of light leaf spot and clubroot in brassica crops using defence elicitors[J]. European Journal of Plant Pathology，2017，148（2）：447461.

[15]LI Xingyu， WANG Yuehu，WU Yixin，et al. ESI LCMS and MS/MS characterization of antifungal cyclic lipopeptides produced by Bacillus subtilisXF1 [J].Journal of Molecular Microbiology and Biotechnology，2012，22：8393.

[16]LI Xingyu， MAO Zichao， WANG Yuehu， et al. Diversity and active mechanism of fengycintype cyclopeptides from Bacillus subtilis XF1 against Plasmodiophora brassicae [J].Journal of Microbiology and Biotechnology， 2013， 23（3）： 313321.

[17]莫定鳴，梁土壽，黃勝，等.微生物菌劑在葡萄生產(chǎn)中的效果研究[J].中國果菜，2017，37（11）：2022.

（責(zé)任編輯：田喆）