王凱娜 戰(zhàn)斌慧 周雪平

摘要近年來，番茄斑萎病毒Tomato spotted wilt tospovirus （TSWV）在我國多個地區(qū)發(fā)生嚴重危害。本研究采用小RNA深度測序和RTPCR相結合的方法對采自黑龍江的番茄病毒病樣品中的病毒進行了鑒定。提取番茄樣品的RNA并構建小RNA文庫進行測序，數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)比對至TSWV基因組的reads數(shù)占比對到病毒核酸總reads數(shù)的92.64%，表明侵染此番茄樣品的病原物可能是TSWV。利用RTPCR方法進一步確定侵染此番茄樣品的病毒為TSWV，將其命名為TSWVHLJ1。對TSWVHLJ1的核苷酸序列進行分析并構建系統(tǒng)進化樹，結果表明TSWVHLJ1與TSWV云南甜椒分離物（TSWVYNgp）的親緣關系最近。介體傳毒試驗表明，西花薊馬可將TSWVHLJ1傳播感染健康寄主植物。摩擦接種試驗表明，TSWV黑龍江分離物能夠侵染本氏煙、辣椒和番茄。這是我國首次報道在黑龍江地區(qū)發(fā)現(xiàn)TSWV的危害。

關鍵詞番茄斑萎病毒;小RNA深度測序;RTPCR檢測

中圖分類號：S 436.412.1

文獻標識碼：A

DOI：10.16688/j.zwbh.2018117

番茄斑萎病毒Tomato spotted wilt tospovirus（TSWV）是番茄斑萎病毒科 Tospoviridae番茄斑萎病毒屬Orthotospovirus的代表種[1]，最早于1919年在澳大利亞被發(fā)現(xiàn)[2]，現(xiàn)已在多個國家和地區(qū)發(fā)生危害。據(jù)報道，TSWV能侵染84科1 090種植物[3]，如番茄、辣椒、茄子、馬鈴薯、花生、萵苣等，其引起的典型癥狀為植株矮小，頂芽下垂，幼嫩葉片扭曲，葉片黃化并出現(xiàn)壞死斑，直至整株枯死[4]。2011年TSWV被列為世界上危害最大的十大植物病毒之一[5]。

TSWV的基因組由S（2.9 kb）、M（4.8 kb）和L（8.9 kb）三條負義單鏈RNA組成[6]，S RNA編碼非結構蛋白NSs，其互補鏈編碼核衣殼蛋白N[7];M RNA編碼非結構蛋白NSm，其互補鏈編碼兩個重要的病毒膜糖蛋白GN和GC;L RNA的互補鏈編碼依賴于RNA的RNA聚合酶RdRp[8]。薊馬是TSWV的傳播介體，傳播TSWV的薊馬種類主要有西花薊馬Frankliniella occidentalis、煙薊馬Thrips tabaci和棕櫚薊馬Thrips palmi等[9]，其中，西花薊馬傳毒效率最高[10]。

RNA沉默（RNA silencing）是植物抵抗病毒侵染的一種適應性防御機制[11]，植物被病毒侵染后會產生大量病毒衍生的小RNA，這些小RNA能特異性降解與其同源的病毒的RNA。利用小RNA深度測序技術能獲得這些小RNA序列，通過組裝這些序列可以獲得植物中病毒全基因組的序列信息，2009年，Kreuze等通過此種方法鑒定和發(fā)現(xiàn)了甘薯中的新病毒[12]。目前，小RNA深度測序技術已廣泛應用于植物病毒的檢測和鑒定。如宋靜靜等利用小RNA深度測序并結合血清學ELISA技術對廣西冬種馬鈴薯病毒進行了鑒定[13];仇心鈺等利用小RNA深度測序調查了我國北方地區(qū)甜菜病毒病[14];蘇秀等利用小RNA深度測序和組裝技術鑒定紫藤花葉病病原[15];王芳等利用小RNA高通量測序技術檢測玉米中的病毒[16]。

1材料與方法

1.1樣品來源

2017年7月于黑龍江省農業(yè)科學院試驗田中采集到兩株疑似感病的番茄植株，番茄葉片表現(xiàn)褪綠、斑駁、黃化、壞死等癥狀（圖1），番茄樣品采集后4℃運輸，拍照后，保存于-80℃冰箱。

1.2小RNA深度測序及生物信息分析

將番茄樣品送到北京諾禾致源生物公司進行小RNA深度測序。試驗流程可分為四步：第一，樣品總RNA的提取和質量檢測。第二，cDNA文庫構建，將樣品中小RNA的3′端和5′端加接頭，經(jīng)RTPCR、cDNA合成、PCR富集，回收得到cDNA文庫;第三，文庫檢測，使用生物信息軟件Qubit 2.0對文庫進行初步定量，使用Agilent 2100檢測文庫的插入片段大小，利用QPCR準確定量;第四，HiSeq/MiSeq測序及分析，用Velvet軟件對文庫中大小為18～26 nt的小RNA進行拼接，拼接結果在NCBI進行BLAST比對分析。

1.3番茄樣品總RNA提取

采用 TRIzol法提取番茄樣品總RNA。將0.1 g番茄樣品放入研缽中，加液氮研磨至粉狀，裝入2 mL離心管，加1 mL TRIzol充分振蕩混勻，室溫靜置5 min;取上清，加300 μL 三氯甲烷，渦旋振蕩15 s，室溫靜置3 min，4℃，12 000 r/min離心15 min;取上清于1.5 mL離心管，加500 μL異丙醇，充分混勻，4℃，12 000 r/min離心15 min，棄上清;加1 mL 75%乙醇清洗沉淀兩次，4℃，7 500 r/min離心5 min，棄上清后室溫干燥，加30 μL RNaseFree water溶解RNA，置于-80℃保存。

1.4番茄樣品全基因組的RTPCR擴增、克隆測序

以番茄樣品的總RNA為模板，根據(jù)小RNA測序拼接得到的病毒核苷酸序列設計TSWV引物，對番茄樣品全基因組序列進行RTPCR擴增（TaKaRa反轉錄試劑盒）。PCR擴增產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測并拍照。將條帶回收連接到pEASYblunt克隆載體（TransGen公司），轉化到大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5α，涂布于含氨芐青霉素的LB平板，37℃倒置過夜培養(yǎng)，挑取若干單克隆，以M13F（5′TGTAAAACGACGGCCAGT3′）和M13R（5′CAGGAAACAGCTATGAC3′）為引物進行菌落PCR檢測，陽性單克隆送到擎科生物公司測序。

1.5番茄樣品TSWV全核苷酸序列的生物信息分析

利用TSWV全基因組核苷酸序列與其他NCBI已公布的TSWV分離物的核苷酸序列進行比對，并從中選取TSWV的代表性同源序列，利用MEGA 7.0軟件以鄰接法（neighborjoining）構建TSWV全基因組核苷酸序列系統(tǒng)進化樹，用Bootstrap檢測各分支的置信度（重復1 000次），并進一步分析。

1.6介體傳毒

將感染TSWV的番茄和辣椒植株分別置于養(yǎng)蟲瓶中，健康西花薊馬由中國農業(yè)科學院植物保護研究所蔬菜害蟲組高玉林老師饋贈，挑取健康的西花薊馬Frankliniella occidentalis 1齡若蟲約200頭放入上述養(yǎng)蟲瓶中，飼養(yǎng)48 h，再用健康豆角飼養(yǎng)至成蟲[17]。分別將6株健康的番茄和辣椒植株與30頭上述西花薊馬成蟲一同置于網(wǎng)籠中。兩周后觀察番茄和辣椒植株的癥狀，并單株提取植物樣品RNA，利用TSWV的特異性引物TSWVM5F（5′ACAAGAGATTGTGTTCACCATC3′）與TSWVM3R（5′ATTCTTGATCTTCAGAGCCACA3′）對番茄和辣椒樣品進行RTPCR檢測。同時，利用TSWV的單克隆抗體對網(wǎng)籠中的西花薊馬進行DotELISA檢測，確定西花薊馬是否帶毒。

1.7汁液摩擦接種

將西花薊馬傳毒成功的番茄和辣椒葉片用液氮冷凍研磨成粉末，加入0.1 mol/L磷酸緩沖液（60 mL 1 mol/L Na2HPO4、40 mL 1 mol/L NaH2PO4）混勻，4℃，8 000 r/min離心3 min，取上清于1.5 mL離心管中，置于冰上。摩擦接種3～5片真葉的本氏煙Nicotiana benthamiana、番茄Lycopersicon esculentum Mill.和辣椒Capsicum annuum L.，摩擦接種磷酸緩沖液的一組為陰性對照，試驗植株在溫度為25℃，光照16 h，黑暗8 h條件的溫室中培養(yǎng)。

2結果與分析

2.1番茄樣品小RNA高通量測序結果及數(shù)據(jù)分析

感病番茄樣品經(jīng)小RNA深度測序共得到14 800 277條reads，經(jīng)質量控制后獲得14 419 893條clean reads，clean reads占總reads數(shù)量的97.43%，其中unique reads 3 258 792條，與GenBank Virus RefSeq核酸數(shù)據(jù)庫比對，比對上TSWV三條鏈的reads數(shù)占比對到病毒數(shù)據(jù)庫的總reads數(shù)的92.64%。

通過分析不同長度的小RNA序列的百分比（圖2），結果顯示番茄樣品的小RNA的長度主要集中在20～24 nt，其中21 nt和22 nt大小的小RNA為主要部分，分別占小RNA總數(shù)的30.34%和25.43%。

2.2番茄樣品全基因組序列的擴增及序列相似性分析

以感病番茄樣品的cDNA為模板，根據(jù)小RNA測序拼接得到的序列設計TSWV引物，對番茄樣品全基因組進行RTPCR擴增，將擴增到的特異條帶割膠回收，進行克隆測序。測序結果在NCBI中進行BLAST比對，利用軟件DNAMAN 8拼接，獲得TSWV番茄分離物的完整基因組序列。序列分析表明，TSWVHLJ1中RNA L、M、S三條鏈的大小分別為8 913 bp、4 772 bp和2 970 bp。TSWVHLJ1 RNA L編碼病毒的RdRp，分子量為331.5 kD;TSWVHLJ1 RNA M編碼病毒的非結構蛋白NSm，分子量為33.6 kD，其互補鏈編碼兩個糖蛋白GN和GC，分子量分別為78.0 kD和58.0 kD;TSWVHLJ1 RNA S編碼非結構蛋白NSs，分子量為52.4 kD，其互補鏈編碼病毒的外殼蛋白N，分子量為28.8 kD。

分別就TSWVHLJ1中的RNA L、M和S核苷酸序列進行序列相似性分析，NCBI BLAST比對結果顯示，TSWVHLJ1 RNA L（GenBank登錄號MG878873）、RNA M（GenBank登錄號MG878874）和RNA S分離物（GenBank登錄號MG878875）分別與TSWV云南甜椒分離物（TSWVYNgp）的RNA L（GenBank登錄號KM657122）、RNA M（GenBank登錄號KM657119）和RNA S（GenBank登錄號KM657116）的核苷酸相似性最高，為99.63%、99.52%和99.73%。

2.3番茄樣品全基因組序列的系統(tǒng)進化樹分析

對TSWVHLJ1全基因組核苷酸序列與世界各地多種TSWV分離物的核苷酸序列進行比對，利用MEGA 7.0軟件以鄰接法（neighborjoining）構建系統(tǒng)進化樹（圖3）。結果表明，TSWVHLJ1 RNA L與我國云南的TSWVYNgp（KM657122）親緣關系最近，與TSWV云南番茄分離物（JF960237）、辣椒分離物（KM657120）、萵苣分離物（JN664254）和煙草分離物（KM657121）在進化樹中歸于一支，親緣關系較近（圖3a）。此外，TSWVHLJ1 RNA L與韓國報道的TSWV甜椒分離物（KY021437）和葎草分離物（LC273305）系統(tǒng)進化關系也較近（圖3a）。TSWVHLJ1 RNA M與多種云南地區(qū)報道的分離物，如甜椒分離物（KM657119）、辣椒分離物（KM657117）、番茄分離物（JF960236）、煙草分離物（KM657118）等在進化樹中歸于一支，親緣關系較近（圖3b）。另外，TSWVHLJ1 RNA M還與韓國報道的甜椒分離物（KY021438）和葎草分離物（LC273306）親緣關系也較近（圖3b）。TSWVHLJ1 RNA S與TSWVYNgp（KM657116）親緣關系最近，與云南地區(qū)的番茄分離物（JF960235）和芹菜分離物（KU356854）等、江蘇地區(qū)的番茄分離物（JF960235）和萵筍分離物（KU976396）及山東的煙草分離物（KM657115）在進化樹中歸于一支，親緣關系較近（圖3c）。綜上，TSWVHLJ1與我國云南的分離物具有最近的親緣關系。

2.4西花薊馬對TSWVHLJ1的傳播

為了探究西花薊馬能否傳播TSWVHLJ1，將6株健康的番茄和辣椒植株分別與30頭飼毒的西花薊馬成蟲一同置于網(wǎng)籠中，以健康薊馬取食的植株作為對照，2周后發(fā)現(xiàn)，飼毒薊馬取食的番茄和辣椒植株呈現(xiàn)黃化、壞死等明顯的病毒侵染癥狀（圖4a）。單株提取番茄和辣椒樣品的RNA，利用TSWVHLJ1的特異性引物TSWVM5F/TSWVM3R對番茄和辣椒植株進行RTPCR檢測，結果顯示12株植株均擴增到約為750 bp的目的條帶，而陰性對照中未檢測得到任何條帶（圖4b）。網(wǎng)籠中西花薊馬的DotELISA檢測結果表明，西花薊馬體內存在TSWV（圖4c）。以上結果證明，西花薊馬能成功獲取TSWVHLJ1并能傳播至健康植株。

2.5TSWVHLJ1的生物學接種試驗

取薊馬傳毒發(fā)病的番茄樣品的汁液摩擦接種本氏煙、番茄和辣椒。結果表明：本氏煙系統(tǒng)葉片在接種后第9天出現(xiàn)明顯的卷曲，第13天葉片呈黃化、壞死癥狀;番茄在第14天呈植株矮小、黃化、壞死斑癥狀，最后整株枯死;辣椒在接種后10 d出現(xiàn)明顯的卷曲，接種后15 d呈黃化、花葉、斑駁癥狀（圖5）。

3結論與討論

番茄斑萎病毒（TSWV）是限制番茄生產的重要因素，TSWV最早于1919年在澳大利亞[3]發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)已在巴西、阿根廷、意大利、法國、美國等[2]多個國家和地區(qū)發(fā)生危害。TSWV于20世紀90年代在我國正式被鑒定[18]，2000年以后，在云南很多作物上發(fā)現(xiàn)該病毒，其危害嚴重。目前，TSWV已從國內最初被發(fā)現(xiàn)的云南[5]、四川[18]等地向國內其他省市快速擴展，北京[19]、山東[20]、寧夏[21]、廣東[22]等多個省市地區(qū)都有發(fā)現(xiàn)，造成重大的經(jīng)濟損失。2017年7月，我們在黑龍江省農業(yè)科學院試驗田采集了表現(xiàn)褪綠、斑駁、黃化、壞死等癥狀的番茄葉片，采用小RNA深度測序和RTPCR結合的方法對樣品進行鑒定，表明侵染此番茄樣品的病原物為TSWV。汁液摩擦接種表明，TSWV黑龍江分離物能夠侵染本氏煙、辣椒和番茄。這是我國首次在黑龍江地區(qū)發(fā)現(xiàn)TSWV的危害。因此，加強進出口檢驗檢疫和國內種苗交易的監(jiān)管和檢測，從而控制病毒的人為傳播對防止番茄斑萎病毒病擴散具有重要意義。

近年來，小RNA深度測序技術在多種植物病原物鑒定方面發(fā)揮了重要作用，特別是對新病毒的鑒定。小RNA深度測序技術擁有傳統(tǒng)檢測方法無法比擬的優(yōu)勢，不需要事先了解病毒分子水平的情況也不需要離體培養(yǎng)。通過小RNA深度測序及拼接技術可以得到病毒的全基因組，對病毒的鑒定和分類有很大幫助，也能了解病毒的流行病學信息。利用TSWVHLJ1的全基因組核苷酸序列與世界各地多種TSWV分離物的核苷酸序列比對并構建系統(tǒng)進化樹，結果表明TSWVHLJ1與我國報道的TSWV云南甜椒分離物親緣關系最近，與TSWV韓國分離物JJ和HJ在進化樹上處于同一大支，親緣關系也比較近。

西花薊馬是TSWV最重要的傳播介體，西花薊馬傳播病毒造成的損失遠大于其自身為害帶來的損失，控制西花薊馬的種群數(shù)量對TSWV的防控極為重要。2003年，西花薊馬在北京被發(fā)現(xiàn)后，迅速擴散并局部暴發(fā)成災，對我國的農作物生產造成極大的危害[23]。TSWV寄主種類多，如番茄、辣椒、茄子、南瓜、黃瓜、絲瓜、菜豆和豇豆等，防治難度大。目前，對TSWV的防治方法主要有[24]：一、治蟲防病，控制TSWV的介體薊馬，定期噴施殺蟲劑，如螺蟲乙酯、乙基多殺菌素、苦參堿、高效氯氰菊酯等[25];二、及時徹底清除田間雜草，嚴格鏟除病苗并進行土壤消毒，不宜在農田周圍種植感病植物，控制感染源;三、噴施抗病毒劑[26]，可通過誘導植物對病毒產生抗性，抑制病毒裝配，鈍化病毒的侵染性等方式起作用;四、種植抗病的品種，如‘Red Defender、 ‘Mt Glory、‘Bella Rosa、‘Quincy等[27]。

參考文獻

[1]LEFKOWITZ E J， DEMPSEY D M， HENDRICKSON R C， et al. Virus taxonomy： the database of the International Committee on Taxonomy of Viruses （ICTV）[J/OL]. Nucleic Acids Research， 2018， 46：D708D717.

[2]BRITTLEBANK C C. Tomato diseases [J]. Journal of the Department of Agriculture in Victoria， 1919， 17： 13481352.

[3]董家紅， 尹躍艷， 徐興陽， 等. 番茄斑萎病毒在云南的發(fā)生為害[C]∥吳孔明：公共植保與綠色防控——中國植物保護學會2010年學術年會.北京： 中國農業(yè)科學技術出版社，2010： 784.

[4]佟愛仔， 趙興能， 孔寶華， 等. 侵染云南煙草的番茄斑萎病毒（TSWV）的RTPCR檢測[J]. 云南農業(yè)大學學報（自然科學版）， 2012， 27（6）： 809814.

[5]SCHOLTHOF K B， ADKINS S， CZOSNEK H， et al. Top 10 plant viruses in molecular plant pathology [J]. Molecular Plant Pathology， 2011， 12（9）： 938.

[6]WHITFIELD A E， ULLMAN D E， GERMAN T L. Tospovirusthrips interactions [J]. Annual Review of Phytopathology， 2005， 43（43）： 459.

[7]ZHANG Z J， WANG D Y， YU C M， et al. Identification of three new isolates of tomato spotted wilt virus from different hosts in China： molecular diversity， phylogenetic and recombination analyses [J]. Virology Journal， 2016， 13（1）： 112.

[8]赫爾 R.馬修斯植物病毒學[M].北京：科學出版社，2007：377.

[9]鄭雪， 劉春明， 李宏光， 等. 云南省紅河地區(qū)傳播番茄斑萎病毒屬病毒的薊馬及其寄主植物種類調查[J]. 中國植保導刊， 2013， 33（3）： 4144.

[10]ZHAO W W， WAN Y R， XIE W， et al. Effect of spinosad resistance on transmission of tomato spotted wilt virus by the western flower thrips （Thysanoptera： Thripidae）[J]. Journal of Economic Entomology， 2016， 109（1）： 6269.

[11]AHMED M S， ADEL A R， KHALID A A. Cucurbit yellow stunting disorder virus and watermelon chlorotic stunt virus induced gene silencing in tobacco plants [J]. African Journal of Biotechnology， 2018， 17（7）： 189197.

[12]KREUZE J F， PEREZ A， UNTIVEROS M， et al. Complete viral genome sequence and discovery of novel viruses by deep sequencing of small RNAs： a generic method for diagnosis， discovery and sequencing of viruses [J]. Virology， 2009， 388（1）： 17.

[13]宋靜靜，蒙姣榮，鄒承武，等.用小RNA深度測序鑒定廣西冬種馬鈴薯病毒[J].中國農業(yè)科學，2013，46（19）：40754081.

[14]仇心鈺， 郝丹丹， 韓成貴， 等. 利用小RNA深度測序對我國北方地區(qū)甜菜病毒病的調查[C]∥吳學宏.植物病理學研究進展——中國植物病理學會青年學術研討會論文選編.北京： 中國農業(yè)大學出版社， 2015： 126.

[15]蘇秀， 徐毅， 陳莎， 等. 利用小RNA深度測序和組裝技術鑒定紫藤花葉病病原[J]. 植物病理學報， 2015， 45（1）： 8892.

[16]王芳， 高正良， 周本國， 等. 利用小RNA高通量測序技術檢測玉米病毒[J]. 植物病理學報， 2017， 47（3）： 422427.

[17]廖倩， 張治軍， 張玉秀，等. 西花薊馬數(shù)量與番茄斑萎病毒發(fā)生流行的關系[J]. 浙江農業(yè)學報， 2015， 27（9）： 16011605.

[18]姚革. 四川曬煙上發(fā)現(xiàn)番茄斑萎病毒（TSWV）[J]. 中國煙草科學， 1992（4）： 24.

[19]李飛， 吳青君， 徐寶云， 等. 北京地區(qū)發(fā)現(xiàn)番茄斑萎病毒[J]. 植物保護， 2012， 38（6）： 186188.

[20]李潔， 遲勝起， 楊勤民， 等. 山東煙臺地區(qū)發(fā)生番茄斑萎病毒病危害[J]. 植物保護， 2017， 43（1）： 228232.

[21]曹金強， 謝學文， 柴阿麗， 等. 番茄斑萎病毒病在寧夏的發(fā)現(xiàn)與防治[J]. 中國蔬菜， 2016（4）： 8789.

[22]饒雪琴， 劉勇， 李媛媛， 等. 廣東番茄上檢測到Tospovirus病毒[J]. 植物病理學報， 2010， 40（4）： 430432.

[23]張璐璐. 防治西花薊馬的球孢白僵菌液固雙相發(fā)酵條件優(yōu)化[D]. 北京：中國農業(yè)科學院， 2016.

[24]吳鑫本.番茄斑萎病毒的防治與檢疫[J]. 現(xiàn)代農業(yè)科學， 2008， 15（11）： 9596.

[25]張潔，陳永對，吳闊，等.6種殺蟲劑對煙田番茄斑萎病毒屬病毒傳毒薊馬的藥效試驗[J].江蘇農業(yè)科學，2014，42（4）：9597.

[26]呂印譜， 丁征宇， 宋寶安， 等. 抗植物病毒劑作用機制研究進展[J]. 中國植保導刊， 2007， 27（10）： 1416.

[27]FUNDERBURK J， REITZ S， OLSON S， et al. Managing thrips and tospoviruses in tomato [J]. Entomology & Nematology， 2015， 18（6）： 785788.

（責任編輯：田喆）