張夢園 潘銳 譚樂勇 郭敏

摘要Fbox蛋白在泛素蛋白酶體途徑（ubiquitinproteasome pathway，UPP）中參與調(diào)控胞內(nèi)蛋白降解、受體識別、信號傳導等生物學過程。本研究從稻瘟病菌中克隆了Fbox基因MoFbr7，序列分析表明，該基因編碼產(chǎn)物具有1個Fbox結(jié)構(gòu)域（N端）和8個連續(xù)的WD40重復序列（C端），在絲狀真菌中高度保守。利用基因敲除方法，獲得4個MoFbr7基因敲除突變體，同時構(gòu)建了回補菌株。表型分析結(jié)果顯示，MoFbr7基因缺失突變體在產(chǎn)孢量、附著胞形態(tài)、原生質(zhì)體釋放、致病性等方面均無異常。突變體在MM、RDC培養(yǎng)基上生長速率下降;對細胞壁脅迫因子CFW（Calcofluor white）、剛果紅敏感。以上結(jié)果表明MoFbr7參與稻瘟病菌的營養(yǎng)生長與細胞壁完整性，為進一步揭示其生物學功能奠定基礎。

關鍵詞稻瘟病菌;Fbox蛋白;基因敲除;功能分析

中圖分類號：S 435.111.41

文獻標識碼：A

DOI：10.16688/j.zwbh.2018135

稻瘟病菌Magnaporthe oryzae是引起稻瘟病的病原菌，對全球水稻產(chǎn)量及品質(zhì)造成嚴重威脅[1]。十幾年來，世界各國科學家已對稻瘟病菌進行了全面系統(tǒng)的研究，為稻瘟病菌作為分子生物學模式生物研究植物病原真菌致病機理打下堅實的基礎[23]。

Fbox蛋白廣泛存在于真核生物中，在細菌和藍藻中也有發(fā)現(xiàn)[4]。該蛋白最先在人體中被發(fā)現(xiàn)并被鑒定為泛素連接酶復合物（Skp1Cullin1Fbox，SCF）的底物識別亞基[5]，在泛素蛋白酶體途徑中不可或缺[6]。有研究表明，SCF復合體可以在植物中合成，可能控制多種代謝途徑中涉及的數(shù)百個底物的穩(wěn)定性[7]。另外，F(xiàn)box蛋白在不同物種中數(shù)量差距懸殊。全基因組重復（whole genome duplication，WGD）可大大增加Fbox基因的數(shù)量?；騺G失在WGD后迅速發(fā)生[8]，不同物種的不同基因丟失率也會導致Fbox基因數(shù)量波動[9]，還有一些植物可能傾向于消除冗余基因，確保在特定環(huán)境條件下生存[10]。Fbox蛋白不僅含有Fbox基序，還包括其他結(jié)構(gòu)域[11]，如WD40（tryptophan aspartic acid 40）重復域、富含亮氨酸的重復域（leucinerich repeat，LRR）、FBD結(jié)構(gòu)域（FBox and BRCT domain）、PAS 結(jié)構(gòu)域（Per Arnt Sim）、PPR結(jié)構(gòu)域（pentatricopeptide repeat）、TUB結(jié)構(gòu)域（tubby）、Kelch 結(jié)構(gòu)域（Kelch repeats）[12]和環(huán)指結(jié)構(gòu)域（really interesting new gene，RING finger）等。

近年來，在真核生物中，已經(jīng)鑒定出許多Fbox基因與細胞凋亡、細胞器的發(fā)生、DNA的轉(zhuǎn)錄和修復、核糖體的合成等生命活動密切相關[1314]。有研究表明，釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae中的Grr1在細胞周期中不可或缺[15]。為探究Grr1在稻瘟病菌中的同源物是否也具有類似功能，本文對稻瘟病菌中同源物MoFbr7且含有Fbox結(jié)構(gòu)域的基因進行初步功能分析，有助于了解MoFbr7對稻瘟病菌的調(diào)控機制。

1材料與方法

1.1材料

稻瘟病菌野生型菌株 Guy11、酵母菌株FY834、大腸桿菌Escherichia coli菌株DH5α、農(nóng)桿菌Agrobacterium tumefaciens菌株EHA105均由本研究室保存。MoFbr7敲除及回補菌株在本研究中獲得，采用濾紙片法保存于-20℃。

水稻感病品種‘CO39和大麥品種‘Golden Promise均保存于本真菌研究室。

1.2MoFbr7蛋白序列的獲得與分析

在數(shù)據(jù)庫（https：∥genome.jgi.doe.gov/programs/fungi/index.jsf）中獲得釀酒酵母菌中Grr1的氨基酸序列，然后在稻瘟病菌中進行Blastp分析，找到22個同源基因。本文將其中一個含有Fbox結(jié)構(gòu)域的基因MGG_06372.6（Fbox/WD repeatcontaining protein 7）命名為MoFbr7，并對其序列保守性進行了分析。對數(shù)據(jù)庫中獲取的MoFbr7氨基酸序列，利用SMART工具對其結(jié)構(gòu)域進行分析。于NCBI網(wǎng)站（http：∥www.ncbi.nlm.nih.gov/）中使用Blastp搜索工具獲得其他同源物序列。用BioEdit和MEGA 7.0軟件對MoFbr7和其他序列進行比對并構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

1.3MoFbr7基因敲除及回補載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化

根據(jù)數(shù)據(jù)庫提供的基因組序列，以稻瘟病菌菌株Guy11的基因組DNA為模板，使用GL547（F）/GL548（R）和GL549（F）/GL550（R）分別擴增MoFbr7上下游各1.0 kb左右的片段。將上下游片段與潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因（HPH）片段混合，利用酵母同源重組的方法整合到經(jīng)SalⅠ酶切的ps110載體上，從而獲得敲除載體ps110：：MoFbr7：：HPH。

設計引物GL1168（F）/GL1169（R）擴增包括MoFbr7基因的全長片段，連接至ps1102載體（含有萎銹靈抗性基因CBX）上，構(gòu)建成為回補載體ps1102：：MoFbr7c：：CBX。通過農(nóng)桿菌的方式將ps110：：MoFbr7：：HPH整合于Guy11菌株，并使用200 μg/mL潮霉素篩選;將ps1102：：MoFbr7c：：CBX整合于ΔMoFbr7并使用50 μg/mL CBX抗性篩選。所用引物序列見表1。

1.4MoFbr7基因敲除及回補轉(zhuǎn)化子的鑒定

提取所有轉(zhuǎn)化子基因組，用上游臂外引物和HPH片段上引物GL1381（F）/GL557（R）進行PCR檢測，可擴增出1 993 bp條帶，且用下游臂外引物和HPH上引物GL558 （F）/GL1382（R）可擴增出2 264 bp條帶的轉(zhuǎn)化子為待定的敲除突變體。提取所有待定轉(zhuǎn)化子及野生型總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。進一步利用GL1460 （F）/GL1461（R）對其進行RTPCR分析檢測，不能得到555 bp產(chǎn)物的菌株，則為敲除突變體;回補轉(zhuǎn)化子中得到555 bp產(chǎn)物的則為回補菌株，以Actin擴增結(jié)果為對照。所用引物序列見表1。

1.5MoFbr7突變體的表型分析

1.5.1營養(yǎng)生長

從ΔMoFbr7、MoFbr7c及Guy11菌落邊緣切取邊長為2 mm的正方形菌塊，分別接種于CM（complete medium）、OM（oatmeal medium）、MM（minimal medium）及RDC（rice medium）培養(yǎng)基上，置于28℃培養(yǎng)，7 d后觀察菌落生長形態(tài)并測量直徑。

1.5.2產(chǎn)孢

從ΔMoFbr7、MoFbr7c及Guy11菌株菌落邊緣切取菌塊，接種于RDC產(chǎn)孢培養(yǎng)基中，置于28℃恒溫箱中培養(yǎng)6 d，轉(zhuǎn)于40 W 黑光燈下誘導產(chǎn)孢，3 d后，分別用4 mL滅菌水洗滌供試菌株，收集分生孢子，并在顯微鏡下觀察孢子形態(tài)與數(shù)量。

1.5.3附著胞形成

分別收集各個菌株的孢子并將濃度稀釋為5×104個/mL。滴于疏水玻片以監(jiān)測附著胞的發(fā)生，25℃避光培養(yǎng)。分別于2、4、8、12、24 h 顯微鏡下監(jiān)測附著胞發(fā)生情況。

1.5.4大麥侵染測定

剪取大麥葉片，背面朝上貼于保濕盒，分別收集各個菌株的孢子并將濃度稀釋為2×104個/mL，于24、36、48 h統(tǒng)計附著胞侵入情況。

1.5.5致病力檢測

分別將ΔMoFbr7、MoFbr7c及Guy11菌株的孢子濃度稀釋為5×104個/mL，利用噴霧器將其噴灑于14 d水稻葉片上。28℃暗培養(yǎng)24 h后進行L∥D=12 h∥12 h光暗交替培養(yǎng)，7 d后觀察葉片發(fā)病情況并拍照。

1.5.6對脅迫因子的敏感性測定

從活化后的ΔMoFbr7、MoFbr7c及Guy11菌株的菌落邊緣切取菌塊，接種于含200 μg/mL Calcofluor white （CFW），200 μg/mL剛果紅（CR），0.7 mol/L NaCl，3 mmol/L H2O2、0.01% SDS、1.2 mol/L山梨醇及無藥劑的CM平板中，置于28℃，黑暗培養(yǎng)。5 d后拍攝菌落生長情況并測量菌落直徑，計算抑制率。

1.5.7原生質(zhì)體釋放觀察

切取ΔMoFbr7、MoFbr7c及野生型菌株邊緣菌塊于CM液體培養(yǎng)基中，28℃，165 r/min液體培養(yǎng)，2 d后過濾并壓干水分，各稱取100 mg菌絲體，分別置于濃度為7.5 mg/mL的10 mL Lysing enzyme酶解液中，每隔0.5 h，用血球計數(shù)板監(jiān)測原生質(zhì)體釋放量，共計3個時間段。

2結(jié)果與分析

2.1MoFbr7生物信息學分析

于SMART網(wǎng)站中預測MoFbr7的結(jié)構(gòu)域，發(fā)現(xiàn)在其N端（第142至183位）存在一個典型的Fbox結(jié)構(gòu)域，同時在其C端（第272至592位）存在8個連續(xù)的WD40序列（圖1），說明這是一個典型的Fbox基因。同源蛋白比對發(fā)現(xiàn)，MoFbr7與炭疽病菌Colletotrichum gloeosporioides、尖孢鐮刀菌Fusarium oxysporum、球孢白僵菌Beauveria bassiana的同源性高達77%、75%、73%，而與人類Homo sapiens的同源性僅為28%（圖2）。以上表明，MoFbr7蛋白在絲狀真菌中具有較高保守性。

2.2基因敲除及回補突變體的獲得

構(gòu)建MoFbr7基因敲除盒（圖3），PCR驗證MoFbr7敲除及回補轉(zhuǎn)化子。結(jié)果顯示轉(zhuǎn)化子ΔMoFbr71、ΔMoFbr73、ΔMoFbr74和ΔMoFbr75分別由GL1381（F）/GL557（R）擴增得到1 993 bp的條帶;由GL1382（F）/GL558（R）擴增得到2 264 bp的條帶;進一步RTPCR分析檢測，使用內(nèi)引物GL1460（F）/GL1461（R）不能夠在敲除突變體中擴增出555 bp的條帶，而在MoFbr7c中能擴增出555 bp條帶（圖3），說明成功獲得了4個具潮霉素抗性的基因功能缺失轉(zhuǎn)化子ΔMoFbr71、ΔMoFbr73、ΔMoFbr74和ΔMoFbr75和1個基因回補菌株MoFbr7c。

2.3MoFbr7表型鑒定

2.3.1營養(yǎng)生長

ΔMoFbr7在CM、OM平板上的生長速率正常;但在MM和RDC平板上，ΔMoFbr7菌株生長速率分別降低7.58%和10.38%（圖4），說明ΔMoFbr7參與調(diào)控稻瘟病菌對部分營養(yǎng)物質(zhì)的利用。

2.3.2產(chǎn)孢量

在RDC培養(yǎng)條件下，進一步分析ΔMoFbr7的產(chǎn)孢情況。結(jié)果顯示，ΔMoFbr7分生孢子形態(tài)沒有異常（圖5a），附著胞形態(tài)也與野生型菌株一致（圖5b）。另外，ΔMoFbr7的孢子形成量也未受到影響（圖5c）。表明MoFbr7與分生孢子的形成及附著胞發(fā)育沒有重要關系。

2.3.3突變體分生孢子對大麥表皮的侵染

于24 h時撕取處理過的大麥表皮，發(fā)現(xiàn)ΔMoFbr7的侵入栓形成沒有異常。36 h后發(fā)現(xiàn)突變體成功侵入到表皮細胞內(nèi)并分化形成侵染菌絲，侵入率與野生型相當，且菌絲分化程度也與野生型基本一致（圖6a），48 h時ΔMoFbr7菌絲能正常擴展數(shù)據(jù)未展示。表明MoFbr7在侵染過程中不起關鍵作用。

2.3.4致病性

進一步將收集的ΔMoFbr7孢子噴灑于水稻葉片，7 d后觀察到所有葉片上產(chǎn)生典型病斑，數(shù)目與形態(tài)皆與野生型無區(qū)別（圖6b）?？梢?，MoFbr7基因與其對水稻的毒力不相關。

2.3.5對脅迫因子的敏感性及原生質(zhì)體釋放

在補充了各種類型脅迫因子的CM培養(yǎng)基上培養(yǎng)MoFbr7突變體和Guy11菌株，評估MoFbr7突變體對滲透壓和氧化應激的敏感性。結(jié)果顯示，在含有CFW和CR的培養(yǎng)基上，ΔMoFbr7抑制率較野生型分別高12.3%和10.5%（圖7a～b）。結(jié)果表明，MoFbr7基因的缺失可能使稻瘟病菌的細胞壁組分發(fā)生變化。進一步原生質(zhì)體釋放觀察顯示，突變體的原生質(zhì)體釋放量與野生型無異（圖7c）。

3小結(jié)與討論

釀酒酵母中Grr1參與細胞對營養(yǎng)的攝取，并且影響蛋白降解，進一步調(diào)控細胞周期[15]。本研究室在前期試驗中發(fā)現(xiàn)，稻瘟病菌中Mofbox參與營養(yǎng)生長、產(chǎn)孢、附著胞形成，同時影響對寄主的毒力[16]。Mogrr1影響菌株的生長速率、黑色素沉著、分生孢子梗的形成、對外源脅迫因子耐受性及對水稻的毒力[17]。

本研究對一個新的Fbox基因MoFbr7進行鑒定，該基因的生物信息學結(jié)果表明，其編碼產(chǎn)物具有1個典型的Fbox結(jié)構(gòu)域和8個連續(xù)的WD40結(jié)構(gòu)域，并在絲狀真菌中具有高度保守性。作為Fbox蛋白的一種，WD40蛋白被鑒定涉及細胞周期中的多種功能。在稻瘟病菌中，WD40重復蛋白MoCreC影響碳分解代謝阻抑（carbon catabolite repression，CCR）并且涉及稻瘟病菌的分生孢子、生長和致病性[18]。因此，MoFbr7基因具有參與調(diào)控對寄主毒力的可能性。

進一步表型分析結(jié)果表明，稻瘟病菌MoFbr7突變體在產(chǎn)孢量、分生孢子形成及對寄主致病性與野生型菌株沒有顯著差異，這可能來源于基因功能冗余的原因。突變體在CM和OM培養(yǎng)基中與野生型無顯著差異，而MM培養(yǎng)基及RDC培養(yǎng)基中呈現(xiàn)菌絲生長速率下降，說明MoFbr7可能參與稻瘟病菌營養(yǎng)生長且對部分營養(yǎng)物質(zhì)的利用與釀酒酵母中Grr1參與營養(yǎng)物質(zhì)攝取這一結(jié)果相吻合。此外，ΔMoFbr7對細胞壁脅迫因子敏感，表明MoFbr7敲除突變體細胞壁組分可能發(fā)生變化。但是細胞壁的變化并沒有影響ΔMoFbr7在裂解酶處理下的原生質(zhì)體釋放量，說明這種變化可能只是微弱的，對細胞壁完整性的影響不大。在玉米黑粉菌Ustilago maydis中，pmt4和Kre2被發(fā)現(xiàn)對細胞壁脅迫因子敏感，但致病性分析顯示，僅有pmt4參與發(fā)病[19]。由此可見，輕微的細胞壁完整性改變并不是致病的關鍵因子，這可能是MoFbr7對CFW和CR敏感但最終不致病的原因。

綜上所述，本文通過基因敲除方法對MoFbr7的生物學功能進行分析，對于其參與菌絲生長發(fā)育、調(diào)控細胞壁完整性及其他信號通路的分子機制，還待進一步研究。

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（責任編輯：田喆）