文朝慧 何蘇琴 左佳妮 王溪橋 尤佳

摘要對經(jīng)甘肅口岸進(jìn)境的30批菜豆 Phaseolus vulgaris種子進(jìn)行了普通細(xì)菌性疫病菌的檢測，利用選擇性培養(yǎng)基MT從波蘭進(jìn)境菜豆種子上分離到1株細(xì)菌597，對該分離物進(jìn)行菌落形態(tài)特征觀察、致病性測定、16S rDNA及16S23S rDNA ITS序列分析和特異性PCR檢測。結(jié)果表明，該分離物在MT培養(yǎng)基上菌落呈黃色、圓形、黏稠、表面光滑向外隆起、菌落周圍有水解圈。分離物597接種菜豆幼苗后導(dǎo)致葉片枯萎，接種點干枯。結(jié)合菌落形態(tài)、16S23S rDNA ITS序列、特異性PCR檢測結(jié)果，將分離物597鑒定為地毯草黃單胞桿菌菜豆致病變種Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli。

關(guān)鍵詞菜豆種子;地毯草黃單胞桿菌菜豆致病變種;普通細(xì)菌性疫病;鑒定

中圖分類號：S 436.43， S41.31

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

DOI：10.16688/j.zwbh.2018101

菜豆普通細(xì)菌性疫病1893年首次被報道[1]，引起該病害的病原物有多種，其中一些菌株在培養(yǎng)基上可以產(chǎn)生褐色素，稱為褐色致病菌株[2]，褐色和非褐色致病菌株作為菜豆普通細(xì)菌性疫病的致病菌曾被統(tǒng)稱為Xanthomonas campestris pv. phaseoli[3]。隨著研究的深入，Vauterin等[45]發(fā)現(xiàn)非褐色菌株不同于褐色菌株，因此將非褐色菌株歸于X. axonopodis，成為一個新的變種，而褐色菌株也作為一個新的變種被稱為褐色黃單胞菌褐色亞種X. fuscans subsp. fuscans （Xff）[6]。目前普遍認(rèn)為菜豆普通細(xì)菌性疫病是由地毯草黃單胞桿菌菜豆致病變種X. axonopodis pv. phaseoli （Xap）和褐色黃單胞菌褐色亞種X. fuscans subsp. fuscans （Xff）所引起的。

帶菌種子是菜豆普通細(xì)菌性疫病最重要的初侵染源[79]，10 000粒種子中有1粒帶菌種子即可引起菜豆普通細(xì)菌性疫病的發(fā)生流行[10]。病原菌通常寄生于菜豆種子的種皮或者胚中，寄生于胚中的病原菌在種子處理中難以去除[911]，易感菜豆品種的帶菌種子發(fā)芽后在種苗期即表現(xiàn)癥狀[12]，抗性強(qiáng)的菜豆品種即使在種苗期不表現(xiàn)癥狀，所結(jié)種子也會被感染[13]，因此帶菌種子在菜豆普通細(xì)菌性疫病的流行中起著重要作用。本研究通過對進(jìn)境菜豆種子中菜豆普通細(xì)菌性疫病病原菌進(jìn)行檢測和鑒定，以期明確進(jìn)境菜豆種子中菜豆普通細(xì)菌性疫病病原菌的種類，為進(jìn)出境檢驗檢疫和制定病害防治策略提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1供試種子樣品

30份供試菜豆種子為2015年經(jīng)甘肅口岸進(jìn)境的菜豆種子。

1.2培養(yǎng)基及主要試劑

MT選擇性培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g，氯化鈣0.25 g，酪氨酸0.5 g，瓊脂粉18.0 g，脫脂奶粉10.0 g，放線菌酮200.0 mg，氨芐80.0 mg，鹽酸萬古霉素10.0 mg，吐溫80 10.0 mL，蒸餾水1 000 mL。

NA培養(yǎng)基：氯化鈉5.0 g，牛肉膏3.0 g，蛋白胨10.0 g，瓊脂粉18.0 g，蒸餾水1 000 mL，調(diào)節(jié)pH為6.6～7.2。

LB液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10.0 g，酵母提取物5.0 g，氯化鈉10.0 g，蒸餾水1 000 mL。

PCR及電泳相關(guān)試劑：PCR buffer、dNTPs、rTaq聚合酶、loading buffer購自寶生物（大連）工程有限公司，新型植物基因組DNA提取試劑盒購自北京天根生化科技有限公司，引物由寶生物工程（大連）有限公司合成。

1.3病原菌的分離與培養(yǎng)

每份菜豆種子取100粒浸泡在300 mL 0.8%無菌生理鹽水中，加入300 μL 1%吐溫20，4℃靜置過夜后在搖床上180 r/min室溫振蕩30 min。用紗布將種子濾除，10 000 r/min離心30 min，將沉淀用0.8%無菌生理鹽水懸浮，1 000 r/min離心3 min，取上清液12 000 r/min離心5 min，得到的沉淀用無菌生理鹽水懸浮即為測定菌液。取10 μL菌液依次稀釋為10-1、10-2、10-3，均勻涂布在MT平板培養(yǎng)基上，置于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4～5 d后，挑取有雙水解圈的黃色菌落劃線接種到新的NA培養(yǎng)基上純化，挑取單菌落獲得純培養(yǎng)。

1.4致病性測定

分別采用噴霧接種法和莖節(jié)接種法[14]將純培養(yǎng)分離物接種到菜豆幼苗上進(jìn)行致病性測定。

營養(yǎng)土經(jīng)高溫高壓滅菌后裝在塑料花盆（24 cm×16 cm×18 cm）中，澆透水靜置24 h后播種菜豆。播種后的花盆置于溫度25℃，L∥D=11 h∥13 h，相對濕度85%～95%的人工氣候箱中培養(yǎng)，待長出2片真葉后接種。

挑取長勢良好的菜豆幼苗分為2組，每組4盆苗，每盆2株苗，1組采用噴霧接種，另1組采用莖節(jié)接種。每處理3次重復(fù)，對照幼苗用無菌水接種處理。采用噴霧接種時，先將培養(yǎng)于NA培養(yǎng)基48～72 h的分離物用無菌水沖洗至無菌離心管，配制成1×108 cfu/mL的菌懸液，用無菌噴壺將菌懸液噴灑到菜豆植株表面至有菌液滴落。采用莖節(jié)接種時，用滅菌牙簽蘸取培養(yǎng)于NA培養(yǎng)基上48～72 h的分離物刺穿菜豆植株第一莖節(jié)，牙簽與菜豆植株莖稈保持45°，刺穿后將牙簽旋轉(zhuǎn)兩周后緩慢拔出。將接種后的菜豆苗置于人工氣候箱中繼續(xù)培養(yǎng)，每天觀察植株發(fā)病情況，記錄癥狀特點。待植株出現(xiàn)明顯病狀后，根據(jù)柯赫氏法則，取病健交界處葉片或莖稈組織進(jìn)行病菌分離，將分離菌與接種物進(jìn)行形態(tài)特征比較，并用PCR進(jìn)行檢測，完成致病性測試程序。

1.5病原物的分子生物學(xué)鑒定

2.5特異性分子鑒定

利用特異性檢測引物X4c/X4e、Xf1/Xf2對分離物597的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增（圖4），引物X4c/X4e產(chǎn)生730 bp左右的特異性片段;而引物Xf1/Xf2未產(chǎn)生目標(biāo)片段。利用特異性引物XA3F/XA3R、XA5F/XA5R、XO4F/XO4R、XC9F/XC9R、XC12F/XC12R對菌株597的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增（圖5），引物XA3F/XA3R未產(chǎn)生目標(biāo)片段，而引物XA5F/XA5R、XO4F/XO4R、XC9F/XC9R、XC12F/XC12R均產(chǎn)生特異性片段。由于特異性檢測引物X4c/X4e對X. axonopodis pv. phaseoli （Xap）和X. fuscans subsp. fuscans （Xff）均具有特異性，引物Xf1/Xf2僅對Xff具有特異性[17];引物XA5F/XA5R、XO4F/XO4R、XC9F/XC9R、XC12F/XC12R對Xap具有特異性，引物XA3F/XA3R對Xff具有特異性[18]，由此可初步判斷分離物597為地毯草黃單胞菌菜豆變種。

3討論

菜豆又稱四季豆，是我國重要的豆科蔬菜作物，在蔬菜的周年供應(yīng)中起著重要作用。菜豆普通細(xì)菌性疫病在世界各地主要菜豆產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生，在美國[78]、加拿大[12]、歐洲[9，19]、亞洲[14]、非洲[13]均有報道。種子傳播是該病害最主要的傳播方式[711]。近年來，甘肅作為對外繁育種子原種進(jìn)口大省，從美國、法國、德國、捷克、匈牙利、意大利、荷蘭、波蘭、羅馬尼亞、西班牙、土耳其、俄羅斯、日本、韓國、越南、泰國、中國臺灣等國家和地區(qū)進(jìn)口菜豆種子數(shù)量增長迅速，種子攜帶細(xì)菌性病原物的幾率增大。病原菌通過種子傳帶形成異地擴(kuò)散和蔓延，將嚴(yán)重影響作物產(chǎn)量和品質(zhì)，正確進(jìn)行細(xì)菌性病原物的鑒定，是種子健康檢測、保護(hù)育種基地安全的需要。

本研究對2015年甘肅口岸進(jìn)境的30批菜豆種子進(jìn)行菜豆普通細(xì)菌性疫病菌的檢測，在1批波蘭進(jìn)境的菜豆種子中檢出菜豆普通細(xì)菌性疫病菌。

目前，菜豆普通細(xì)菌性疫病主要病原菌有兩種，即地毯草黃單胞桿菌菜豆致病變種X. axonopodis pv.phaseoli （Xap）和褐色黃單胞菌褐色亞種X. fuscans subsp.fuscans （Xff），2種病原菌具有相同的寄主范圍和流行學(xué)特征[19]，除褐色黃單胞菌褐色亞種在培養(yǎng)條件下能夠產(chǎn)生褐色素外，兩者具有相似的生化表型[20]。利用16S rDNA和16S23S rDNA ITS序列分析及構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹是鑒定細(xì)菌的通用技術(shù)，本研究中菌株597的16S rDNA序列和16S23S rDNA ITS序列，與GenBank中地毯草黃單胞桿菌菜豆致病變種的相應(yīng)序列具有100%的一致性。結(jié)合病原菌形態(tài)學(xué)特征、致病性測定、特異性PCR檢測，證實了進(jìn)境菜豆種子上的分離物597為地毯草黃單胞桿菌菜豆致病變種X. axonopodis pv. phaseoli，為防止病原物的傳播危害提供了依據(jù)。

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（責(zé)任編輯：田喆）