姜洪芳，石寶俊，束成杰，張鋒倫，張衛(wèi)明

(南京野生植物綜合利用研究院，江蘇 南京211111)

漆樹(RhussuccedaneaL.)是漆樹科(Anacarkiaceace)漆樹屬(Toxicodendron)的落葉喬木或灌木，是我國的一種重要經濟樹種，主要分布在貴州、四川、云南、湖北、陜西等地，距今已有2 000余年的栽培歷史。漆籽是漆樹的果實，年產量約為200萬噸，由糖類、纖維、粗蛋白、脂肪、水分和灰分等組成，油脂含量較高，可以從漆籽皮和漆籽仁中分別提取得到漆蠟和漆籽油。漆蠟中含有三甘油酯、游離脂肪酸和游離脂肪醇，品質較高，價格低廉，可以代替棕櫚蠟和芳香蠟用于高檔化妝品行業(yè)[1]。漆油富含不飽和脂肪酸，其中亞油酸含量在60%以上，亞油酸具有調整血脂和抗動脈硬化作用，能減少冠心病的發(fā)病率和死亡率，具有很高的保健功能[2]。作為重要的化工原料漆籽油還可用于制備生物柴油。漆籽的資源利用已引起各界的高度重視，漆籽加工漆蠟(油)后，剩余部分的漆籽餅粕年產量約為100萬噸，含有36%糖類，30%粗纖維，20%粗蛋白，5%脂肪，其中的多糖類物質進一步提取、分離精制可以作為日用化學品、食品等原料，以期提高漆籽資源的綜合效益及增加漆樹籽粕的經濟價值。

多糖是由多個單糖分子縮合、失水而成，是一類分子結構復雜且龐大的糖類物質。廣泛存在于植物、動物和微生物中。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，植物多糖因其充足資源和低毒高效的藥理活性廣泛應用于食品和藥物領域[3-4]。目前已從植物中分離得到數百種多糖，大量的藥理實驗表明，多糖具有調節(jié)免疫、抑菌、抗腫瘤、抗病毒、抗氧化、調節(jié)胃腸功能、降低膽固醇，幫助身體組織結構再生和修復，促進傷口愈合等作用[5-7]。

多糖的提取方法有水提法、堿提法和酶提法等，其中酶提法是利用酶對細胞結構的破壞作用，使存在于細胞內部的多糖釋放出來，從而提高了多糖的得率。本實驗采用纖維素酶和木瓜蛋白酶輔助法對漆樹籽粕進行酶解后，結合陳虹霞等回流提取工藝[8]，研究了漆樹籽粕多糖的酶解最佳條件及對羥自由基和DPPH的抗氧化活性。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

漆樹籽2017年10采集于陜西安康平利，自然晾干、粉碎成粉末，備用；纖維素酶(酶活性15 U/mg) (上海耕奔生物技術有限公司)；木瓜蛋白酶(酶活性80萬U/g) (廣西龐博生物工程有限公司)；石油醚、乙醇、丙酮、乙醚、葡萄糖、苯酚、濃硫酸、鐵氰化鉀、三氯乙酸、氯化鐵、DPPH、過硫酸鉀、甲醇、抗壞血酸購自國藥集團化學試劑有限公司；蒸餾水自制。

T6-新世紀紫外可見分光光度儀(北京普析通用儀器有限責任公司)；PHS-3TC精密數顯酸度計(上海天達儀器儀器有限公司)。離心機(長沙湘儀離心機儀器有限公司)；HH-4恒溫水浴鍋(上海江星儀器有限公司)；FD-1冷凍干燥儀(北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 葡萄糖標準曲線的繪制

精確稱取葡萄糖標準品10 mg，加入蒸餾水溶解并定容到50 mL，得到0.2 mg/mL的標準品標準溶液。分別移取0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.7、0.9 mL的1 mg/mL標準溶液至10 mL的試管中，補加蒸餾水至終體積為1.0 mL，分別加入1.0 mL 5%的苯酚，搖勻后，加入3.5 mL的濃硫酸，迅速振蕩搖勻，室溫下靜置25 min，在490 nm處測吸光度。繪制吸光度與濃度的標準曲線，并擬合線性回歸方程?；貧w方程Y=9.508 1X-0.013 9，相關系數R=0.999 3。葡萄糖在28～193 μg區(qū)間具有良好的線性關系。

1.2.2 熱回流浸提漆樹籽粕多糖

漆籽粉末，加入料液比1∶10(g∶mL)的石油醚在70 ℃下，提取4次，每次3 h，過濾，濾液合并，真空濃縮為漆蠟。濾渣干燥，即為漆樹籽粕。取漆樹籽粕10 g，放入500 mL燒瓶中，按20∶1的料液比加入蒸餾水，在50 ℃ 水中浸泡1 h，升溫至90 ℃提取0.5 h，冷卻至適宜溫度，加入適量酶溶液，酶解提取1 h。然后升溫至90℃提取1h過濾，得到濾液。在旋轉蒸發(fā)儀上60 ℃真空濃縮至50 mL，加入無水乙醇，與多糖水溶液的體積比約為25∶1，在4 ℃下靜置24 h，離心(4 000 r/min)得到沉淀，再用乙醚、丙酮(體積比約為10∶1)洗多糖沉淀兩次，最后將沉淀冷凍干燥得到各多糖提取物。按照1.2.1的方法在490 nm下測定吸光度。漆樹籽粕多糖得率(%)=(多糖的質量/原料的質量)×100。

1.2.3 木瓜蛋白酶、纖維素酶單因素試驗

漆樹籽粕細胞壁、膜由多糖和蛋白質組成， 采用木瓜蛋白酶和纖維素酶能夠水解蛋白和纖維素， 破壞細胞壁、膜結構，使多糖易于從細胞內釋放出來。

1.2.3.1 木瓜蛋白酶單因素試驗

90 ℃熱水提取0.5 h后，適當冷卻，加入適量木瓜蛋白酶溶液，考察酶用量(為漆樹籽粕粉重量的0.1%、0.2%、0.5%、1% 、1.5%、2%)，酶解溫度(40、45、50、55、60 ℃)，酶解反應pH值(4、5、6、7、8)，酶解反應時間(0.5、1、2、3、4 h)對漆樹籽粕粗多糖得率的影響。

1.2.3.2 纖維素酶單因素試驗

90 ℃熱水提取0.5 h后，適當冷卻，加入適量纖維素酶溶液，酶解提取1h為固定條件，考察酶用量(為漆樹籽粕粉重量的0.05%、0.1%、0.25%、0.5%、0.75%、1%)，酶解溫度(35、40、45、50、55 ℃)，酶解反應pH值(3.5、4、4.5、5、5.5、6)，酶解反應時間(0.5、1、2、3、4 h)對漆樹籽粕粗多糖得率的影響。

1.2.4 漆樹籽粕多糖對羥自由基清除能力的測定

將漆樹籽粕多糖提取物用蒸餾水配制成0.05～50 mg/mL的濃度梯度，以Vc作為對照組進行實驗。取1 mL樣品溶液，加入1 mL濃度為10 mmol/L的FeSO4溶液，混合均勻后加入2 mL濃度為2.5 mmol/L的過氧化氫和1 mL濃度為10 mmol/L的水楊酸乙醇溶液，于37 ℃水浴中反應30 min，于510 nm處測其吸光度，空白對照對蒸餾水代替樣品溶液[9]。對羥基自由基清除能力的測定按以下公式進行計算：

其中：A0為反應體系中不含樣品，即以1 mL 65%乙醇代替樣品的吸光度值；

A1為反應體系中含有樣品的吸光度值；

A2為反應體系中含有樣品,但以2.00 mL蒸餾水代替H2O2的吸光度值。

1.2.5 漆樹籽粕多糖對DPPH自由基清除能力的測定

分別移取不同濃度的樣品及對照品溶液2.00 mL，加入0.5 mmol/L DPPH甲醇溶液2.00 mL，混勻15 s后，放置30 min，以2 .00mL不同濃度樣品或對照品溶液加入2.00 mL甲醇為參比，于517 nm測吸光度，記為A1，每個試樣作三次平行測定，取其均值，同時移取2.00 mL 65%乙醇加入2.00 mL 0.5mM DPPH甲醇溶液，混勻15 s后，放置30 min，以2.00 mL 65%乙醇加入2.00mL甲醇為參比，于517 nm測吸光度，記為A0[10]，并根據下述公式計算清除率。

2 結果與討論

2.1 木瓜蛋白酶單因素試驗

2.1.1 酶用量

木瓜蛋白酶加入量分別為漆樹籽粕重量的0.1%、0.2%、0.5%、1%、1.5%、2%，酶解溫度為45 ℃ ，結果見圖1。

圖1顯示，隨著蛋白酶用量的增加，多糖得率也逐漸增加，酶用量大于1%后提取率增加趨于平緩?？紤]酶的成本及提取效果，宜將蛋白酶用量確定為1%。

2.1.2 酶解溫度

90 ℃熱水提取0.5 h后，加入適量木瓜蛋白酶溶液，酶用量為漆樹籽粕重量的1%，分別于40、45、50、55、60 ℃ 下酶解提取1 h， 結果見圖2。

圖1 木瓜蛋白酶用量對多糖得率的影響

圖2 酶解溫度對多糖得率的影響

圖2顯示， 酶解溫度對漆樹籽粕多糖的提取有顯著影響。在50 ℃ 時，多糖得率最高。

2.1.3 酶解反應pH值

木瓜蛋白酶濃度為1%，將酶解反應的pH值分別控制在4、5、6、7、8，在50 ℃ 下酶解反應1 h，結果見圖3。

圖3 木瓜蛋白酶反應pH值對多糖得率的影響

圖3顯示，酶反應的pH值對香菇多糖的提取有很大影響，pH值在6～7之間時多糖的提取率最高?？紤]生產實際，可選用自然條件下的pH值。

2.1.4 酶解反應時間

控制木瓜蛋白酶用量為1%， 自然pH值(約6.5)，在50 ℃下分別反應0.5、1、2、3、4 h，結果見圖4。

圖4 木瓜蛋白酶反應時間對多糖得率的影響

圖4顯示，隨著酶解時間的延長，多糖得率也隨之增加，當酶解時間超過1 h后，得率的增幅趨于平緩?？紤]實際生產情況，酶解作用1 h較為適宜。

2.2 纖維素酶單因素試驗

2.2.1 酶用量

控制纖維素酶濃度分別為漆樹籽粕重量的0.05%、0.1%、0.25%、0.5%、0.75%、1%，酶解溫度為40 ℃ ，結果見圖5。

圖5 纖維素酶用量對多糖得率的影響

圖5顯示，隨著纖維素酶用量的增加，漆樹籽粕多糖得率也隨之增加，酶濃度超過0.5% 后得率的增幅很小。因此，纖維素酶濃度確定為0.5%比較適宜。

2.2.2 酶解溫度

90 ℃熱水提取0.5 h后，加入適量纖維素酶溶液，使酶濃度為漆樹籽粕重量的0.5%，分別于35、40、45、50、55 ℃ 下酶解提取1 h，結果見圖6。

圖6顯示，酶反應溫度在45 ℃時多糖得率最高。但在35～55 ℃ 范圍內，提取結果無顯著差異， 因此實際生產中也可根據需要選擇溫度。

2.2.3 酶解反應pH值

纖維素酶濃度為0.5%，將酶解反應的pH值分別控制在3.5、4、4.5、5、5.5、6，在45 ℃下酶解反應1 h， 結果見圖7。

圖6 纖維素酶反應溫度對多糖得率的影響

圖7 纖維素酶反應pH值對多糖得率的影響

圖7顯示，pH值對酶解提取效果有很大影響，pH值在4.5～5.0之間時，多糖得率最高。

2.2.4 酶解反應時間

控制纖維素酶濃度為0.5%，pH值為5.0，在45 ℃下分別反應0.5、1、2、3、4 h， 結果見圖8。

圖8 纖維素酶反應時間對多糖得率的影響

圖8顯示，隨著酶解時問的延長，多糖提取率逐漸增加。當酶解時間超過1h時，多糖得率增幅較小，因此酶解時間可確定為1 h。

2.3 漆樹籽粕多糖的抗氧化作用

2.3.1 漆樹籽粕多糖對羥基自由基的清除能力

活性物質的抗氧化作用歸因于各種反應機制，如清除自由基、還原能力，阻止連鎖啟動及螯合催化反應過程中所需的金屬離子等。羥自由基被認為是氧化應激損傷主要原因，其很容易穿過細胞膜，與碳水化合物、蛋白質和DNA等大多數生物大分子反應[11]。不同濃度的VC和漆樹籽粕多糖提取物對羥基自由基的清除能力如圖9所示。漆樹籽粕多糖提取物對羥基自由基具有較強的清除能力，10 mg/mL 的漆樹籽粕多糖和Vc 對羥自由基清除率分別為62.6% 和92.5%，漆樹籽粕多糖提取物對羥自由基的IC50值為8.16 mg/mL。說明漆樹籽粕多糖能夠有效清除或阻止羥自由基反應，將羥自由基轉化為無毒的物質[12]。

圖9 漆樹籽粕多糖對羥自由基的清除能力

2.3.2 漆樹籽粕多糖對DPPH自由基的清除能力

DPPH自由基是一種很穩(wěn)定的以氮為中心的自由基，其溶液具有特征的紫紅色團吸收峰，當其單電子在517 nm附近有強吸收(顯深紫色)。當有機清除劑存在時，單電子被配對，吸收消失或減弱，其褪色程度與其所接受的電子數成定量關系，因而可用分光光度法進行定量分析。利用該方法研究漆樹籽粕多糖提取物的抗氧化能力。由圖10可知，對DPPH自由基的清除率與漆樹籽粕多糖的濃度呈正相關，當濃度從0.05 mg/mL增加至10 mg/mL時，清除率隨著濃度的增大顯著增強。當濃度在10 mg/mL時，清除率為56.86%，清除效果低于VC，其IC50值為6.83 mg/mL。以上數據可以說明漆樹籽粕多糖具有較強的抗氧化活性。

圖10 漆樹籽粕多糖對DPPH自由基的清除能力

3 結 論

在漆樹籽粕提取中加入木瓜蛋白酶和纖維素酶進行輔助提取，能夠顯著提高多糖得率。纖維素酶的最佳酶解條件是：酶濃度是漆樹籽粕粉重量的0.5%，酶解溫度45 ℃ ，pH值4.5～5.0，酶解反應1 h。木瓜蛋白酶的最佳酶解條件是：酶用量是漆樹籽粕粉重量的1%，酶解溫度50 ℃，pH值6～7， 酶解反應1 h。在此條件下漆樹籽粕多糖得率為2.371%，與不加酶的漆樹籽粕多糖空白相比，多糖得率增加23.87%。研究漆樹籽粕多糖對羥自由基和DPPH自由基的清除能力，并與VC進行對比，結果表明漆樹籽粕多糖具有一定的抗氧化活性,其清除能力低于VC。當濃度為10 mg/mL時，對羥自由基的清除率為62.6%，IC50為8.16 mg/mL。當濃度為10 mg/mL時，對DPPH自由基的清除率為56.86%，IC50值為6.83 mg/mL。