束成杰，張孟麗，趙孔發(fā)，張鋒倫，張衛(wèi)明*

(1. 南京野生植物綜合利用研究院，江蘇 南京211111；2. 南京師范大學 生命科學學院，江蘇 南京210023；3. 昭通市大成農業(yè)開發(fā)有限責任公司, 云南 昭通657100)

松材線蟲(Bursaphelenchusxylophilus)，常見的松樹寄生蟲，屬于線形動物門，滑刃目(Aphelenchida)、滑刃科(Aphelenchoididae)、傘滑刃屬(Bursaphelenchus)動物[1]。松材線蟲病又名松材線蟲萎蔫病、松樹萎蔫病、松樹枯萎病，是一種松樹毀滅性病害，具有危害性大、傳播速度快、防治難度大等特點，是世界性檢疫對象。松材線蟲的生活史如圖1所示，包括2個周期，分別是繁殖周期和擴散周期，繁殖周期和擴散周期同樣需經(jīng)歷卵、一齡幼蟲、二齡幼蟲、三齡幼蟲、四齡幼蟲(即 L1，L2，L3，L4)和成蟲六個蟲態(tài)。在25 ℃左右的條件下，松材線蟲4～5 d即可繁殖一代[2-3]。與繁殖周期不同的是，擴散型幼蟲以L3蟲態(tài)在寄主松樹內休眠越冬，第二年春天，擴散型 L3 幼蟲脫皮成長為擴散型 L4，L4 為持久型幼蟲，通過媒介傳播侵染健康松樹來補充營養(yǎng)，成長為成蟲進而繁殖。

圖1 松材線蟲生活史[2]

近幾十年來，圍繞植物源物質防治植物病原線蟲開展了廣泛研究，殺線蟲劑的開發(fā)應用正從原來的高毒、高殘留向低毒、高效、低殘留的綠色環(huán)保農藥方向發(fā)展。早期實驗使用棉球實驗法測定了31科61種陸地植物對松材線蟲的毒殺活性[4]。實驗對駱駝篷等15科28種植物提取物對線蟲的控制作用研究表明：駱駝篷、黃文江魚藤、桃花心木的提取物均對線蟲有很強的觸殺活性，而且也能明顯的增加植株地上部高度、重量和根長。白花曼陀羅葉提取物和三尖杉有同樣的抑制線蟲發(fā)育現(xiàn)象[5, 6]。

青花椒(ZanthoxylumschinifoliumSieb. et Zucc.)為蕓香科花椒屬植物，含有豐富的揮發(fā)油、生物堿、酰胺類化合物等成分，主要生物活性具有抗菌、鎮(zhèn)痛、抗癌、抗病毒、保護心血管、提高機體免疫力等作用，在食品、醫(yī)藥、農業(yè)和日化行業(yè)中具有巨大的應用潛力[7, 8]。本文探究青花椒水提物及精油對松材線蟲的防治作用，為生態(tài)環(huán)保型農藥開發(fā)提供實驗參考。

1 材料與方法

1.1 材料

松材線蟲(Bursaphelenchusxylophilus)、灰葡萄孢(Botrytiscinerea)，由江蘇省農業(yè)科學院提供；特級青花椒，采購于云南省昭通市魯?shù)榍嗷ń贩N植基地。

1.2 儀器與設備

電子分析天平(上海越平科學儀器有限公司)；高速萬能粉碎機(天津市泰斯特儀器有限公司)；電熱恒溫鼓風干燥箱(上海躍進醫(yī)療器械廠)；旋轉蒸發(fā)儀(上海亞榮儀器廠)；ZNHW-II型智能恒溫電熱套(鞏義市予華儀器有限責任公司)；數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州天瑞儀器有限公司)；所有試劑均采購于國藥集團化學試劑有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 青花椒水提物制備方法

取干燥青花椒果皮100 g，粉碎后過40目篩，按料液比1:10加入蒸餾水加熱煮沸，水提3 h，過濾除雜，再經(jīng)減壓濃縮、干燥，得水提物浸膏，蒸餾水稀釋，過0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，青花椒水提物母液濃度為40 mg/mL，4 ℃冰箱貯存，備用[9]。

1.3.2 青花椒精油制備方法

取干燥青花椒果皮100 g，粉碎后過40目篩，置于蒸餾瓶中，按料液比1:10加入蒸餾水浸泡12 小時，水蒸氣蒸餾4 小時，收集精油部分，加等體積的乙醚萃取3次，蒸發(fā)乙醚，干燥器干燥，得透明油狀物即為青花椒精油[10, 11]。

1.3.3 松材線蟲培養(yǎng)方法

文獻已總結報道了松材線蟲的培養(yǎng)方法。根據(jù)松材線蟲生活史，采用 PDA 平板培養(yǎng)灰葡萄孢(Botrytiscinerea)，待其鋪滿平板后接種松材線蟲，25 ℃恒溫培養(yǎng)4～5天，用無菌水沖洗PDA平板，可獲得四齡幼蟲(L4)/成蟲。用蒸餾水收集線蟲并制備線蟲懸浮液(約100條/100 μL水溶液)。PDA 培養(yǎng)基制備及真菌培養(yǎng)按常規(guī)方法進行[12-14]。

1.3.4 青花椒水提物殺蟲濃度探究

取青花椒母液，用無菌蒸餾水稀釋成20 mg/mL備用，96孔板中兩倍梯度稀釋，每孔再分別加入100 μL四齡幼蟲(L4)/成蟲懸浮液，最終濃度為2.5, 1.25, 0.625, 0.313, 0.156, 0.078, 0.039, 0.019 mg/mL，設三個平行，分別在4小時和24小時觀察一次，實驗重復三次[15]。

1.3.5 青花椒精油殺蟲濃度探究

取青花椒精油，用二甲亞砜(DMSO)溶解，再用無菌蒸餾水進行稀釋，96孔板中分別加入100μL不同濃度的青花椒精油，再各加入100 μL四齡幼蟲(L4)/成蟲懸浮液，1% DMSO溶液為空白對照。青花椒精油濃度梯度(v/v)為0.8%, 0.4%, 0.2%, 0.1%, 0.05%,0.025%, 0.012%, 0.006%(二甲亞砜工作濃度低于1%)，設三個平行，分別在4小時和24小時觀察一次，記錄L4/成蟲的死亡率。松材線蟲死亡判斷標準：當在立體顯微鏡下用鉑金絲對線蟲進行物理刺激后，身體仍然保持靜止不動的線蟲即判定為死亡，實驗重復三次[16-17]。

1.3.6 青花椒水提物對松材線蟲運動能力的影響

松材線蟲在液體中圍繞身體的中點的有規(guī)律的彎曲，被稱為“擺動”[18]。在96孔板中，將L4/成蟲用青花椒水提物的梯度濃度處理4小時和 24小時。通過倒置顯微鏡目測觀察和手持式計數(shù)器計數(shù)，確定 1 min內的線蟲頭部的擺動次數(shù)，每組數(shù)量不低于30條，設三個平行，分別在4小時和24小時觀察一次，實驗重復三次[6]。

1.3.7 青花椒精油對松材線蟲運動能力的影響

在96孔板中，將 L4/成蟲用青花椒精油的梯度濃度處理4小時和 24小時，同時設置1% DMSO溶液為對照。通過倒置顯微鏡目測觀察和手持式計數(shù)器計數(shù)，確定 1 min內的線蟲頭部的擺動次數(shù)，每組數(shù)量不低于30條，設三個平行，分別在4小時和24小時觀察一次，實驗重復三次。

1.3.8 統(tǒng)計學分析

圖用Microsoft Excel 2017軟件繪制(Microsoft Corp., Redmond, WA)。數(shù)據(jù)分析使用SPSS 12.0軟件完成(SPSS Inc., Chicage, USA)。不同的組別之間使用方差分析(ANOVA)。概率水平0.01代表統(tǒng)計分析上的顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 青花椒水提物對松材線蟲的防治效果

按照上述實驗方法，將松材線蟲暴露在不同濃度的青花椒水提物中。4小時和24小時分別觀察一次，實驗結果如圖2所示。

圖2 4小時和24小時青花椒水提物處理松材線蟲致死率

處理4小時后，除0.019 mg/mL以外，各濃度對松材線蟲均具有顯著性的致死作用(**P<0.01)。濃度為0.625 mg/mL時，松材線蟲死亡率為(54.33%±2.52)%；濃度為2.5 mg/mL時，松材線蟲死亡率為100%。處理時間延長至24小時后，松材線蟲死亡率上升，所有實驗濃度對松材線蟲均具有顯著性地殺滅作用(**P<0.01)。當濃度為0.313 mg/mL時，松材線蟲死亡率為(54.00%±2.65)%，濃度為1.25 mg/mL時，松材線蟲死亡率為100%。4小時和24小時殺蟲效果相比，由于時間的延長，青花椒水提物殺蟲作用更加明顯。然而，在實際農林生產應用中，病蟲害防治需要考慮天氣因素，見效快也十分必要。因此，選擇處理4小時的0.625 mg/mL作為青花椒水提物防治松材線蟲的LC50，絕對致死劑量(LD100)為2.5 mg/mL。

2.2 青花椒精油對松材線蟲的防治效果

按照上述實驗方法，將松材線蟲暴露在不同濃度的青花椒精油中。4小時和24小時分別觀察一次，實驗結果如圖3所示。處理時間為4小時，各濃度對松材線蟲均具有顯著性的致死作用(**P<0.01)。當青花椒精油濃度為0.025%時，松材線蟲死亡率為55.67%±4.04%，濃度為0.2%和0.1% 時，松材線蟲死亡率為100%。處理24小時，殺蟲效果與4小時處理相比，殺蟲效果沒有顯著性的差異。因此，選擇處理4小時的0.025%作為青花椒精油防治松材線蟲的LC50，絕對致死劑量(LD100)為0.1%。

圖3 4小時和24小時青花椒精油處理松材線蟲致死率

2.3 青花椒水提物對松材線蟲運動能力的影響

運動行為反映了神經(jīng)系統(tǒng)的活動，并且依賴于多種因素包括外部刺激、神經(jīng)元結和動物內部環(huán)境的變化等。細胞或者功能水平上發(fā)生的變化可以深刻地影響線蟲基本的和誘發(fā)性的運動行為。因此，行為分析可為神經(jīng)元功能的檢測提供簡單、敏感的方法。實驗分別測定了4小時和24小時松材線蟲在青花椒水提物0.156、0.078、0.039、0.019 mg/mL濃度下1 min內頭部擺動的次數(shù)。實驗結果顯示，青花椒水提物處理4小時后，除了0.019 mg/mL濃度下松材線蟲頭部擺動未出現(xiàn)顯著性變化，其他處理濃度下松材線蟲頭部擺動頻率與對照相比均出現(xiàn)顯著性降低(**P<0.01)(圖4)，線蟲蟲體表現(xiàn)出異常扭曲情況，主要是螺旋卷曲或多重卷曲，甚至僵直不動。處理時間延長至24小時，四個濃度下松材線蟲頭部擺動頻率與對照相比均出現(xiàn)顯著性降低(**P<0.01)。綜上所述，青花椒水提物能夠改變松材線蟲的運動行為，從而影響松材線蟲的神經(jīng)功能。

圖4 處理4小時和24小時青花椒水提物對松材線蟲頭部擺動頻率的影響

2.4 青花椒精油對松材線蟲運動能力的影響

實驗分別測定了4小時和24小時松材線蟲在青花椒精油0.025%、0.012% 和0.006% 濃度下1 min內松材線蟲頭部擺動的次數(shù)。實驗結果顯示，處理4小時和24小時后，0.025%、0.012%、0.006% 三個濃度的青花椒精油均能顯著性地降低松材線蟲頭部擺動頻率(**P<0.01)(圖5)。隨著處理時間的延長，24小時的處理結果也顯著性低于處理4小時的結果。綜上所述，青花椒精油能夠改變松材線蟲的運動行為，從而影響松材線蟲的神經(jīng)功能。

圖5 處理4小時和24小時青花椒精油對松材線蟲頭部擺動頻率的影響

3 討 論

青花椒作為花椒屬植物，廣泛種植于我國山西、四川、云南等地，研究顯示花椒主要有揮發(fā)油、生物堿等多種化學成分，對心血管系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、免疫機能都有重要的作用[19-20]。松材線蟲是一種世界范圍內的檢疫性害蟲，是松樹枯萎病的病原，它給木材以及木制品輸出國造成巨大的經(jīng)濟損失[21-22]。本實驗采用青花椒水提物及精油處理松材線蟲，實驗結果表明青花椒水提物及精油對松材線蟲均具有顯著的防治作用。 0.625 mg/mL青花椒水提物處理4小時，松材線蟲可達到半數(shù)致死，2.5 mg/mL則為絕對致死劑量(LD100)。0.025%青花椒精油處理4小時，松材線蟲可達到半數(shù)致死，0.1%則為絕對致死劑量(LD100)。

線蟲運動行為反映了其神經(jīng)系統(tǒng)的活動，對松材線蟲運動行為的探究結果顯示，青花椒水提物0.156、0.078、0.039 mg/mL處理4小時，其頭部擺動頻率均出現(xiàn)顯著性降低。青花椒精油0.025%、0.012%、0.006%三個濃度處理4小時，均能顯著性地降低松材線蟲頭部擺動頻率，從而影響松材線蟲的神經(jīng)功能與活動。

已有研究表明，植物源殺線蟲劑具有分解快、殘留低、污染少、毒性小等特點，如α-律草烯、松脂酚、苦豆堿等，其他植物提取物如毛魚藤根提取物、神農香菊提取物、苦楝樹皮提取物等也對松材線蟲具有顯著性的殺滅作用[23, 24]。青花椒水提物和青花椒精油提取工藝簡單，產量大，在粗提物的水平上即可用來防治松材線蟲，為生態(tài)環(huán)保型農藥開發(fā)提供實驗參考。我國花椒屬植物資源頗為豐富，對青花椒水提物及精油防治松材線蟲的研究，可提高青花椒的利用價值，為青花椒開發(fā)利用帶來新的特色。