韓陽瑞 ，蔣 蔚 ，陳 蕓 ，薛俊欣 ，熊 挺 ，龍夢瑤 ，凌 嬌 ，王 權(quán)

（1.中國農(nóng)業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所，上海200241；2.上海出入境檢驗檢疫局，上海200135；3.南京農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，南京210095）

剛地弓形蟲是一種專性細胞內(nèi)寄生蟲，宿主范圍廣泛，幾乎所有溫血動物都可以被感染，包括人類[1]。免疫力正常的成年人感染弓形蟲后一般無明顯癥狀，但免疫缺陷性病人（如艾滋病患者、器官移植患者）感染弓形蟲后會出現(xiàn)嚴重并發(fā)癥，甚至死亡。孕婦感染則會造成胎兒嚴重后遺癥或晚發(fā)型眼疾[2-4]。貓作為弓形蟲的終末宿主，在弓形蟲的傳播中具有重要作用。近年來，隨著生活水平的提高，越來越多的人開始飼養(yǎng)寵物，其中以犬、貓居多，大大增加了人們感染弓形蟲的幾率[5]。有研究表明，男女不孕癥、精神分裂癥和抑郁癥與弓形蟲感染密切相關(guān)[6]。在畜牧業(yè)中，弓形蟲病的爆發(fā)可造成巨大的經(jīng)濟損失[7]。

弓形蟲主要有3種分泌性細胞器：微線體、棒狀體和致密顆粒，其中致密顆粒分泌的致密顆粒蛋白主要調(diào)節(jié)納蟲泡內(nèi)環(huán)境并改變其結(jié)構(gòu)[8]。目前已發(fā)現(xiàn)有21種不同的速殖子致密顆粒蛋白（dense granule proteins，GRAs），其中GRA1（dense granules antigen-1，P24）是弓形蟲排泄-分泌抗原（excreted-secreted antigens, ESA）的重要組成部分。它是一種Ca2+結(jié)合蛋白，在蟲體內(nèi)主要通過調(diào)節(jié)Ca2+濃度來穩(wěn)定納蟲泡膜，并且與速殖子侵染宿主細胞的信號轉(zhuǎn)導有密切聯(lián)系[2,9]。本實驗室研究表明GRA1是弓形蟲循環(huán)抗原（circulating antigens，CAg）的重要組成成分[10-11]。CAg是急性感染期宿主血液循環(huán)中出現(xiàn)的蟲體自身排泄和裂解產(chǎn)物，CAg檢出時間及濃度與動物急性發(fā)病時間及癥狀輕重相平行，是病原體存在的重要標志，也是早期感染的可靠指標。CAg陽性表明弓形蟲呈急性、活動性感染，有利于準確診斷。研究CAg能否成為與急性感染相關(guān)性高、敏感性高、特異性強的標志蛋白，首先需要對其進行表達。由于外源基因在大腸桿菌體系中高效表達容易形成包涵體蛋白，而包涵體體外折疊復性是一個比較復雜的過程，蛋白復性需要根據(jù)蛋白自身性質(zhì)選擇不同的復性方法。因此，包涵體蛋白的復性已經(jīng)成為重組蛋白產(chǎn)業(yè)化的瓶頸技術(shù)之一[12-13]。為了制備適用于弓形蟲診斷試劑盒的可溶性蛋白，本研究選擇克隆RH株弓形蟲的截短GRA1基因，構(gòu)建原核表達載體，獲得高純度的可溶性GRA1蛋白，并且利用獲得的可溶性蛋白進行小鼠免疫制備單克隆抗體。通過Western blot和間接免疫熒光試驗（indirect immunofluorescence assay，IFA）鑒定其免疫學活性，為深入挖掘該蛋白的診斷作用和其他生物學功能提供基礎。

1 材料與方法

1.1 蟲體、菌株與載體 剛地弓形蟲RH株由中國農(nóng)業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所寄生蟲病實驗室提供；大腸桿菌（E. coli）BL21（DE3）感受態(tài)細胞購自北京康為世紀生物科技有限公司；質(zhì)粒pET-28a(+)由本實驗室保存；昆明系、BALB/C系雌性小鼠購自上海斯萊克實驗動物有限公司；Vero細胞由本實驗室保存。

1.2 主要試劑 限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和XhoⅠ，T4 DNA連接酶及DL2000 DNA Marker，DL15000 DNA Marker均購自寶生物工程（大連）有限公司；胰蛋白胨、酵母提取物和瓊脂粉購自英國OXOID公司；瓊脂糖凝膠回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒均為美國AXYGEN公司產(chǎn)品；總RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Thermo Scientific公司；異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）購自生工生物工程股份有限公司；蛋白Marker購自美國Promega公司；His·bind Resin純化試劑盒購自德國Merck公司；BCA蛋白定量試劑盒購自Bio-Rad公司；ECL底物顯色液試劑盒購自賽默飛世爾科技公司；DAPI購自碧云天公司；AlexaFluor488標記的驢抗鼠IgG為Jackson公司產(chǎn)品。

1.3 引物的設計與合成 根據(jù)弓形蟲RH株GRA1基因（GenBank登錄號：HM067753.1），利用UniProt網(wǎng)站分析去除信號肽，使用Primer Primier 5.0軟件設計1對特異性引物。預期擴增片段長度為501 bp，在上下游引物前端引入EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位點（劃線部分是酶切位點），上游引物F：5'-AT CGAATTCGCCGAAGGCGGCGACAAC-3'，下游引物R：5'-GCGCTCGAGTTACTCTCTCTCT CCTGTTAGG-3'。引物由上海睿勉生物科技有限公司合成。

1.4 弓形蟲速殖子的收集和RNA提取 復蘇實驗室保存的RH株弓形蟲，接種于昆明鼠腹腔。待小鼠明顯發(fā)?。s3 d后），用無菌生理鹽水沖洗小鼠腹腔收集腹水，2000 r/min離心10 min，棄上清收集蟲體。用TRIzol法提取RNA于－80℃保存。

1.5 GRA1基因的RT-PCR擴增 將提取的RNA用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄制備cDNA，作為RT-PCR擴增模板。擴增體系（25 μL）：上、下游引物和模板各1 μL、2×TaqMix 12.5 μL、ddH2O 9.5 μL。反應條件：94℃預變性 3 min；94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸1 min，反應進行30個循環(huán)；72℃再延伸10 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定，采用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收目的片段備用。

1.6 重組表達質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定 用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒pET-28a（+），分別對目的片段和質(zhì)粒pET-28a（+）進行EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切，并用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收目的片段。用T4 DNA連接酶將雙酶切后的GRA1片段和pET-28a（+）片段16℃連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細胞，挑取單菌落擴增后提取質(zhì)粒進行雙酶切鑒定。鑒定的陽性重組質(zhì)粒送至英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司測序。

1.7 重組質(zhì)粒的誘導表達

1.7.1 重組質(zhì)粒的原核表達及可溶性分析 將篩選的含陽性重組質(zhì)粒的菌株接種于5 mL含卡那霉素（Kan+）70 μg/mL的LB培養(yǎng)基，37℃、200 r/min培養(yǎng)8 h。以1∶100的比例接種于250 mL LB（Kan+）培養(yǎng)基中，相同條件培養(yǎng)至菌液OD600值為0.6～0.8時，加入終濃度為1 mmol/L的IPTG，22℃、180 r/min誘導14 h，同時設置陰性對照。將菌液以8000 r/min離心10 min，收集菌體，用PBS重懸菌體并洗滌3次，然后用PBS將菌體重懸置于冰上超聲破碎，4℃、12 000 r/min離心10 min后，分離上清和沉淀，重懸沉淀與上清分別進行SDS-PAGE電泳，鑒定重組蛋白的存在形式。

1.7.2 不同pH值的LB液體培養(yǎng)基中表達產(chǎn)物的SDSPAGE分析 取過夜培養(yǎng)菌體母液，分別接種于pH 6.5、pH 7.0、pH 7.5和pH 8.0的含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基，在OD600值為0.6～0.8時，加入IPTG（終濃度為0.05 mmol/L），28℃、180 r/min過夜誘導表達。收集菌體，處理方法同上，分別取上清進行SDS-PAGE分析。

1.7.3 不同IPTG濃度下表達產(chǎn)物的SDS-PAGE分析 細菌培養(yǎng)方法同1.7.1，分別加入終濃度為0.05、0.1、0.5、1 mmol/L的IPTG過夜誘導表達。菌體處理方法同1.7.1，分別收集上清進行SDS-PAGE分析，確定最佳的IPTG終濃度。

1.7.4 不同誘導溫度下表達產(chǎn)物的SDS-PAGE分析細菌培養(yǎng)方法同1.7.1，加入IPTG后過夜誘導表達，誘導表達溫度分別為22℃、28℃、37℃。收集菌體，處理方法同1.7.1，分別取上清進行SDS-PAGE分析，確定最佳誘導溫度。

1.8 重組蛋白GRA1的純化 將誘導表達的菌體超聲破碎后收集上清，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后，通過His·bind Resin純化試劑盒純化重組蛋白GRA1，BCA法測定濃度。

1.9 單克隆抗體的制備 用純化的重組蛋白GRA1按常規(guī)方法免疫3只8周齡的BALB/c雌性小鼠。多次免疫后用間接ELISA測定多抗效價，當效價≥10 000，取脾臟細胞與SP/20骨髓瘤細胞融合。分別用His標簽蛋白和GRA1蛋白作為包被原篩選出陽性克隆，進行亞克隆，待所有亞克隆孔上清陽性率為100%時，取生長狀態(tài)良好的亞克隆株細胞進行擴大培養(yǎng)，接種于BALB/c小鼠腹腔或液氮保存。待小鼠瀕死不動時，收集腹水，離心除去雜質(zhì)，－70℃保存。

1.10 重組蛋白GRA1的鑒定

1.10.1 重組蛋白GRA1的Western blot分析 以自然感染弓形蟲的犬陽性血清（1∶200稀釋）為一抗，健康犬的血清做陰性對照（1∶200稀釋），以辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗犬IgG（1∶2000稀釋）為二抗，最后ECL顯色并拍照保存。

1.10.2 重組蛋白GRA1的間接免疫熒光試驗分析 將弓形蟲接種入侵Vero細胞，并制備細胞爬片。1×PBS洗滌后用4%多聚甲醛于4℃固定10 min后，0.5% TritonX-100穿孔作用15 min；1%的BSA/PBS于濕盒內(nèi)37℃封閉30 min后，加入經(jīng)1%BSA/PBS液稀釋的抗GRA1的單克隆抗體（1∶5000稀釋）作為一抗；AlexaFluor488標記的驢抗鼠IgG作為二抗；細胞爬片經(jīng)DAPI復染細胞核后，蔡司激光共聚焦顯微鏡（600倍油鏡）采集圖像。

2 結(jié)果

2.1 GRA1基因的擴增 以弓形蟲RH株RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，采用RT-PCR方法擴增GRA1基因，擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析。結(jié)果顯示，在大約501 bp處有單一條帶，與預期結(jié)果一致（圖1），空白對照組未出現(xiàn)條帶。

圖1 GRA1基因的RT-PCR擴增Fig.1 RT-PCR amplifi cation of GRA1 gene

2.2 重組表達質(zhì)粒的鑒定

2.2.1 重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定 重組質(zhì)粒pET-28a(+)-GRA1經(jīng)EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切后可見有兩條條帶，大小與理論值相符（圖2），表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.2.2 重組質(zhì)粒測序結(jié)果分析 測序結(jié)果顯示，GRA1基因全長501 bp，編碼166個氨基酸。BLAST比對顯示，與弓形蟲RH株GRA1基因mRNA同源性為100%。

2.3 原核表達產(chǎn)物的SDS-PAGE及可溶性分析 將誘導表達的菌體重懸于冰上超聲破碎，離心后分別取上清和沉淀進行SDS-PAGE分析（圖3），結(jié)果顯示，在23 kDa處有明顯的蛋白條帶，而對照組在此處未出現(xiàn)條帶，說明重組蛋白正確表達，且主要以可溶性表達形式存在于上清。

圖2 pET-28a(+)-GRA1重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定Fig.2 by restriction enzyme digestion Identifi cation of pET-28a(+)-GRA1

圖3 pET-28a(+)-GRA1表達產(chǎn)物的SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE analysis of pET-28a(+)-GRA1 expression

2.4 重組質(zhì)粒原核表達條件的優(yōu)化

2.4.1 LB液體培養(yǎng)基的pH值對表達產(chǎn)物的影響 在溫度28℃、轉(zhuǎn)速180 r/min和IPTG終濃度為0.05 mmol/L的誘導表達條件下，分析不同pH值的LB液體培養(yǎng)基對表達產(chǎn)物的影響。結(jié)果表明，LB液體培養(yǎng)基pH值在6.5和7.0時，目的蛋白可溶性表達量差別不大；LB液體培養(yǎng)基pH值在7.5和8.0時，蛋白可溶性表達量差別不明顯。綜合比較，目的蛋白在偏堿性環(huán)境中可溶性表達量稍多（圖4）。

圖4 不同pH值LB培養(yǎng)基中pET-28a(+)-GRA1表達產(chǎn)物的SDS-PAGE分析Fig.4 SDS-PAGE analysis of the expression products of pET-28a (+) -GRA1 at different pH values of LB

2.4.2 不同IPTG終濃度下表達產(chǎn)物的SDS-PAGE分析 在溫度28℃、轉(zhuǎn)速180 r/min和pH值為7.5的LB液體培養(yǎng)基的誘導表達條件下，分析不同IPTG終濃度對表達產(chǎn)物的影響。結(jié)果表明，IPTG的終濃度大于0.1 mmol/L時，目的蛋白在上清中表達量差別不大，但是IPTG終濃度為0.05 mmol/L時，目的蛋白可溶性表達量更多（圖5）。

圖5 不同濃度IPTG誘導下pET-28a(+)-GRA1表達產(chǎn)物的SDS-PAGE分析Fig.5 SDS-PAGE analysis of the expression products of pET-28a (+) -GRA1 at different concentrations of IPTG

2.4.3 不同誘導溫度下表達產(chǎn)物的SDS-PAGE分析在IPTG終濃度為0.05 mmol/L、轉(zhuǎn)速180 r/min和pH值為7.5的LB液體培養(yǎng)基的誘導表達條件下，誘導溫度在28℃時，可溶性目的蛋白表達量最大，選擇該溫度作為最佳的誘導表達溫度（圖6）。

圖6 不同溫度下pET-28a(+)-GRA1表達產(chǎn)物的SDSPAGE分析Fig.6 SDS-PAGE analysis of expression products of pET-28a (+) -GRA1 at different temperatures

2.5 重組蛋白的純化 收集誘導好的菌體于冰上超聲破碎，離心取上清過濾膜除菌后進行蛋白純化。按照His·bind Resin純化試劑盒的操作步驟成功獲得高純度的重組蛋白（圖7），BCA法測定重組蛋白濃度為5.27 mg/mL。

2.6 雜交瘤細胞株篩選與效價測定 獲得細胞克隆后通過間接ELISA篩選陽性株，包被物分別為重組蛋白GRA1和His標簽蛋白，與重組蛋白GRA1反應而不與His標簽蛋白反應的細胞株為陽性克隆。篩選到1B7、1C7孔特異性比較高，亞克隆至第四代后陽性率達到100%，選擇抗體效價高的細胞株進行擴大培養(yǎng)并保種。收集的腹水測定效價高達1∶1×105，-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

圖7 重組蛋白GRA1純化后的SDS-PAGE分析Fig.7 SDS-PAGE analysis of the purifi ed recombinant protein GRA1

2.7 重組蛋白GRA1的Western blot分析 將純化后的重組蛋白GRA1進行Western blot分析。結(jié)果顯示，該蛋白能夠被弓形蟲感染的犬陽性血清識別，在24 kDa處有特異性條帶，說明重組蛋白GRA1有良好的反應原性（圖8）。

圖8 重組蛋白GRA1的Western blot分析Fig.8 Western blot analysis of the recombinant protein GRA1

2.8 間接免疫熒光試驗分析 用重組蛋白GRA1免疫小鼠，常規(guī)方法制備單克隆抗體進行間接免疫熒光試驗。通過激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)制備的單克隆抗體能特異性識別弓形蟲的天然蛋白GRA1，且主要分布在弓形蟲細胞質(zhì)內(nèi)（圖9）。

圖9 重組蛋白GRA1單抗的免疫熒光檢測Fig.9 Immunofl uorescence assay of monoclonal antibody against recombinant protein GRA1

3 討論

對弓形蟲病早診斷早治療，可減少其對養(yǎng)殖業(yè)造成的經(jīng)濟損失以及給人類帶來的危害。目前，對于弓形蟲病診斷常用的方法有PCR、原位雜交、病原分離及組織學方法和血清學診斷[14]。由于弓形蟲隱性感染多無明顯癥狀，因此臨床上主要通過檢測IgG和IgM來判斷弓形蟲是否存在感染，但血清學診斷在區(qū)分弓形蟲急性感染和既往感染時存在一定的缺陷。IgG在血清中出現(xiàn)比較晚，感染3周后才能被檢測到，只能確定是既往感染；IgM在血清中雖然出現(xiàn)最早，可以用來檢測弓形蟲急性感染，但是存在一定的假陽性率[15-16]。弓形蟲循環(huán)抗原存在于弓形蟲感染早期、急性感染和活動期的血液中。Raizman等[17]首先在弓形蟲感染的兔和鼠血清中檢測到CAg，證實CAg具有早期診斷的應用價值，并且檢出時間明顯早于IgM[18]。研究表明對于急性弓形蟲感染，通過直接檢測循環(huán)抗原比直接檢測弓形蟲具有更高的靈敏性，故GRA1免疫原性較強，具有早期診斷的潛力[19]。

pET系統(tǒng)是有史以來在E.coli中克隆表達重組蛋白功能最強大的系統(tǒng)。本實驗室利用該系統(tǒng)成功獲得多個蛋白的可溶性表達[20-22]。龔婷等[23]進行了雞IL-2全基因和去信號肽基因的原核表達研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)全基因的mRNA 5'端序列形成了復雜且較為穩(wěn)定的二級結(jié)構(gòu)，不利于翻譯的起始，說明信號肽序列的存在對ChIL-2基因在原核細胞中的表達有一定的影響。本研究選擇pET-28a(+)原核表達載體，根據(jù)UniProt網(wǎng)站分析GRA1蛋白N端的1-24位氨基酸為信號肽，去除N端疏水性信號肽構(gòu)建截短型的GRA1基因重組質(zhì)粒，發(fā)現(xiàn)重組蛋白在LB液體培養(yǎng)基偏堿性、28℃和低濃度IPTG（0.05 mmol/L）誘導表達條件下獲得大量可溶性表達。Western blot鑒定顯示該蛋白能夠與感染弓形蟲的犬陽性血清反應，說明本研究獲得的重組蛋白保持了天然蛋白的免疫原性，不影響后續(xù)的實驗研究。安立剛等[20]也證明通過截短目的基因獲得目的蛋白的方法具有可行性。由于真核表達如畢赤酵母表達體系蛋白表達水平高，生產(chǎn)成本低，產(chǎn)物純化難度高，因此本研究選用原核表達系統(tǒng)進行截短基因表達，蛋白表達量高，成本低且易于純化。根據(jù)表達載體上的His標簽分離蛋白，利用商品化的His標簽純化試劑盒即可獲得目的蛋白，并且純化效率很高。所獲得的重組蛋白經(jīng)常規(guī)方法制備其單克隆抗體，IFA鑒定顯示單克隆抗體能夠與弓形蟲體內(nèi)的GRA1蛋白發(fā)生特異性反應。由于GRA1蛋白是弓形蟲CAg成分之一，因此，本研究獲得的可溶性GRA1蛋白對弓形蟲病早期診斷具有一定意義，為進一步深入研究其在弓形蟲體內(nèi)發(fā)揮的生物學功能提供了基礎。