烏那爾汗·吉斯汗，任衍倍，孟凡峰，田似報(bào)，符玉涓，張繼紅，李 舵，美熱木古麗，任 娟 ，林漢亮 ，崔治中 ,3,4，常 爽 ,3,4，趙 鵬 ,3,4

（1.新疆動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，烏魯木齊 830000；2.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，泰安 271018；3.山東省動(dòng)物生物工程與疾病防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，泰安 271018；4.山東省畜禽疫病防制工程技術(shù)研究中心，泰安 271018）

豬偽狂犬?。≒orcine pseudorabies，PR）是由豬偽狂犬病病毒（Porcine pseudorabies virus，PRV）感染引起的一種高度接觸性、急性傳染病[1]。PRV最早于1813年在美國(guó)被發(fā)現(xiàn)[2]。豬是PRV的原發(fā)貯存宿主，能夠長(zhǎng)期貯存和排出病毒，在PR的傳播中起著重要的作用[3]。豬偽狂犬病臨床癥狀為發(fā)熱、奇癢和腦脊髓炎，能夠引起妊娠母豬繁殖障礙，流產(chǎn)，產(chǎn)死胎等；新生仔豬會(huì)出現(xiàn)神經(jīng)癥狀、腹瀉、嘔吐、生長(zhǎng)不良等，死亡率很高[4]。

PRV基因組為線性雙股DNA，大小約150 kb，G+C含量高達(dá)73%[5-6]。gE基因是重要的毒力基因，對(duì)于病毒在宿主神經(jīng)系統(tǒng)中的侵襲和擴(kuò)散起著決定性作用[7]。gE基因的缺失會(huì)降低 PRV在神經(jīng)系統(tǒng)中的感染和擴(kuò)散，并且會(huì)提高動(dòng)物的耐受性，使用時(shí)比較安全[8]。同時(shí)gE基因缺失對(duì)于病毒的復(fù)制和中和抗體的產(chǎn)生影響不大。因此，gE基因缺失苗在世界各國(guó)應(yīng)用非常廣泛[9]。

近年來(lái)，豬偽狂犬病在各個(gè)地區(qū)普遍流行，給我國(guó)的養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[10-12]。20世紀(jì)70年代以后，應(yīng)用基因工程缺失疫苗和人工篩選的自然弱毒疫苗，使PR得到了有效地控制[13]。當(dāng)前 PR防控主要依靠疫苗免疫，現(xiàn)有疫苗雖然能夠減輕臨床癥狀并減少排毒，但并不能預(yù)防潛伏感染。2011年P(guān)RV變異毒株的出現(xiàn)使豬PR在全國(guó)范圍內(nèi)再次流行[14]。因此，控制感染豬群并清除潛伏感染豬群等手段被廣泛應(yīng)用于 PR 防控。PR在臨床癥狀上容易與一些其他疾病混淆，僅通過(guò)臨床癥狀和病理剖檢很難做出準(zhǔn)確診斷，因此實(shí)驗(yàn)室診斷是PRV的重要診斷方法。PRV實(shí)驗(yàn)室診斷主要通過(guò)病毒的分離鑒定、PCR及血清學(xué)試驗(yàn)等方法。血清學(xué)診斷方法包括酶聯(lián)免疫吸附方法（ELISA）和間接免疫熒光檢測(cè)（indirect immunofluorescence assay，IFA）等[15-18]。血清學(xué)診斷對(duì)試驗(yàn)儀器要求較高，PCR檢測(cè)往往存在假陽(yáng)性或假陰性，一般需要通過(guò)測(cè)序進(jìn)一步驗(yàn)證，而病毒分離檢測(cè)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。因此，建立一種快速、簡(jiǎn)便、靈敏度高、特異性強(qiáng)的可以鑒別診斷PRV野毒和gE基因缺失疫苗毒的檢測(cè)方法，對(duì)PRV的防制和凈化具有重要意義。本研究針對(duì)PRV的gE基因設(shè)計(jì)探針，建立了基于gE基因的PCR結(jié)合核酸斑點(diǎn)雜交檢測(cè)方法，為該病的診斷和流行病學(xué)調(diào)查提供了技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 病毒與病料 豬偽狂犬病毒SDTA2016株由本實(shí)驗(yàn)室分離鑒定和保存；在山東省不同豬場(chǎng)隨機(jī)采集53份豬病料，研磨后按照天根DNA提取試劑盒操作說(shuō)明書提取病料DNA，－80℃保存。

1.2 PRV探針的設(shè)計(jì)及制備 根據(jù)NCBI上已經(jīng)發(fā)表的PRV的gE基因核酸序列，分別設(shè)計(jì)和合成了兩對(duì)引物。以SDTA2016毒株的DNA為模板，用引物PRV-F2/PRV-R2（表1）擴(kuò)增，構(gòu)建重組質(zhì)粒，命名為PRV-gE。以質(zhì)粒PRV-gE為模板，利用引物PRV-F1/PRV-R1（表1），按照PCR DIG Probe Synthesis Kit（Roche，USA）試劑盒說(shuō)明書標(biāo)記PRV的gE基因DIG標(biāo)記核酸探針。標(biāo)記的gE基因核酸探針經(jīng)凝膠回收純化后進(jìn)行定量，－80℃保存?zhèn)溆?。同時(shí)引物PRV-F2/PRV-R2也用于樣品組織DNA的常規(guī)PCR檢測(cè)。引物由上海生工生物工程有限公司合成。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.3 PCR結(jié)合核酸斑點(diǎn)雜交檢測(cè) 首先利用引物PRV-F2/PRV-R2對(duì)待檢測(cè)樣品的DNA進(jìn)行擴(kuò)增，對(duì)反應(yīng)體系以及反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳PCR反應(yīng)體系（50 μL）：2×GC Buffer25 μL、dNTP4 μL、引物PRV-F2/PRV-R2各0.5 μL、模板1 μL、PrimeSTAR酶0.5 μL，ddH20補(bǔ)足50 μL。最佳反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min；98℃變性10 s，60℃退火5 s，72℃延伸45 s，共30個(gè)循環(huán)；72℃再延伸5 min。取2 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物點(diǎn)于尼龍膜上，按照DIG Nucleic Acid Detection Kit說(shuō)明書并參照文獻(xiàn)進(jìn)行核酸斑點(diǎn)雜交檢測(cè)[19]。

1.4 PCR結(jié)合核酸斑點(diǎn)雜交檢測(cè)的特異性和靈敏性 對(duì)豬瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）、豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）的cDNA以及豬圓環(huán)病毒2型（Porcine circovirus type 2，PCV2）和PRV gE基因缺失疫苗株的DNA，運(yùn)用建立的PCR結(jié)合核酸斑點(diǎn)雜交方法進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)該方法的特異性。將質(zhì)粒PRV-gE進(jìn)行定量后作倍比稀釋，濃度分別為100 ng/μL～1 pg/μL，稀釋的質(zhì)粒作為模板，分別采用PCR和PCR結(jié)合核酸斑點(diǎn)雜交方法進(jìn)行檢測(cè)，比較這兩種方法的靈敏性。最后，分別運(yùn)用PCR和PCR結(jié)合核酸斑點(diǎn)雜交方法檢測(cè)53份臨床樣品的DNA。

2 結(jié)果與討論

2.1 PCR結(jié)合核酸斑點(diǎn)雜交特異性 用建立的PCR結(jié)合斑點(diǎn)雜交檢測(cè)方法，對(duì)SDTA2016毒株、PRV gE基因缺失疫苗株、PCV2、CSFV、PEDV、PRRSV的PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，并以滅菌的超純水作為陰性對(duì)照。結(jié)果DIG標(biāo)記的PRV gE基因探針，只與SDTA2016毒株的PCR產(chǎn)物反應(yīng)呈陽(yáng)性，而與PRV疫苗株和其他幾種病毒的PCR產(chǎn)物以及超純水反應(yīng)均不顯色（圖1），顯示出該方法具有較好的特異性。

圖1 PCR結(jié)合斑點(diǎn)雜交檢測(cè)豬偽狂犬病病毒的特異性試驗(yàn)Fig.1 Specifi city results of PCR-based dot blot hybridization technique for PRV

2.2 PCR結(jié)合核酸斑點(diǎn)雜交檢測(cè)的靈敏性 運(yùn)用建立的PCR結(jié)合核酸斑點(diǎn)雜交檢測(cè)方法，對(duì)各稀釋梯度的PRV-gE質(zhì)粒進(jìn)行雜交。PCR結(jié)合核酸斑點(diǎn)雜交檢測(cè)顯色到第5個(gè)梯度，并隨著濃度遞減顏色逐漸變淡，最低檢出量為10 pg/μL（圖2A）。運(yùn)用PCR方法對(duì)各質(zhì)粒進(jìn)行檢測(cè)，僅能檢測(cè)到1 ng/μL（圖2B），明顯低于PCR結(jié)合核酸斑點(diǎn)雜交檢測(cè)的靈敏度。

圖2 PCR結(jié)合斑點(diǎn)雜交檢測(cè)和普通PCR的靈敏性比較Fig.2 Sensitivity comparison of PCR-based dot blothybridization technique and normal PCR

2.3 PCR結(jié)合核酸斑點(diǎn)雜交檢測(cè)在臨床樣品檢測(cè)中的應(yīng)用 應(yīng)用引物PRV-F2/PRV-R2對(duì)53份病料先進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳結(jié)果顯示共有4份病料呈PRV陽(yáng)性，陽(yáng)性率為7.55%（圖3A）。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物點(diǎn)于尼龍膜上進(jìn)行核酸斑點(diǎn)雜交檢測(cè)，可見(jiàn)有5份樣品顯示陽(yáng)性，比單純PCR檢出率高（圖3B）。

本研究建立的PCR結(jié)合核酸斑點(diǎn)雜交檢測(cè)的方法，可在一張尼龍膜上一次性檢測(cè)大量的樣本，操作簡(jiǎn)單，探針特異性好并可重復(fù)使用，對(duì)儀器設(shè)備要求比較低，并且相對(duì)于傳統(tǒng)PCR和病毒分離鑒定等方法，靈敏性高，特異性強(qiáng)，用時(shí)較短。運(yùn)用建立的PCR結(jié)合核酸斑點(diǎn)雜交檢測(cè)方法對(duì)山東省部分地區(qū)收集到的53份病料進(jìn)行檢測(cè)，共檢出5份陽(yáng)性，檢出率為9.43%，說(shuō)明PRV在山東省仍有一定流行。

圖3 臨床樣品的PCR檢測(cè)和PCR結(jié)合核酸斑點(diǎn)雜交檢測(cè)結(jié)果Fig.3 PCR and PCR-based dot blot hybridization detection result for clinical samples

從最初自然缺失gE基因的Bartha株到gE/TK基因雙缺失及gI/gE/TK基因三缺失等疫苗株的出現(xiàn)，相對(duì)應(yīng)的鑒別診斷方法一直在不斷改變。利用分子生物學(xué)方法對(duì)PRV進(jìn)行病原學(xué)檢測(cè)，對(duì)于評(píng)價(jià)臨床感染情況有著重要意義，可為獸醫(yī)臨床制定合理的免疫程序和凈化程序提供重要參考。本研究建立的PCR結(jié)合核酸斑點(diǎn)雜交檢測(cè)方法不僅顯示了較高的靈敏度，更重要的是通過(guò)探針的嚴(yán)格把關(guān)確保了檢測(cè)的特異性，節(jié)省了測(cè)序的時(shí)間，將在PRV的鑒別診斷和凈化中發(fā)揮重要作用。