程曉蕾，陳桂平，王霄旸，王春梅，劉迎春，薛飛群，王 米，張可煜

（1. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部獸用化學(xué)藥物及制劑學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200241；2. 江西省養(yǎng)蜂研究所，南昌 330052）

雞球蟲病（coccidiosis）是由艾美耳屬（Eimeria）的一種或多種球蟲寄生于雞消化道引發(fā)腸道嚴(yán)重感染的一種原蟲病，能導(dǎo)致雞血便，飼料利用率降低甚至死亡，對養(yǎng)雞業(yè)危害巨大[1]。多年來化學(xué)藥物，如磺胺類、聚醚類、三嗪類等一直是防治球蟲病的主要手段[2-3]。然而，隨著這些藥物在臨床上的長期、反復(fù)使用，甚至濫用，球蟲耐藥現(xiàn)象非常普遍，即使是曾經(jīng)被認(rèn)為抗球蟲最有效的地克珠利（diclazuril）也已顯現(xiàn)出非常嚴(yán)重的耐藥性問題[4-6]。此外，還有一些曾經(jīng)被廣泛應(yīng)用的藥物，近些年被發(fā)現(xiàn)具有嚴(yán)重的食品安全或環(huán)境生態(tài)毒性，因而被（或?qū)⒈唬┙够蛳拗剖褂?。因此，人們能選擇使用的抗球蟲化學(xué)藥物越來越少，尋求一種安全、高效，對環(huán)境友好、無交叉耐藥的新型抗球蟲藥物成為當(dāng)前抗球蟲研究領(lǐng)域的重要任務(wù)[4,7-9]。

沙咪珠利（Ethanamizuril）是上海獸醫(yī)研究所獸用抗感染藥物創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)合成的新型三嗪類化合物。已有研究結(jié)果顯示，沙咪珠利起效劑量為5 mg/kg，添加劑量達(dá)9 mg/kg以上時(shí)，抗球蟲指數(shù)（anticoccidial index, ACI）穩(wěn)定在185～200之間，屬于高效抗球蟲藥物[6,10-12]。沙咪珠利無致畸、致癌、致突變等毒性作用，對環(huán)境生物影響小，安全范圍廣，抗球蟲效果好，具有廣闊的應(yīng)用前景[11-13]。藥物血漿蛋白結(jié)合率是藥代動力學(xué)的重要參數(shù)之一，影響著藥物在機(jī)體的分布、代謝、消除和排泄，與藥物的藥理、毒理作用強(qiáng)度密切相關(guān)[14]。但是，沙咪珠利的蛋白結(jié)合特征目前仍未見相關(guān)研究報(bào)道。本研究利用平衡透析法模擬沙咪珠利與雞血漿蛋白結(jié)合過程，探索其蛋白結(jié)合特征，為進(jìn)一步指導(dǎo)沙咪珠利的新藥研究以及臨床合理用藥提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 沙咪珠利對照品（含量≥99.8%）由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所獸用抗感染藥物創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)合成；地克珠利、妥曲珠利（含量≥99%），上海維編科貿(mào)有限公司；健康雞由無任何藥物飼料飼養(yǎng)至4周齡，經(jīng)心臟采血離心后獲得雞血漿，－20℃保存；DMSO、乙腈、乙酸乙酯、磷酸、氯化鈉、磷酸二氫鉀等均為分析純化學(xué)試劑，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；乙腈（色譜純）、甲醇（色譜純）購自Fisher公司；磷酸氫二鉀（分析純）購自上海實(shí)驗(yàn)試劑有限公司。

1.2 儀器與其他 高效液相色譜儀（HPLC）：2695型，購自美國Waters公司（配Waters 2487檢測器）；氮吹儀：N-Evap型，購自美國Organomation Associates公司；渦旋混合器：XW-OA型，購自上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠；離心機(jī)：Micro CL 17/21型，購自美國Thermo公司；微孔濾膜：0.22 μm，購自上海安譜實(shí)驗(yàn)科技有限公司；34MM透析袋購自美國biosharp公司（MWCO∶14000）。

1.3 溶液的配制 藥物儲備液的配制：準(zhǔn)確稱取20 mg沙咪珠利和20 mg妥曲珠利，分別置于10 mL容量瓶中，然后用乙腈溶解并定容至刻度；準(zhǔn)確稱取20 mg地克珠利置于10 mL容量瓶中，然后用DMSO溶解并定容至刻度。分別得到2000 μg/mL的沙咪珠利、妥曲珠利和地克珠利儲備液，置4℃冰箱中密封保存。取適量儲備液用乙腈分別稀釋至所需濃度即為不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液。

空白透析液的配制：分別稱取2.59 g磷酸二氫鉀、14.11 g磷酸氫二鉀和1.99 g氯化鈉置于1 L容量瓶中，加水稀釋并定容，得到pH為7.4的磷酸鹽緩沖透析液。

1.4 樣品預(yù)處理 透析內(nèi)液（血漿）200 μL置于2 mL離心管中，加入乙酸乙酯1200 μL，渦旋混合60 s，靜置后4℃、14 800×g離心 15 min，轉(zhuǎn)移有機(jī)層，氮?dú)獯蹈?，流動相?fù)溶，渦旋30 s，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，置于進(jìn)樣瓶中，進(jìn)樣量為10 μL，經(jīng)HPLC檢測。透析外液的處理同上。

1.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 透析內(nèi)液：在200 μL空白血漿中加入沙咪珠利標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制成血藥濃度為0.5、1、5、10、20、50、100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)樣品。按1.4所述方法預(yù)處理后進(jìn)行HPLC檢測。依照峰面積和對應(yīng)濃度做圖，求得回歸方程。

透析外液：在200 μL空白透析液中加入沙咪珠利標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制成濃度為0.1、0.2、0.5、1、2.5、5、10 μg/mL，按1.4中方法預(yù)處理，然后進(jìn)行HPLC檢測。依照峰面積和對應(yīng)濃度做圖，求得回歸方程。

1.6 色譜條件 色譜柱：Diamonsil 5μm C18, 250 mm×4.6 mm；保護(hù)柱：EasyGuard C18 10 mm×4.6 mm；流動相：甲醇∶0.2%磷酸水（65∶35）等度洗脫；流速：1 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL；柱溫：30℃；紫外檢測波長：251 nm。

1.7 精密度和回收率 透析內(nèi)液：取空白血漿200 μL，按1.5中方法操作，制備高（100 μg/mL）、中（20 μg/mL）、低（1 μg/mL）3個(gè)濃度的血漿樣品系列，每個(gè)系列5個(gè)平行樣品，按1.6中色譜條件進(jìn)行檢測。相同的方法每日重復(fù)測定3批，連續(xù)3日，計(jì)算回收率及精密度。

透析外液：取200 μL空白透析液，按1.5中方法操作，制備高（10 μg/mL）、中（1 μg/mL）、低（0.1 μg/mL）3個(gè)濃度的樣品系列，每個(gè)系列5個(gè)平行樣品，按1.6中色譜條件進(jìn)行檢測。相同的方法每日重復(fù)測定3批，連續(xù)3日，計(jì)算回收率及精密度。

1.8 平衡透析實(shí)驗(yàn) 透析袋用透析外液活化后取出，一端折疊后用棉線扎緊，從另一端加入1 mL空白血漿，排除透析袋中空氣后將此端也折疊夾緊。將透析袋懸浮于沙咪珠利濃度分別為1、5、10 μg/mL的30 mL透析液中，每個(gè)濃度5個(gè)平行，4℃條件下，透析至平衡。透析完全后，用10%的高氯酸檢查透析內(nèi)液是否滲出，出現(xiàn)渾濁者棄用。

1.9 透析袋的吸附率 采用文獻(xiàn)[15]中方法，將1 mL（V1）空白透析液加入到活化好的透析袋中，放置于含有沙咪珠利濃度（C1）分別為1、5、10 μg/mL的30 mL（V2）透析外液中，每個(gè)濃度5個(gè)平行，放置于4℃冰箱中。待平衡后分別取透析外液進(jìn)行檢測，得出藥物濃度C2。

1.10 蛋白結(jié)合率測定 分別測定透析袋內(nèi)藥物質(zhì)量濃度ρA（總質(zhì)量濃度）和透析外液藥物質(zhì)量濃度ρB(游離藥物質(zhì)量濃度），根據(jù)公式計(jì)算血漿蛋白結(jié)合率：F=（ρA-ρB）/ρA。

1.11 透析溫度對結(jié)合率的影響 透析袋中加入1.0 mL空白血漿后，懸浮于沙咪珠利濃度分別為1.0、5.0、10 μg/mL的30 mL透析液中，每個(gè)濃度5組，分別放入4℃、20℃、37℃的恒溫培養(yǎng)箱中透析，每組5個(gè)重復(fù)，直到透析平衡。測定透析袋內(nèi)藥物濃度A（總濃度）和透析外液藥物濃度B（游離藥物濃度），按1.10中公式計(jì)算蛋白結(jié)合率。

1.12 沙咪珠利與血漿蛋白的結(jié)合競爭 按1.8的方法制備含沙咪珠利濃度分別為1.0、5.0、10 μg/mL，同時(shí)含地克珠利或妥曲珠利濃度為5.0 μg/mL的透析樣品，放置于4℃，直到透析平衡。每個(gè)沙咪珠利濃度3個(gè)重復(fù)，分別檢測沙咪珠利、地克珠利、妥曲珠利與血漿蛋白的競爭結(jié)合。將裝有1.0 mL空白血漿的透析袋懸浮于含沙咪珠利濃度分別為1.0、5.0、10 μg/mL的30 mL透析液中，透析平衡作為對照。平衡后測定透析袋內(nèi)藥物濃度A（沙咪珠利濃度）和透析外液藥物濃度B（游離沙咪珠利濃度），按1.10中公式計(jì)算蛋白結(jié)合率。

1.13 數(shù)據(jù)處理 數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析。比較各濃度組間、不同溫度和競爭條件下沙咪珠利與雞血漿蛋白結(jié)合率的差異。

2 結(jié)果

2.1 檢測方法的專屬性 透析內(nèi)液（空白血漿）、空白透析液與對應(yīng)加標(biāo)液樣品按1.4中方法處理后經(jīng)HPLC進(jìn)樣檢測的色譜圖，以及10 μg/mL地克珠利標(biāo)準(zhǔn)液、10 μg/mL地克珠利與沙咪珠利的混合標(biāo)準(zhǔn)液、10 μg/mL的妥曲珠利標(biāo)準(zhǔn)液、10 μg/mL的妥曲珠利與沙咪珠利的混合標(biāo)準(zhǔn)液經(jīng)HPLC進(jìn)樣檢測的色譜圖如圖1所示。透析內(nèi)液血漿（空白血漿）、空白透析液中的物質(zhì)、地克珠利、妥曲珠利對沙咪珠利無干擾，方法專屬性良好。

圖1 沙咪珠利含量檢測的HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of the determination of Ethanamizuril

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性范圍 分別以藥物濃度（X）和對應(yīng)峰面積（Y）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)回歸，透析內(nèi)液的回歸方程為：Y=34177X+9717.8，R2=0.9999。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線可知透析內(nèi)液中沙咪珠利在0.5～100 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，方法的定量下限為0.5 μg/mL。透析外液的回歸方程為：Y=4380.2X+8770.6，R2=0.9998。透析外液中沙咪珠利在0.1～10 μg/mL范圍內(nèi)的線性關(guān)系良好，方法的定量下限為0.1 μg/mL。

2.3 回收率及精密度 透析內(nèi)液（血漿）以及透析外液中分別添加高、中、低3個(gè)濃度沙咪珠利標(biāo)準(zhǔn)工作液，每個(gè)濃度平行測定5個(gè)樣品，3日內(nèi)重復(fù)3次的回收率及精密度如表1所示。從表1可知，透析內(nèi)液（血漿）的回收率在94.35%～111.8%之間，日內(nèi)精密度在1.16%～8.16%之間，日間精密度在4.85%%～7.35%之間；透析外液回收率在91.7%～104.4%之間，日內(nèi)精密度在1.07%～4.33%之間，日間精密度在1.83%～3.32%之間。方法的回收率及精密度良好，符合生物樣品的測定要求。

表1 沙咪珠利的回收率和精密度檢測結(jié)果（n=5）Table 1 Recovery and precision results of Ethanamizuril (n =5)

2.4 平衡時(shí)間的確定 將1 mL空白血漿置于透析袋中，于4℃在含1 μg/mL沙咪珠利的透析外液中放置0、24、38、44、52、62、68、76、86、92、98 h，取透析外液測定藥物濃度。以透析外液藥物濃度達(dá)到平衡時(shí)的時(shí)間為透析平衡時(shí)間。結(jié)果在52 h后各檢測時(shí)間點(diǎn)透析外液藥物濃度差異無顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，考慮透析的完全以及透析時(shí)間，試驗(yàn)透析時(shí)間設(shè)定為72 h。

2.5 透析袋吸附率 結(jié)果顯示，透析袋對沙咪珠利有微量吸附，但對血漿蛋白結(jié)合率檢測結(jié)果無顯著影響（表2）。因此可以采用此透析袋在實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行沙咪珠利血漿蛋白結(jié)合率的測定。

表2 透析袋的吸附率（n=5）Table 2 Adsorption rate of dialysate membrane (n=5)

2.6 沙咪珠利血漿蛋白結(jié)合率 4℃條件下，1、5、10 μg/mL濃度的沙咪珠利血漿蛋白結(jié)合率在92.17%～97.72%之間，血漿蛋白結(jié)合率隨藥物濃度的升高而呈下降趨勢，高濃度藥物與低濃度藥物的血漿蛋白結(jié)合率差異具有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），藥物濃度在1～10 μg/m L之間血漿蛋白結(jié)合率時(shí)具有一定的濃度依賴性。20℃條件下，1、5、10 μg/mL濃度的沙咪珠利血漿蛋白結(jié)合率在91.80%～97.47%之間，變化規(guī)律與4℃條件類似。37℃條件下，1、5、10 μg/mL濃度的沙咪珠利血漿蛋白結(jié)合率在78.63%～85.12%之間，血漿蛋白結(jié)合率也隨藥物濃度的升高而降低，但差異并無顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。與4℃和20℃相比較，37℃條件下，相同藥物濃度的血漿蛋白結(jié)合率降低，差異具有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），這可能與長時(shí)間平衡后蛋白在37℃條件下易降解有關(guān)（表3）。

2.7 沙咪珠利與血漿蛋白的結(jié)合競爭 沙咪珠利和其他三嗪類藥物在4℃與雞血漿蛋白的競爭結(jié)合結(jié)果見表4。沙咪珠利濃度為1.0、5.0、10.0 μg/mL時(shí)與濃度為5.0 μg/m L的地克珠利競爭后，與同濃度的沙咪珠利對照組相比，雞血漿蛋白結(jié)合率升高，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；而與妥曲珠利的競爭結(jié)果也與地克珠利類似，血漿蛋白結(jié)合率升高，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

3 討論

藥物與血漿蛋白的結(jié)合主要通過離子鍵、氫鍵、疏水性結(jié)合及范德華力結(jié)合，一般是一種可逆過程。通常只有游離型藥物才能通過脂膜向組織擴(kuò)散，被腎小管濾過或被肝臟代謝。因此，藥物與血漿蛋白的結(jié)合會明顯影響藥物分布、消除以及藥物作用的持續(xù)時(shí)間。本研究表明，沙咪珠利屬于高血漿蛋白結(jié)合藥物，且血漿蛋白結(jié)合率具有一定的濃度依賴性，由此可以推測沙咪珠利的半衰期較長。藥動學(xué)研究發(fā)現(xiàn)沙咪珠利在雞和大鼠體內(nèi)的消除半衰期都在10 h以上[12]，與本研究結(jié)果相符。

表3 沙咪珠利的血漿蛋白結(jié)合率Table 3 The plasma protein binding rate of Ethanamizuril

表4 沙咪珠利的血漿蛋白競爭結(jié)合率Table 4 The plasma protein competition binding rate of Ethanamizuril

藥物在血液中的分布平衡并非始終恒定，它會隨環(huán)境溫度、pH值、離子強(qiáng)度、蛋白含量等因素的變化而變化。本研究結(jié)果顯示，與4℃環(huán)境相比，沙咪珠利與雞血漿蛋白結(jié)合率在20℃環(huán)境下變化不大，而在37℃會顯著降低，推測可能是由于體外長時(shí)間的透析和較高的溫度使血漿蛋白發(fā)生了降解。當(dāng)幾種藥物同時(shí)使用時(shí)，還必須考慮藥物間結(jié)合競爭力的大小，以便較好預(yù)測各藥物在體內(nèi)的游離濃度。同類藥物由于取代基的不同，與血漿蛋白結(jié)合率也會不一樣[16]，一般同類藥物由于競爭會使藥物的蛋白結(jié)合率降低。本研究中地克珠利和妥曲珠利可以協(xié)同沙咪珠利的蛋白結(jié)合率升高，這可能是由于血漿蛋白在小分子結(jié)合過程中具有“柔性”（flexibility），兩者結(jié)合時(shí)空間構(gòu)象變化引起的[17]。

藥物的血漿蛋白結(jié)合率測定是新藥臨床前研究的重要內(nèi)容之一，平衡透析法是血漿蛋白結(jié)合常用的經(jīng)典參比方法[14]。本研究建立了沙咪珠利血漿蛋白結(jié)合率的HPLC檢測方法，采用平衡透析法首次開展了沙咪珠利的血漿蛋白結(jié)合率研究，為進(jìn)一步了解沙咪珠利的藥動學(xué)特性和臨床應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。