陳海霞，張 璐

0引言

年齡相關(guān)性黃斑變性(age-related macular degeneration，ARMD)是發(fā)達(dá)國(guó)家老年人致盲的首要疾病[1]。ARMD主要損害視網(wǎng)膜的黃斑區(qū)，疾病早期的病理學(xué)特點(diǎn)是蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和炎癥介質(zhì)等細(xì)胞外沉積物在視網(wǎng)膜形成玻璃膜疣[2]。ARMD分為兩型：干性ARMD和濕性ARMD。干性ARMD的特點(diǎn)是視網(wǎng)膜色素上皮(RPE)細(xì)胞的衰老和地圖樣缺失，而濕性ARMD的特點(diǎn)是RPE和脈絡(luò)膜血管的異常生長(zhǎng)。ARMD患者視網(wǎng)膜分析顯示，脂質(zhì)沉積在Bruch膜和RPE細(xì)胞導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[3]。

ARMD是一種多因素疾病，其發(fā)病受非遺傳因素和遺傳因素影響。非遺傳因素中主要與年齡、環(huán)境、飲食等相關(guān)[4-5]。許多研究證明，在老化的視網(wǎng)膜中氧化應(yīng)激和活性氧在疾病的病理學(xué)中發(fā)揮了重要作用[6]。視網(wǎng)膜對(duì)氧化應(yīng)激高度敏感，因?yàn)橐暰W(wǎng)膜具有氧消耗量大、代謝活性高并且直接暴露于光等特點(diǎn)。過(guò)量的活性氧可以損害視網(wǎng)膜脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和核酸，隨后導(dǎo)致視網(wǎng)膜細(xì)胞死亡。研究發(fā)現(xiàn)，在ARMD患者視網(wǎng)膜中氧化損傷增加，玻璃膜疣中的氧化蛋白含量也增加[7]。大量證據(jù)表明，氧自由基的損害與包含ARMD在內(nèi)的年齡相關(guān)的神經(jīng)退行性疾病相關(guān)[8-9]。然而，當(dāng)體內(nèi)各種原因?qū)е卵踝杂苫那宄Ш?，從而出現(xiàn)毒性蛋白(包括脂褐素)的積累，導(dǎo)致細(xì)胞外玻璃膜疣出現(xiàn)。所有這些機(jī)制均會(huì)導(dǎo)致RPE功能障礙或RPE細(xì)胞的死亡，從而導(dǎo)致ARMD的發(fā)生[10]。

在細(xì)胞膜中許多酶的激活需要鐵的輔助[11]。血液循環(huán)中的鐵和轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合形成配體與細(xì)胞膜表面的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(transferrin receptor，TFR)結(jié)合，通過(guò)血-視網(wǎng)膜屏障進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用。因此，當(dāng)TFR功能異常時(shí)會(huì)影響體內(nèi)鐵的平衡，導(dǎo)致氧自由基產(chǎn)生增多，當(dāng)氧自由基含量超過(guò)視網(wǎng)膜自身清除能力時(shí)，會(huì)導(dǎo)致視網(wǎng)膜的凋亡，最終導(dǎo)致患者視力下降。TFR有很多種類，其中作用最重要的受體之一就是TFR2。TFR2基因定位于7q22.1，其編碼的蛋白質(zhì)是單通道Ⅱ型膜蛋白，介導(dǎo)細(xì)胞攝取鐵、結(jié)合鐵。TFR2基因單核苷酸多態(tài)性包括rs2075674、rs41295942、rs527374887等。而TFR2基因多態(tài)性與ARMD是否相關(guān)，這個(gè)問(wèn)題一直是近年來(lái)國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。相關(guān)的研究也已經(jīng)在白種人和日本人中有過(guò)類似的探討。白種人中TFR2基因rs2075674是ARMD的危險(xiǎn)因素，其與干性ARMD相關(guān)性更大[12]。而在日本人中研究得到的結(jié)果是TFR2基因多態(tài)性與ARMD無(wú)相關(guān)性。國(guó)內(nèi)沒(méi)有相關(guān)的研究，所以我們選擇了ARMD患者與正常人分別作為病例組與對(duì)照組，應(yīng)用限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法(restriction fragment length polymorphism-polymerase chain reaction，RFLP-PCR)對(duì)TFR2基因的多態(tài)性與ARMD的相關(guān)性進(jìn)行了分析。

1對(duì)象和方法

1.1對(duì)象病例組：選取2014-06/2016-06哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院確診為ARMD(無(wú)影響視力的其他眼部疾病)的患者200例，均無(wú)血緣關(guān)系，其中干性ARMD患者100例，濕性ARMD患者100例，平均年齡65±15歲，男120例，女80例。ARMD的診斷和分型原則：45歲以上患者雙眼漸進(jìn)性視力減退，眼底散在玻璃膜疣，或后極部視網(wǎng)膜脈絡(luò)膜萎縮病灶，排除其它眼病者，即可診斷為干性ARMD；突然嚴(yán)重視力障礙，后極部深、淺層出血伴有新生血管和玻璃膜疣或黃斑區(qū)盤狀瘢痕，并排除其它眼病者，即可診斷為濕性ARMD。對(duì)照組：選取2014-06/2016-06哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院體檢中心健康志愿者100名，直接檢眼鏡未檢出眼底病變，平均年齡55±5歲，男55名，女45名。所有選擇的患者和健康志愿者均了解試驗(yàn)?zāi)康暮鸵饬x，并簽署知情同意書，已獲得哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

圖1TFR2基因PCR產(chǎn)物電泳圖。

1.2方法提取人類基因組DNA，根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)設(shè)計(jì)TFR2基因多態(tài)性位點(diǎn)rs2075674 PCR引物：TFR2-forward：5’-ACTCCCTGCCGTCGAGTTCT-3’；TFR2-reverse：5’-ACTCCCAGAGACCAAGAGCG-3’。PCR儀擴(kuò)增，94℃預(yù)變性5min，95℃變性30s，56℃變性30s，72℃變性1min，共29次循環(huán)，72℃延伸1min。制備20g/L瓊脂糖凝膠，60V恒壓電泳1.5h，取出凝膠。限制性核酸內(nèi)切酶酶切，取PCR產(chǎn)物2μL，加入MsPA1Ⅰ內(nèi)切酶0.3μL，CutSmart緩沖液1μL，并加入超純水使溶液體積達(dá)到10μL。置于36℃水浴鍋恒溫水浴4h，待下一步試驗(yàn)使用。取8μL酶切后產(chǎn)物加入到膠孔中，最后一孔中加入250bp-Ⅱ DNA梯形標(biāo)記物5μL。60V恒壓電泳1.5h，取出凝膠。將瓊脂糖凝膠置于CDD凝膠成像分析系統(tǒng)配套軟件中進(jìn)行觀察處理。比較各組間的基因型頻率，并按照Hardy-Weinberg平衡原理確定樣本的群體代表性。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：應(yīng)用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。采用χ2檢驗(yàn)比較各組間的基因型頻率，并按照Hardy-Weiberg平衡原理確定樣本的群體代表性。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 TFR2聚合酶鏈反應(yīng)產(chǎn)物電泳結(jié)果PCR產(chǎn)物擴(kuò)增后TFR2可見(jiàn)381bp的電泳條帶(圖1)。

2.2 TFR2基因限制性核酸內(nèi)切酶酶切后產(chǎn)物電泳結(jié)果PCR產(chǎn)物經(jīng)過(guò)限制性核酸內(nèi)切酶酶切后TFR2可表現(xiàn)為CC、CT兩種基因型。CT基因型可被切開，表現(xiàn)為兩條條帶，一條381bp，一條198bp；CC基因型不可被限制性核酸內(nèi)切酶切開，表現(xiàn)為一條381bp的條帶(圖2～3)。

2.3基因型頻率結(jié)果經(jīng)χ2檢驗(yàn)，TFR2(rs2075674)基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡。rs2075674基因型頻率分布：ARMD組與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=6.494，P=0.011，表1)；濕性ARMD組與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=11.054，P=0.001)；干性ARMD組與對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.418，P=0.234，表2)。

圖2濕性ARMD TFR2基因單核苷酸多態(tài)性(rs2075674)代表圖。

圖3干性ARMD TFR2基因單核苷酸多態(tài)性(rs2075674)代表圖。

表1 ARMD組與對(duì)照組TFR2基因型頻率例(%)

注：對(duì)照組：健康志愿者。

表2 ARMD亞組與對(duì)照組TFR2基因型頻率例(%)

注：對(duì)照組：健康志愿者。

3討論

本研究中我們首次發(fā)現(xiàn)，TFR2基因多態(tài)性rs2075674與中國(guó)東北地區(qū)人群ARMD的發(fā)病具有相關(guān)性(P=0.011)。rs2075647與中國(guó)東北地區(qū)人群中濕性ARMD的發(fā)生有很強(qiáng)的相關(guān)性(P=0.001)。此外，本次研究還發(fā)現(xiàn)TFR2基因多態(tài)性rs2075674與中國(guó)東北地區(qū)干性ARMD的發(fā)生無(wú)相關(guān)性(P=0.234)。本次試驗(yàn)結(jié)果得出，rs2075674與中國(guó)東北地區(qū)人群中干性ARMD無(wú)相關(guān)性。但是這一結(jié)果并不能證明該單核苷酸多態(tài)性與ARMD無(wú)關(guān)，卻從側(cè)面反映出該基因?qū)χ袊?guó)東北地區(qū)干性ARMD的發(fā)病沒(méi)有起到至關(guān)重要的作用。

關(guān)于TFR2基因多態(tài)性是否與ARMD的發(fā)病相關(guān)，一直以來(lái)是國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。Imamura等[11]研究發(fā)現(xiàn)，在日本人中TFR2基因多態(tài)性與ARMD的發(fā)生無(wú)相關(guān)性。而我們的試驗(yàn)首次應(yīng)用RFLP-PCR法發(fā)現(xiàn)了TFR2基因單核苷酸多態(tài)性rs2075674與ARMD發(fā)病有相關(guān)性，其中CT基因型與ARMD發(fā)病相關(guān)性較高。Imamura等研究著重于視網(wǎng)膜在光暴露后感光細(xì)胞中亞鐵離子的代謝過(guò)程，而且該研究的基因擴(kuò)增于ARMD小鼠模型，這可能是其未發(fā)現(xiàn)TFR2基因單核苷酸多態(tài)性與ARMD發(fā)病相關(guān)的主要原因。本研究發(fā)現(xiàn)，CT基因型會(huì)增加ARMD患者的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，后續(xù)試驗(yàn)可以通過(guò)檢測(cè)CT基因型患者的感光細(xì)胞外液中亞鐵離子、活性氧、羥自由基等濃度來(lái)豐富本項(xiàng)課題。

基于ARMD有干性和濕性兩種分型，且這兩種分型的臨床表現(xiàn)和治療方法不盡相同，本試驗(yàn)在ARMD組與對(duì)照組進(jìn)行比較分析的基礎(chǔ)上，將干性、濕性ARMD與對(duì)照組分別進(jìn)行了對(duì)照分析。本研究發(fā)現(xiàn)rs2075674與濕性ARMD相關(guān)性更大，而與干性ARMD無(wú)相關(guān)性。濕性ARMD的病理學(xué)特點(diǎn)為視網(wǎng)膜血管的異常生長(zhǎng)，干性ARMD的病理學(xué)特點(diǎn)為脂質(zhì)的沉積導(dǎo)致視網(wǎng)膜RPE的缺失。根據(jù)ARMD的病理學(xué)特點(diǎn)，我們有理由相信rs2075674參與了濕性ARMD形成過(guò)程中視網(wǎng)膜新生血管的形成。但是Daniel等通過(guò)對(duì)白種人研究發(fā)現(xiàn)，rs2075674與干性ARMD具有較高的相關(guān)性，而與濕性ARMD的相關(guān)性則較低。Daniel等研究結(jié)果與本次研究結(jié)果具有差異性，可能說(shuō)明白種人與黃種人具有遺傳差異性。未來(lái)我們可以擴(kuò)大樣本量，將不同種族人群的ARMD患者進(jìn)行基因?qū)用娴膶?duì)比分析，這可能會(huì)為ARMD發(fā)病機(jī)制的研究開辟新的道路。

本研究中，ARMD試驗(yàn)組和對(duì)照組中均未發(fā)現(xiàn)TT基因型，這可能說(shuō)明中國(guó)東北地區(qū)人群的TFR2基因不存在TT基因型。而Daniel等基于白種人ARMD患者的rs2074674研究均存在TT基因型。造成以上試驗(yàn)結(jié)論差異性的原因可能是由于白種人與黃種人具有不同的遺傳特性，也有可能是本次試驗(yàn)的樣本量較少，所得結(jié)論并不能代表中國(guó)東北地區(qū)所有人群，以后我們可以通過(guò)擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步驗(yàn)證。

隨著全世界學(xué)者對(duì)ARMD發(fā)病機(jī)制的關(guān)注度越來(lái)越高，許多學(xué)者認(rèn)為ARMD的發(fā)病機(jī)制可能是多種機(jī)制共同作用的結(jié)果，不可否認(rèn)的是遺傳易感性是ARMD不可忽視的一種發(fā)病途徑。因此不同人種對(duì)于ARMD的發(fā)展進(jìn)程也存在較大的差異。目前ARMD的發(fā)展與不健康的飲食結(jié)構(gòu)、吸煙等不良環(huán)境關(guān)系密切。中國(guó)漢族人與日本人和白種人的種族、飲食、生活習(xí)俗、文化背景等方面均有不同，導(dǎo)致ARMD遺傳易感性在不同人群中有較大的差距。這可能是本次課題研究結(jié)果與歐洲、日本有差別的原因之一。

我們的研究發(fā)現(xiàn)也許會(huì)在今后人們對(duì)ARMD發(fā)病機(jī)制的探索提供新的思路。后續(xù)試驗(yàn)也可建立ARMD的動(dòng)物模型，檢測(cè)動(dòng)物模型眼中TFR2基因的表達(dá)水平，用以研究TFR2基因表達(dá)水平在ARMD時(shí)是否有變化，若有條件也可收集相關(guān)患者眼內(nèi)部分玻璃體檢測(cè)其TFR2表達(dá)水平，進(jìn)一步行相關(guān)試驗(yàn)。另外，本試驗(yàn)病例組與對(duì)照組樣本數(shù)量均停留在100數(shù)量級(jí)上，如果將樣本量擴(kuò)大至1000級(jí)，可能會(huì)出現(xiàn)更有意義的結(jié)果。