歐陽明，劉靜雯，劉 珂，劉桂琴，秦 波

0引言

視神經(jīng)損傷又稱為外傷性視神經(jīng)炎病變，屬于顱腦損傷中最為常見、嚴重的并發(fā)癥之一，占顱腦外傷的2%～5%。視神經(jīng)損傷誘因相對較多，包括車禍傷(最為常見)、墜落傷、打擊傷等，且根據(jù)解剖結(jié)構(gòu)、生理學(xué)特點，90.0%以上患者是由于視神經(jīng)管段的間接性損傷導(dǎo)致[1]。當(dāng)中樞神經(jīng)受到不同程度損傷后，神經(jīng)軸突將無法再生，導(dǎo)致視網(wǎng)膜上的神經(jīng)節(jié)細胞發(fā)生凋亡，成為致盲的重要原因。因此，加強視神經(jīng)損傷早期治療和干預(yù)對改善預(yù)后具有重要的意義[2]。骨髓間充質(zhì)干細胞是一種主要分布于骨髓中的干細胞，其具有干細胞的特性，即自我更新、多向分化，故已成為基因治療的較為理想的靶細胞。在關(guān)于眼科疾病的相關(guān)治療中，骨髓間充質(zhì)干細胞的研究熱點主要在角膜疾病、視網(wǎng)膜疾病方面。視網(wǎng)膜疾病的治療主要有視網(wǎng)膜下移植與玻璃體腔內(nèi)注射兩種治療手段。目前關(guān)于骨髓間充質(zhì)干細胞在視網(wǎng)膜疾病治療中的研究還處于動物實驗階段。本文旨在探討基因修飾誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細胞分化治療視神經(jīng)損傷的效果。

1材料和方法

1.1材料實驗動物：選取檢疫合格、健康無眼疾的SD大鼠26只[動物合格證號：SCXK-(吉)2007-0003；動物質(zhì)量檢測合格證書號：95A50；購自吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院動物實驗中心]，8周齡，雌雄不限，體質(zhì)量200～420(平均310.63±15.66)g，常規(guī)飼養(yǎng)，自由攝食、飲水。主要試劑：膠質(zhì)原纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)抗體(上海圖赫公司)、異硫氰酸熒光素標(biāo)記Caspase-3蛋白抗體(上海西唐生物科技有限公司)、磷酸緩沖鹽溶液(PBS)(常德比克曼生物科技有限公司)、4×SDS loading buffer(上海生工公司)、質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染試劑盒(北京義翹神州科技有限公司，貨號STF02)、BCA試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]、DMEM培養(yǎng)基(美國Sigma-Aldrich)、胰酶(南京華耀醫(yī)藥科技有限公司)、生理鹽水(南京便診生物科技有限公司)、SDS-PAGE(北京百奧萊博科技有限公司)。主要儀器設(shè)備：細胞培養(yǎng)箱(美國Shellab)、光學(xué)顯微鏡(日本奧林巴斯公司)、電泳儀(長沙湘儀公司)。本研究符合動物管理保護條例，并經(jīng)過倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2方法

1.2.1骨髓間充質(zhì)干細胞的制備及修飾

1.2.1.1骨髓間充質(zhì)干細胞的制備隨機選取2只雄性SD大鼠(8周齡)，頸椎脫臼處死，用75%乙醇消毒后轉(zhuǎn)移至超凈工作臺中，分離大鼠的股骨，用PBS緩沖液沖出股骨中的骨髓。離心后取沉淀于37℃，5%CO2細胞培養(yǎng)箱中進行貼壁培養(yǎng)，顯微鏡下觀察細胞增殖到70%～80%時進行傳代。PBS緩沖液洗滌后加入適量胰酶消化，當(dāng)細胞呈圓球形態(tài)后加入不含血清的DMEM培養(yǎng)基終止消化。低速離心后取沉淀，加入不含血清的DMEM培養(yǎng)基，吹打混勻后分入不同的培養(yǎng)瓶中，繼續(xù)培養(yǎng)[3]。

1.2.1.2骨髓間充質(zhì)干細胞的修飾將編碼睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(ciliary neurotrophic factor，CNTF)的全基因序列克隆至pHIV-dTomato載體中，鑒定后將質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染進T細胞中以實現(xiàn)慢病毒的合成[4]。分離慢病毒，將帶有CNTF編碼序列的慢病毒轉(zhuǎn)染進入骨髓間充質(zhì)干細胞中，選擇表達GFAP的干細胞繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.2動物模型的建立及分組

1.2.2.1視神經(jīng)損傷動物模型建立選取24只SD大鼠，禁食12h后采用鉗夾視神經(jīng)法建立視神經(jīng)損傷大鼠模型。應(yīng)用3%水合氯醛麻醉大鼠，取俯臥位，去除左側(cè)眼瞼周圍的毛發(fā)備皮，固定四肢后，將大鼠的頭輕微偏向右側(cè)，在上眼瞼的1/3處進刀將眼瞼打開約0.5cm長，游離眼球后的脂肪與眼直肌，暴露視神經(jīng)，用止血鉗夾取視神經(jīng)約10s，撤走止血鉗，縫合傷口后局部涂抗生素防止感染[5]。建模完畢后立刻利用手電筒直射大鼠的左側(cè)瞳孔，如觀察到瞳孔立即縮小而移開手電筒后瞳孔大小恢復(fù)正常表明對光具有反射，建模失敗；如手電筒照射后瞳孔立即縮小且移開手電筒后瞳孔大小不能恢復(fù)，表明建模成功。本研究24只SD大鼠均造模成功。

1.2.2.2動物分組及干預(yù)造模成功后將大鼠隨機分為研究組和對照組，各12只，經(jīng)過3d恢復(fù)后，研究組大鼠于造模成功后第4d左眼玻璃體腔內(nèi)注射約10μL經(jīng)修飾的骨髓間充質(zhì)干細胞懸液，對照組大鼠注射等量生理鹽水[6]。在造模成功后第7、10、13d分別進行同樣的注射操作。

1.2.3觀察指標(biāo)

1.2.3.1光反射恢復(fù)情況造模成功后第14d檢測兩組大鼠對光反射的恢復(fù)情況，手電筒照射后瞳孔立即縮小且移開手電筒后瞳孔的大小能恢復(fù)視為光反射恢復(fù)。

1.2.3.2 HE染色觀察大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞造模成功后第14d，以斷頸方式處死大鼠，取左側(cè)眼球，分離視網(wǎng)膜，制備4μm切片，應(yīng)用HE染色法觀察兩組大鼠視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)，隨機選取5個視野(×200)計數(shù)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞(retinal ganglion cell，RGC)數(shù)目[7]。

1.2.3.3 Western blot檢測GFAP和Caspase-3表達水平HE染色的同時收集制備切片沉淀，向其中加入細胞裂解液，10000r/min離心10min，取上清液30μL，加入4×SDS loading buffer 10μL，加熱煮沸，速度12000r/min離心，取上清液。利用BCA試劑盒測定樣品蛋白含量。采用濃度為8% SDS-PAGE完成電泳分離，每孔上樣量為20μg，濃縮膠電泳80V 30min，分離膠電泳120V 70min。轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，電壓80V。封閉液封閉1h，GFAP抗體(1∶400)、異硫氰酸熒光素標(biāo)記Caspase-3蛋白抗體(1∶400)孵育24h，PBST洗滌3次，每次洗滌10min，相應(yīng)二抗(1∶200)常溫孵育1h，PBST洗滌3次，每次洗滌10min。利用ECL化學(xué)發(fā)光法檢測結(jié)果，經(jīng)過顯影、定影后采用掃描儀掃描，將獲得的數(shù)據(jù)傳輸?shù)紾el Proanalyzer軟件中完成灰度分析定量。

2結(jié)果

2.1兩組大鼠光反射恢復(fù)情況造模成功后第14d，對照組大鼠有對光反射者3只，無對光反射者9只；研究組大鼠有對光反射者10只，無對光反射者2只。研究組大鼠光反射恢復(fù)率(83%)明顯高于對照組(25%)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=9.072，P<0.05)。

2.2兩組大鼠RGC情況HE染色結(jié)果顯示，研究組大鼠視網(wǎng)膜細胞結(jié)構(gòu)相對整齊，可見少量空泡；對照組大鼠視網(wǎng)膜細胞結(jié)構(gòu)欠整齊，可見明顯的空泡，且研究組大鼠RGC細胞數(shù)(207.14±2.3個)明顯多于對照組(137.89±1.4個)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=89.0926，P<0.001)，見圖1。

圖1兩組大鼠視網(wǎng)膜組織HE染色結(jié)果(×200)A：研究組；B：對照組。

圖2Western blot檢測結(jié)果。

2.3兩組大鼠GFAP和Caspase-3表達水平Western blot檢測結(jié)果表明，研究組大鼠視網(wǎng)膜GFAP和Caspase-3表達水平(167.54±13.7和7.81±2.1)均低于對照組(206.87±17.6和69.53±8.3)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(t=6.1086、24.9726，均P<0.001)，見圖2。

3討論

視神經(jīng)受損后發(fā)生萎縮以及致盲，最重要的原因是視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞數(shù)量減少[8]。神經(jīng)節(jié)細胞是一種中樞神經(jīng)元，沒有分化能力。促使損傷的神經(jīng)節(jié)細胞、視神經(jīng)得到修復(fù)，是治療視神經(jīng)損傷的一個新思路[9]。鑒于神經(jīng)節(jié)細胞無分化能力的特點，有學(xué)者提出通過補充外源性神經(jīng)節(jié)細胞來修復(fù)視神經(jīng)的損傷[10]。目前，由于受到多種技術(shù)條件的限制，很難在體外培養(yǎng)視神經(jīng)節(jié)細胞，而且人體研究存在倫理學(xué)問題，故多選擇在動物體內(nèi)進行相關(guān)研究。骨髓間充質(zhì)干細胞是一種位于骨髓中的干細胞，可在一定條件下經(jīng)誘導(dǎo)分化成三胚層的細胞[11]。除了具有干細胞共同的多向分化與自我更新的特點以外，骨髓間充質(zhì)干細胞還具有低免疫原性的特點。骨髓間充質(zhì)干細胞可分泌中等量的主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex，MHC)Ⅰ類分子，不表達Fas配體(FasL)(能夠結(jié)合到死亡受體TNFRSF6/FAS的細胞因子)、MHCⅡ類分子，能夠躲避自身T細胞的識別，不引起免疫排斥反應(yīng)。所以，骨髓間充質(zhì)干細胞在動物與人體的移植治療中具有相當(dāng)重要的作用[12]。無論是體內(nèi)培養(yǎng)還是體外培養(yǎng)，在一定條件下骨髓間充質(zhì)干細胞都能分化成神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細胞，表現(xiàn)出修復(fù)神經(jīng)的功能，呈現(xiàn)向損傷處遷移的特性[13-14]。為了進一步提高修復(fù)效率，培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細胞的同時，本研究將編碼大鼠CNTF的全長基因序列借助慢病毒轉(zhuǎn)染至骨髓間充質(zhì)干細胞，以提高CNTF的表達水平。

目前對視網(wǎng)膜病變的治療常采用玻璃體腔移植[15]。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)實驗動物的視神經(jīng)處于正常狀態(tài)時，注入的骨髓間充質(zhì)干細胞并未發(fā)揮作用，僅聚集于玻璃體腔中；而當(dāng)實驗動物的視神經(jīng)受到損傷后，注入的骨髓間充質(zhì)干細胞多分布于內(nèi)界膜層，移植30d或1mo后大量的神經(jīng)元特異性烯醇化酶、多種神經(jīng)營養(yǎng)因子開始表達，證實玻璃體腔移植骨髓間充質(zhì)干細胞能夠修復(fù)視網(wǎng)膜損傷[16]。本研究將SD大鼠的視神經(jīng)暴露后用止血鉗夾數(shù)秒，構(gòu)建單側(cè)視神經(jīng)損傷模型[17]。同時體外培養(yǎng)基因修飾過的骨髓間充質(zhì)干細胞，待大鼠恢復(fù)一段時間后，吸取適量含干細胞的培養(yǎng)液，注入大鼠的玻璃體腔中。從建模成功后第4d開始，每隔3d注射一次干細胞，對照組則注射等量的生理鹽水。建模成功后第14d，用手電筒進行直接對光反射檢查發(fā)現(xiàn)，對照組大鼠光反射恢復(fù)率顯著低于研究組大鼠。HE染色結(jié)果顯示，研究組大鼠視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)相對整齊，可見少量空泡；對照組大鼠視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)欠整齊，可見明顯的空泡，且研究組大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞數(shù)明顯多于對照組。視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞在視覺的產(chǎn)生中具有舉足輕重的作用，其數(shù)目的增加，反映了大鼠視力在一定程度的恢復(fù)。Western blot檢測結(jié)果表明，研究組大鼠GFAP和Caspase-3表達水平均低于對照組。GFAP是參與構(gòu)成中間纖維的一種絲狀蛋白，存在于細胞內(nèi)，與中樞神經(jīng)系統(tǒng)不同，其作為膠質(zhì)細胞特異性分布于視網(wǎng)膜Müller細胞[18-19]。正常情況下，Müller細胞不表達GFAP，當(dāng)損傷發(fā)生時，其表達水平升高且與傷勢呈正相關(guān)。Caspase-3是一種凋亡相關(guān)分子，而視神經(jīng)的損傷與過度的細胞凋亡有著密切關(guān)系[20]。

綜上所述，將基因修飾誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細胞分化用于視神經(jīng)損傷大鼠能有效恢復(fù)損傷的視神經(jīng)，為視神經(jīng)損傷的臨床治療提供了思路。但是，現(xiàn)階段關(guān)于骨髓間充質(zhì)干細胞的研究僅局限于動物實驗水平，距離在人體應(yīng)用尚有一段距離。此外，如何獲得高純度干細胞，如何解決移植后玻璃體混濁等并發(fā)癥，尚需長時間、多中心的研究。