樊慧峰, 盧秉泰, 黃莉, 楊迪元, 盧根**, 張明杰, 施婷婷

(1.廣州醫(yī)科大學附屬廣州市婦女兒童醫(yī)療中心 呼吸科, 廣東 廣州 510623； 2.廣州醫(yī)科大學附屬廣州市婦女兒童醫(yī)療中心 兒科研究所, 廣東 廣州 510623； 3.廣州醫(yī)科大學附屬廣州市婦女兒童醫(yī)療中心 兒童重癥監(jiān)護室, 廣東 廣州 510623； 4.廣州醫(yī)科大學附屬廣州市婦女兒童醫(yī)療中心 影像科, 廣東 廣州 510623)

人腺病毒(human adenovirus,HAdV)是引起兒童呼吸道感染的最常見病原之一，亦是嬰幼兒病毒性肺炎的主要病原，其引起肺炎的嚴重程度也往往重于年長兒，重癥腺病毒肺炎發(fā)病快、病情重、并發(fā)癥多、病死率較高[1-2]。目前對于腺病毒感染沒有靶向的治療手段，重癥患兒通常采用糖皮質(zhì)激素短期抗炎，同時結(jié)合免疫球蛋白對癥支持治療。支氣管鏡肺泡灌洗可以清除病原、壞死脫落組織及細胞，解除支氣管阻塞[3-4]，對肺實變的治療具有重要意義。但是，經(jīng)過積極治療后，仍有部分患兒遺留不同程度的后遺癥，如閉塞性細支氣管炎、支氣管擴張、肺透明膜病以及肺纖維化等[1,5-6]。重癥腺病毒肺炎急性期致死率高，同時可引起嚴重后遺癥導致病情遷延反復且預后不良，對兒童的生長及心理發(fā)育產(chǎn)生深遠的影響。造成重癥腺病毒肺炎不同臨床表型的機制仍未明確，尤其對病變部位的局部免疫損傷機制并不清楚。因此，本研究檢查不同時期、不同病情腺病毒肺炎血漿及肺泡灌洗液中的IL-1β、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-9、TNF-α及IFN-γ，分析這些細胞因子表達譜變化與肺損傷的免疫調(diào)控機制及臨床意義。

1 資料與方法

1.1 對象

選取2015年12月～2018年12月符合社區(qū)獲得性肺炎診斷標準、并進行咽拭子熒光PCR檢測ADV核酸陽性者和(或)血清、肺泡灌洗液ADV-IgM抗體陽性、診斷為腺病毒肺炎的36例住院患兒作為研究對象，其中男23例、女13例，年齡4～72個月、中位數(shù)22個月。根據(jù)患兒嚴重程度分為輕癥組及重癥組，輕癥19例、重癥17例，兩組患兒的臨床特征見表1。同時選取12例健康兒童作為對照組，3組備檢兒童性別、年齡比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。重癥腺病毒肺炎標準：(1)呼吸困難與缺氧癥狀明顯、吸氧后不能緩解，(2)明顯中毒癥狀，(3)心力衰竭，(4)肺部濕性啰音密集、影像提示大片陰影或?qū)嵶?肺實變大于1個肺葉或肺彌漫性滲出達3個肺葉以上)，(5)合并癥如膿胸、膿氣胸等；凡具有上述診斷標準1項及以上者診斷為重癥腺病毒肺炎。排除標準：伴有支氣管哮喘、肺結(jié)核等其他呼吸系統(tǒng)疾病，伴有免疫缺陷疾病，近期服用過糖皮質(zhì)激素或者免疫抑制劑等，合并有其它病原感染，合并有嚴重先天性心臟病、重度營養(yǎng)不良患兒。

1.2 方法

1.2.1支氣管鏡取肺泡灌洗液 所有腺病毒肺炎患兒(輕癥和重癥)胸部影像提示有肺實變征象，符合纖維支氣管鏡術(shù)指征，操作在中度鎮(zhèn)靜和局麻下進行，肺泡灌洗液收集部位在病變受累最明顯部位[主要通過肺部影像和(或)胸部高分辨CT觀察得到],37 ℃溫鹽水灌注3至5次，每次5～10 mL(灌注總量約3～5 mL/kg),回收肺泡灌洗液≥40%灌入量為合格。抽取對照組靜脈血2 mL，腺病毒肺炎患兒肺泡灌洗液及靜脈血同時送檢，測定血漿部分細胞因子水平。所有患兒監(jiān)護人均簽署支氣管鏡操作知情同意書。

1.2.2部分細胞因子測定 取對照組兒童血漿兩組腺病毒肺炎患兒入院后72 h以內(nèi)血漿及肺泡灌洗液(急性期)，使用美國Bio-Rad公司提供的“Bio-Plex Pro Human Cytokine plex Assay kit”試劑盒，采用流式細胞術(shù)測定細胞因子包括白細胞介素-1β(IL-1β)、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-9、 腫瘤壞死因子α(TNF-α)及干擾素γ(IFN-γ)在血漿及肺泡灌洗液中的含量，細胞因子檢測和數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)為Bio-plex 200系統(tǒng)，實驗步驟按照說明書進行。

1.3 統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)表示為中位數(shù)及范圍，連續(xù)變量的兩組分析采用非參數(shù)Mann-WhitneyU檢驗，配對樣本血漿與肺泡灌洗液的比較采用Wilcoxon配對有符號秩檢驗，二分類變量采用卡方檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。所有數(shù)據(jù)均使用Prism 7.0 (GraphPad Software)進行分析。

表1 腺病毒肺炎患兒臨床特征Tab.1 Clinical characteristics of children with adenovirus pneumonia

注：(1)標準為<2月齡呼吸頻率≥60次/分，2月齡～1歲呼吸頻率≥50次/分，1～5歲呼吸頻率≥40次/分，>5歲呼吸頻率≥30次/分；(2)包括食欲下降，嘔吐，大便次數(shù)增多等；(3)除氣促外,動脈血氣提示PaO2<50 mmHg(6.7 kPa)和(或)PaCO2>50 mmHg(6.7 kPa)

2 結(jié)果

2.1 急性期腺病毒肺炎患兒及對照組兒童血漿細胞因子

與對照組兒童比較，急性期腺病毒肺炎患兒血漿IL-4、IL-5、IFN-γ水平均明顯降低，而TNF-α、IL-6水平明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

2.2 急性期腺病毒肺炎患兒血漿及肺泡灌洗液中細胞因子

36例患兒同時留取肺泡灌洗液及血漿測定細胞因子，肺泡灌洗液中IL-1β、IL-6、IL-8、IL-9、TNF-α、IFN-γ水平明顯高于血漿，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖1。

2.3 急性期輕癥及重癥腺病毒肺炎患兒血漿及肺泡灌洗液中細胞因子

急性期輕、重癥患兒血漿中IL-1β、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-9、TNF-α及IFN-γ比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見圖2A；而急性期重癥腺病毒肺炎組患兒肺泡灌洗液中的IL-6、IL-8、IFN-γ水平均顯著的高于輕癥腺病毒肺炎患兒(P<0.05)，見圖2B。

表2 急性期腺病毒肺炎患兒與對照組兒童血漿8種細胞因子水平 [中位數(shù)，(范圍)]Tab.2 Comparison of plasma cytokines in children with adenovirus pneumonia and healthy controls

圖1 腺病毒肺炎患兒血漿及肺泡灌洗液中8種細胞因子水平Fig.1 Comparison of cytokines in plasma and BALF in children with adenovirus pneumonia

圖2 急性期輕重癥腺病毒肺炎患兒血漿及肺泡灌洗液8種細胞因子水平比較Fig.2 Comparison of cytokines in plasma and BALF between mild adenovirus pneumonia and severe adenovirus pneumonia at acute phase

3 討論

HAdV是兒童急性呼吸道感染的重要病原之一。近年來HAdV感染在全球范圍內(nèi)出現(xiàn)過廣泛流行，部分引起嚴重的腺病毒肺炎，重癥患兒病情重、進展快、病程遷延，中毒癥狀重，可伴有多種嚴重并發(fā)癥如呼吸衰竭、肺不張、單側(cè)透明肺等。部分遺留肺纖維化，閉塞性細支氣管炎，支氣管擴張等后遺癥[5-7]。本組患兒重癥組較輕癥組臨床上主要表現(xiàn)為發(fā)熱時間長，常伴有胃腸道癥狀，氣促明顯甚至發(fā)生呼吸衰竭。實驗室檢查為CRP和LDH增高明顯，肺部影像提示受累范圍廣泛，常伴有超過一個肺葉肺實變，部分患兒合并有胸腔積液。提示重癥患兒無論是從臨床表現(xiàn)，實驗室檢查以及肺部受累方面都不同于輕癥患兒。

目前，造成重癥腺病毒肺炎不同臨床表型的機制仍未明確，但認為與病毒亞型和滴度以及宿主的免疫動態(tài)相關。腺病毒呼吸道感染的嚴重程度除了和病毒的致病力相關外，也和機體的免疫應答能力相關。免疫系統(tǒng)的激活和細胞因子或炎性介質(zhì)的產(chǎn)生在炎性反應的激活以及組織損傷機制中起非常重要的作用[8]。本組腺病毒肺炎患兒與對照組比較，血漿中IL-4、IL-5、IFN-γ水平均明顯降低，而TNF-α、IL-6水平明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義。說明這些細胞因子可能參與了腺病毒感染的發(fā)病。IL-4是一種多功能的細胞因子，一方面通過誘導T細胞分化，加強炎性細胞因子的釋放，促進炎癥的發(fā)生，另一方面可以促使自身抗體的產(chǎn)生，誘導自身免疫性疾病的發(fā)生。本組腺病毒患兒急性期血清中TNF-α、IL-6水平明顯升高，提示在腺病毒感染狀態(tài)下，機體TNF-α、IL-6 合成及釋放增多。IL-6 可由單核巨噬細胞、淋巴細胞、上皮細胞等多種細胞產(chǎn)生，當機體處于健康狀態(tài)時IL-6 分泌很少，而在炎癥和感染的狀態(tài)下，單核-巨噬細胞和T淋巴細胞會合成釋放大量IL-6[8-9]。結(jié)合本實驗結(jié)果提示TNF-α、IL-6合成及釋放的程度可能與重癥腺病毒感染的發(fā)生、發(fā)展有密切關系。

針對評估下呼吸道感染局部的免疫機制，支氣管肺泡灌洗目前為非常有價值的研究手段。肺泡巨噬細胞被認為是腺病毒感染后初始細胞因子信號源。在小鼠模型研究顯示在腺病毒感染后30 min，TNF-α、IL-6的mRNA首先在巨噬細胞中表達，而不是氣道上皮細胞和血管內(nèi)皮細胞[10]。因此本組腺病毒肺炎患兒急性期肺泡灌洗液和血漿中細胞因子比較， IL-1β，IL-6，IL-8，IL-9，TNF-α，IFN-γ在肺泡灌洗液中明顯增高。提示肺泡灌洗液中細胞因子水平較血漿更能反映患兒的病情嚴重程度及局部的免疫狀況。有研究表明，IL-4在難治性支原體肺炎(refractory mycoplasma pneumonia，RMPP)急性期肺泡灌洗液中增高明顯，對RMPP疾病的進展具有重要的鑒別意義[11]。但本組患兒IL-4在急性期血漿中是降低的，肺泡灌洗液中也未見增高，是由于病原不同導致免疫反應機制不同，還是本研究樣本量偏小所致不得而知，還需要今后進一步深入研究。IL-6 可以誘導T細胞分化，進而加強其他炎性因子的釋放，促進炎癥發(fā)生。TNF-α能趨化激活中性粒細胞，促進黏附分子表達，參與內(nèi)毒素性休克等[12]。TNF-α、IL-6在本組腺病毒肺炎患兒急性期血漿及肺泡灌洗液中均增高，提示TNF-α、IL-6既能反映出全身又能反映出局部的免疫反應，與機體的免疫調(diào)節(jié)及肺部炎性反應的過程均有關。而且其過度表達可能參與了患兒肺部的免疫損傷。TNF-α和IL-6可能作為預測重癥腺病毒肺炎的指標。

本研究發(fā)現(xiàn)，重癥腺病毒肺炎組急性期肺泡灌洗液中的IL-6、IL-8、IFN-γ水平均顯著的高于輕癥腺病毒肺炎組，提示血漿中細胞因子水平并不能及時反映出肺部的炎癥狀況和疾病的嚴重程度。IL-6、IL-8、IFN-γ等細胞因子在宿主的防御反應中起重要作用，能增強T細胞、NK細胞及B細胞等的免疫活性[13-14]。IFN-γ由活化的T細胞和NK細胞產(chǎn)生，能夠激活巨噬細胞以發(fā)揮其吞噬受病原體感染的細胞的功能，并可破壞病原體而作為一種抗炎細胞因子。本組腺病毒肺炎急性期患兒血漿中IFN-γ水平較對照組均明顯降低，但在肺泡灌洗液中卻明顯升高，而且重癥患兒IFN-γ水平高于輕癥患兒，推測有可能在重癥急性期患兒分泌IFN-γ的相關細胞從外周血遷移至靶器官肺部發(fā)揮作用。

綜上所述，IL-1β、IL-6、IL-8、IL-9、TNF-α及IFN-γ等可能參與了腺病毒呼吸道感染的發(fā)病。急性期腺病毒肺炎患兒肺部炎癥反應重于全身炎癥反應，而重癥患兒表現(xiàn)為更為強烈的局部炎癥反應，與輕癥患兒也有所不同。TNF-α和IL-6可能作為預測重癥腺病毒肺炎的指標。