唐青藍(lán)， 李紅梅， 張禮林， 王玉豐， 顏禮完， 周君

(1.海南省第三人民醫(yī)院 檢驗(yàn)科， 海南 三亞 572000； 2.貴州醫(yī)科大學(xué) 生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室， 貴州 貴陽(yáng) 550004)

成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子21(fibroblast growth factor 21，F(xiàn)GF21)作為FGF超家族的重要成員之一，是具有多效應(yīng)的內(nèi)分泌性生長(zhǎng)因子。FGF21可以降低血糖、調(diào)節(jié)糖脂代謝[1]，但具體作用機(jī)制仍未明確。近期研究顯示，F(xiàn)GF21在腎臟疾病、高血壓、冠心病、動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病心肌病、缺血或肥厚引起的多種心肌疾病中有重要作用[2-6]。FGF21作為一個(gè)重要物質(zhì)代謝調(diào)節(jié)因子，不僅有明顯的改善高血脂、高血糖和肥胖的作用，也能緩解動(dòng)脈粥樣硬化、冠心病等心血管疾病病情，亦可能直接參與疾病進(jìn)程，是相關(guān)疾病預(yù)測(cè)、治療因子[7]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)動(dòng)脈粥樣硬化患者FGF21水平明顯高于正常對(duì)照，且與氧化低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein，ox-LDL)呈正相關(guān)[8]。但目前，F(xiàn)GF21在心血管疾病中具體作用機(jī)制尚未研究清楚，仍是研究熱點(diǎn)。因此，本研究擬將小鼠FGF21 基因進(jìn)行克隆，將重組子pET-28a(+)-mFGF21進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，并純化出小鼠FGF21 融合蛋白，為進(jìn)一步開(kāi)展對(duì)FGF21作用機(jī)制的研究提供基礎(chǔ)條件。

1 材料與方法

1.1 材料

pMD19-T-M重組質(zhì)粒、大腸桿菌菌株BL21(DE3)、質(zhì)粒pET-28a(+)、小鼠FGF21上下游引物由本實(shí)驗(yàn)室保存并提供，限制性核酸內(nèi)切酶、Premix Taq試劑盒、T4 DNA 連接酶、瓊脂糖凝膠-DNA純化試劑盒、X-gal及IPTG購(gòu)自寶生物工程有限公司，質(zhì)粒DNA提取試劑盒購(gòu)自O(shè)MEGA公司，咪唑、PMSF、Triton X-100、TRIS，HIS-Select Nickel Affinity Gel 購(gòu)自sigma-aldrich公司，F(xiàn)GF-21 Antibody rabbit polyclonal IgG、Goat anti-rabbit IgG-HRP購(gòu)自Santa Cruz Biotechnology公司。

1.2 方法

1.2.1小鼠FGF21基因克隆及pET-28a(+)-mFGF21原核表達(dá)載體的構(gòu)建 以本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建-20 ℃保存的帶有小鼠FGF21的T載體pMD19-T-M溶液作為模板擴(kuò)增小鼠FGF21基因片段，上游引物中帶有BamHI酶切位點(diǎn)和2個(gè)保護(hù)性堿基，下游引物中帶有XhoI酶切位點(diǎn)和2個(gè)保護(hù)性堿基；上游引物序列為5′-CGGGATCCGCATACCCCATCCCTGACT-3′，下游引物序列為5′-CCCTCGAGGGACGCATAGCTGGGGCT-3′，下劃線分別為BamHI及XhoI酶切位點(diǎn)。擴(kuò)增程序：94 ℃ 5 min，(94 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min)×30個(gè)循環(huán)，72 ℃ 10 min。將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳、割膠回收處理、BamHI和XhoI雙酶切，再將其連接至雙酶切處理的pET-28a(+)質(zhì)粒上，獲得pET-28a(+)-mFGF21表達(dá)載體，將其轉(zhuǎn)化至Ecoli.BL21DE3感受態(tài)細(xì)胞。選擇抗生素平板篩選出的單菌落(陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子)進(jìn)行過(guò)夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒DNA用BamHI和XhoI進(jìn)行雙酶切后電泳檢測(cè)、并送基因公司測(cè)序鑒定正確，pET28a(+)-mFGF21表達(dá)載體構(gòu)建成功。

1.2.2融合蛋白his-mFGF21的原核表達(dá) 將篩選出的單個(gè)陽(yáng)性克隆菌落放在50 mL含抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，水浴箱中37 ℃ 180 r/min振蕩培養(yǎng)24 h，再取0.2 μL菌液至含抗生素的LB液體培養(yǎng)基中振搖至 OD600=0.4，加入終濃度為0.2 mmol/L的IPTG，水浴箱中23 ℃ 120 r/min振蕩培養(yǎng)4 h，收集1 mL菌液處理，SDS-PAGE電泳檢測(cè)融合蛋白表達(dá)。

1.2.3融合蛋白his-mFGF21的純化 留取100 mL體系誘導(dǎo)表達(dá)的菌體沉淀，以8 mL裂解液重懸菌體后加入 PMSF(0.1 mol/L)，輕柔吹打，振蕩20 min，超聲破碎1 h(冰浴條件下進(jìn)行)，4 ℃條件下將破碎后的菌液12 000 r/min 離心20 min后收集上清。取少量超聲破碎的上清與超聲破碎的菌體沉淀進(jìn)行SDS-PAGE電泳鑒定。將200 μL超聲破碎后上清液加入400 μL平衡緩沖液(不含咪唑)，顛倒混勻(輕柔)數(shù)次，離心棄上清，留樣少許。1 mL預(yù)冷的清洗緩沖液(不含咪唑)清洗親和凝膠(輕柔混合)，離心棄上清并留樣，重復(fù)此步驟3次。將清洗好的親和凝膠與100 μL his洗脫緩沖液結(jié)合，旋轉(zhuǎn)(輕柔)混勻1 min，離心后取上清留樣，重復(fù)此步驟2次。對(duì)純化后的蛋白液、留樣保存的漂洗液以及洗脫緩沖液采用 SDS-PAGE電泳進(jìn)行鑒定。

1.2.4Western Blot檢測(cè) 取純化后的his-mFGF21蛋白液先后進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳、蛋白條帶轉(zhuǎn)膜(至PVDF膜上)、封閉、一抗結(jié)合(兔源性FGF21多克隆一抗)、二抗結(jié)合(羊抗兔)、顯色(ECL-Plus發(fā)光試劑)。

2 結(jié)果

2.1 小鼠FGF21基因克隆及pET-28a(+)-mFGF21原核表達(dá)載體的構(gòu)建

將BamHI和XhoI雙酶切的小鼠FGF21基因(大體系擴(kuò)增回收)克隆至同樣用BamHI和XhoI雙酶切處理的pET-28a(+)質(zhì)粒中，獲得pET-28a(+)-mFGF21表達(dá)載體，將其轉(zhuǎn)化至Ecoli.BL21DE3感受態(tài)細(xì)胞，于抗生素平板上篩選出陽(yáng)性克隆(如圖1)，初步表明pET-28a(+)-mFGF21表達(dá)載體構(gòu)建成功。篩選出的陽(yáng)性克隆的菌落培養(yǎng)24 h后提取質(zhì)粒，進(jìn)行BamHI和XhoI雙酶切，可見(jiàn)2條條帶(如圖2)，與pET-28a(+)和小鼠FGF21(546 bp)位置一致。雙酶切電泳顯示正確的質(zhì)粒DNA送上海生工生物科技公司測(cè)序鑒定，結(jié)果表明重組質(zhì)粒pET-28a(+)-mFGF21 雙向測(cè)序結(jié)果正確，與小鼠FGF21基因序列相符。

圖1 pET-28a(+)-mFGF21原核表達(dá)載體篩選平板Fig.1 Plate screening of pET-28a(+)-mFGF21 prokaryotic expression vector

注：M1為100 bp DNA階梯marker，M2為wide range 1 000 bp DNA階梯marker；1、2為pET-28a(+)-mFGF21的雙酶切產(chǎn)物圖2 pET-28a(+)-mFGF21原核表達(dá)載體酶切分析Fig.2 The restriction endonuclease digestion analysis of pET-28a(+)-mFGF21 prokaryotic expression vector

2.2 融合蛋白his-mFGF21的原核表達(dá)

SDS-PAGE電泳顯示在22 kD處出現(xiàn)明顯目的蛋白條帶，證明his-mFGF21誘導(dǎo)表達(dá)成功，見(jiàn)圖3。

注：M為蛋白marker，1為BL21(DE3)菌株誘導(dǎo)表達(dá)作為陰性對(duì)照，2為pET-28a(+)-mFGF21的BL21DE3菌株未誘導(dǎo)，3、4為pET-28a(+)-mFGF21的BL21DE3菌株在0.2 mmol/L 濃度的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白產(chǎn)物圖3 his-mFGF21融合蛋白誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物Fig.3 Induced expression product of his-mFGF21 fusion protein

2.3 融合蛋白his-mFGF21的純化

取少量超聲破碎的上清與超聲破碎的菌體沉淀進(jìn)行SDS-PAGE電泳，顯示在22 kD處出現(xiàn)明顯目的蛋白條帶(如圖4)，證明經(jīng)超聲破碎菌體后的上清中存在大量融合蛋白his-mFGF21可溶性表達(dá)。對(duì)純化后的his-mFGF21蛋白液、留樣保存的漂洗液以及洗脫緩沖液采用 SDS-PAGE電泳，結(jié)果顯示在22 kD處均有明顯的目的蛋白(如圖5)，證明融合蛋白his-mFGF21純化成功。

注：M為蛋白marker，1、2分別為誘導(dǎo)表達(dá)后超聲破碎菌體后的上清液、沉淀液圖4 融合蛋白his-mFGF21的可溶性分析Fig.4 Soluble analysis of fusion protein his-mFGF21

注：M為蛋白marker，1為超聲破碎菌體的上清液結(jié)合凝膠離心后的蛋白溶液，2、3、4為融合蛋白溶液結(jié)合凝膠經(jīng)第2次、第3次、第4次漂洗留取的漂洗液，5、6、7為第1次、第2次、第3次洗脫液洗脫的融合蛋白圖5 純化融合蛋白his-mFGF21檢測(cè)Fig.5 Analysis of purified fusion protein his-mFGF21

2.4 Western Blot檢測(cè)

取純化后的his-mFGF21蛋白液進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，采用免疫印跡法進(jìn)行分析，顯色后在22 kD左右有一特異性蛋白條帶，如圖6所示。

圖6 Western Blot檢測(cè)融合蛋白his-mFGF21Fig.6 Western Blot detection of fusion protein his-mFGF21

3 討論

近年來(lái)，動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病率越來(lái)越高，已成為一種常見(jiàn)病，嚴(yán)重影響人類健康。大量證據(jù)表明，導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化的重要危險(xiǎn)因素有高血糖、高脂血癥、肥胖、高血壓、吸煙、代謝紊亂、高纖維蛋白原血癥、高半胱氨酸血癥及慢性應(yīng)激等[9]。此外，糖代謝異常是動(dòng)脈粥樣硬化的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，動(dòng)脈粥樣硬化在T2DM 患者中的發(fā)生發(fā)展中與攝糖過(guò)多、胰島素抵抗等有關(guān)[10-11]。除了糖代謝異常，脂質(zhì)代謝紊亂、內(nèi)皮細(xì)胞功能受損以及炎性反應(yīng)等在動(dòng)脈粥樣硬化的病理過(guò)程中均起到很重要的作用[12]。

FGF21是2000年首次從小鼠胚胎組織中分離出來(lái)，小鼠FGF21由210個(gè)氨基酸組成，在多種組織中均有分布，主要表達(dá)在肝臟，少量表達(dá)在脂肪、性腺、骨骼肌、胰島細(xì)胞、心臟[2,13]。在FGF家族中，其經(jīng)典的家族成員可以通過(guò)肝素錨定直接與成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體(fibroblast growth factor receptors，F(xiàn)GFRs)結(jié)合，對(duì)細(xì)胞的分化與增殖進(jìn)行調(diào)節(jié)。不同的是，F(xiàn)GF21、FGF19和FGF23這一亞家族無(wú)肝素錨定位點(diǎn)。FGF21在發(fā)揮代謝調(diào)節(jié)作用時(shí)，必須有βKlotho的協(xié)助，激活FGFR1后，形成FGF21/βKlotho/FGFR復(fù)合體后，F(xiàn)GFR發(fā)生二聚化、自身磷酸化，在下游多種分子作用下激活多種信號(hào)通路，啟動(dòng)Akt等多個(gè)信號(hào)系統(tǒng)共同發(fā)揮對(duì)代謝的調(diào)節(jié)作用[14]。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GF21在不同狀態(tài)下，作用不一，(1)在健康狀態(tài)下發(fā)揮生理作用，不會(huì)對(duì)機(jī)體的正常代謝產(chǎn)生干擾；(2)在病理情況下發(fā)揮重要藥理作用，F(xiàn)GF21在代謝異常的小鼠體內(nèi)會(huì)促進(jìn)解偶聯(lián)蛋白1(uncoupling protein 1,UCP1)、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1(glucose transporter protein 1,GLUT1)等的表達(dá)對(duì)糖、脂代謝進(jìn)行調(diào)節(jié)；(3)當(dāng)機(jī)體處于應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，F(xiàn)GF21具有抵抗多種細(xì)胞凋亡的作用(如肝細(xì)胞、胰島β細(xì)胞、心血管內(nèi)皮細(xì)胞以及心肌細(xì)胞等)[15-18]。雖然FGF21在疾病初期發(fā)揮代償作用，但隨著疾病進(jìn)展，特別是在代謝紊亂時(shí)可能有FGF21抵抗的存在，進(jìn)而影響代謝綜合征的發(fā)展[14]。有研究者認(rèn)為，F(xiàn)GF21可能通過(guò)抵抗炎癥反應(yīng)、抗氧化應(yīng)激作用、調(diào)節(jié)線粒體功能、調(diào)節(jié)熱休克蛋白表達(dá)、調(diào)節(jié)心肌能量代謝和拮抗心肌細(xì)胞凋亡等機(jī)制進(jìn)一步影響動(dòng)脈粥樣硬化等心血管疾病的發(fā)展過(guò)程[19-23]。

因FGF21是目前發(fā)現(xiàn)的FGFs家族中唯一無(wú)促有絲分裂活性作用的基因，當(dāng)其作用于BalB/c 3T3、NIH 3T3和HMECS細(xì)胞后，均無(wú)促有絲分裂活性，故不存在致瘤的可能性，可以降低作為臨床潛在藥物的風(fēng)險(xiǎn)，因此具有活性的FGF21蛋白更是作為糖尿病的新型候選藥物而備受關(guān)注[24]。

綜上所述，F(xiàn)GF21 可能會(huì)成為糖尿病、代謝性疾病、心血管疾病以及腎臟疾病等的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子、生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)[25-26]。本研究通過(guò)PCR 克隆將小鼠FGF21基因片段擴(kuò)增后連接至pET-28a(+)，對(duì)其重組子pET-28a(+)-mFGF21進(jìn)行原核表達(dá)，經(jīng)親和層析后純化，采用Western Blot進(jìn)行鑒定證明成功獲得了可溶性的小鼠FGF21的融合蛋白，且誘導(dǎo)表達(dá)效果理想。為進(jìn)一步研究該融合蛋白的功能并應(yīng)用于動(dòng)脈粥樣硬化及相關(guān)疾病的治療作好了前期準(zhǔn)備。