吳林菁， 王興蘭， 李婉蓉， 劉學(xué)， 楊佳佳， 肖婷， 張嫩玲， 周雪， 姜豐， 沈祥春**， 陶玲**

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院 天然藥物資源優(yōu)效利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 貴州 貴陽 550025； 2.貴州醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院 藥用植物功效與利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 貴州 貴陽 550025； 3.貴州醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院 貴州省普通高等學(xué)校天然藥物藥理與成藥性評價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 貴州 貴陽 550025； 4.貴州醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院 貴州省特色天然藥物資源高效利用工程中心， 貴州 貴陽 550025)

艷山姜Alpiniazerumbet(Pers.)Burtt. et Smith作為為貴州少數(shù)民族常用藥，具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抗心血管疾病等作用，收載于《貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》(2003版)[1]。基于艷山姜果實(shí)揮發(fā)油所具備的顯著心血管藥理學(xué)活性，課題組開展了艷山姜生藥學(xué)[2]、提取工藝及化學(xué)成分[3-5]、藥理學(xué)[6-15]、新劑型[16-17]等方面的研究。艷山姜果實(shí)揮發(fā)油中主要活性組分α-蒎烯、1,8-桉葉油醇、β-蒎烯、莰烯對血管內(nèi)皮細(xì)胞具有顯著的調(diào)控保護(hù)作用[7]，但其活性成分在體內(nèi)的吸收過程還尚不明確。在研究中藥復(fù)雜成分的過程中，普遍認(rèn)為中藥發(fā)揮藥效的活性成分可能是其被吸收入血的成分[18-20]。因此檢測口服中藥后有哪些成分被吸收入血或經(jīng)過人體代謝后會有哪些成分發(fā)生變化，是深入研究中藥藥效物質(zhì)的重要基礎(chǔ)[21-23]。本實(shí)驗(yàn)采用氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)，結(jié)合血清藥物化學(xué)實(shí)驗(yàn)方法，對大鼠灌胃艷山姜揮發(fā)油(EOFAZ)后的血漿樣品進(jìn)行分析檢查，考察EOFAZ在大鼠體內(nèi)的入血成分，為EOFAZ的下一步藥代動力學(xué)研究提供參考，也為EOFAZ的治療心血管疾病藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動物 健康成年雄性 SD 大鼠6只，體質(zhì)量(250±20) g，清潔級，由貴州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，合格證號為SCXK(黔)2018-0001，實(shí)驗(yàn)前12 h禁食不禁水。

1.1.2藥品與試劑 艷山姜采自貴州省黔西南州貞豐縣連環(huán)鄉(xiāng)巧巖村，經(jīng)貴州醫(yī)科大學(xué)龍慶德副教授鑒定為姜科山姜屬植物艷山姜Alpiniazerumbet( Pets. ) Burtt. et Smith 的干燥成熟果實(shí)。乙酸乙酯(分析純，上海申博化工有限公司，1601101)，肝素鈉(北京索萊寶科技有限公司，1024E027)。

1.1.3儀器 Agilent 6890 /5975C GC- MS聯(lián)用儀(美國安捷倫公司)，E104 /02型電子天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)，Microfuge 20R型冷凍離心機(jī)(美國貝克曼庫爾特公司)，XW-80A漩渦混合儀(上海馳唐電子有限公司)，KQ3200型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，UPW-UP-10超純水處理器(成都天莘寧科技有限公司)，GC-MS Solution色譜工作站標(biāo)準(zhǔn)譜庫(美國 NIST 質(zhì)譜檢索數(shù)據(jù)庫)。

1.2 方法

1.2.1艷山姜揮發(fā)油的提取 參照文獻(xiàn)[4]中艷山姜揮發(fā)油的提取方法，精密稱取艷山姜干燥成熟果實(shí)100 g，按照1∶10的比例加入蒸餾水1 000 mL，水蒸氣蒸餾提取5 h后收集揮發(fā)油，加入適量無水硫酸鈉脫水，所得艷山姜揮發(fā)油具有較為濃烈的香味，并呈淡黃色透明液體，得率為0.98%。

1.2.2艷山姜揮發(fā)油供試品的制備 精密吸取艷山姜揮發(fā)油50 μL，置于5 mL的棕色潔凈容量瓶中，加適量乙酸乙酯溶解并定容至刻度線，搖勻，超聲15 min，12 000 r/min離心 10 min，取上清液即得，備用。

1.2.3血漿樣品采集 取SD雄性大鼠6只，給藥前自頸靜脈插管取血0.5 mL，置含有10 g/L肝素的2 mL EP管中，4 ℃ 3 000 r/min離心10 min，取全部上清液作空白血漿，放置于-80 ℃的冰箱儲存?zhèn)溆?；大鼠灌胃艷山姜揮發(fā)油2.0 mL，1 h后自頸靜脈取血0.5 mL，處理方法同空白血漿。

1.2.4血漿樣品處理 取大鼠血漿200 μL，置于2 mL EP管中，加入乙酸乙酯800 μL，渦旋5 min，于4 ℃ 12 000 r/min離心10 min，取上清液加入雙蒸水200 μL，渦旋5 min，12 000 r/min 4 ℃離心10 min，取上清液3 μL于GC-MS進(jìn)樣檢測。

1.2.5氣相色譜條件 色譜柱為ZB-5彈性石英毛細(xì)管柱，運(yùn)行時(shí)間為62 min；初始溫度為45 ℃并保持2 min，以20 ℃/min的速率升溫至75 ℃并保持2 min，2 ℃/min升溫至100 ℃并保持2 min，4 ℃/min升溫至200 ℃并保持1 min，以10 ℃/min升溫至310 ℃并保持5 min。載氣為高純He(99.999%)，分流比20∶1，載氣流量1.0 mL/min，柱前壓7.65 psi，溶劑延遲時(shí)間4.0 min，汽化室溫度250 ℃。

1.2.6質(zhì)譜條件 電子能量70 eV，接口溫度280 ℃，倍增器電壓1 659 V，發(fā)射電流34.6 μA，離子源溫度230 ℃，四極桿溫度150 ℃，離子源為EI源，質(zhì)量范圍29～450 amu。

1.2.7結(jié)構(gòu)鑒定 對總離子流圖中的各峰，經(jīng)過質(zhì)譜計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)系統(tǒng)檢索，及核對標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖Nist2005、Wiley275，鑒定其檢測出的化合物，并利用峰面積歸一化法，測定各化學(xué)成分的相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

2 結(jié)果

大鼠灌胃EOFAZ前后，氣相-質(zhì)譜聯(lián)用儀分析色譜圖見圖1，從血樣中檢測出化合物的結(jié)果如表1所示。艷山姜揮發(fā)油經(jīng)GC-MS檢測并鑒定出51個(gè)成分。大鼠灌胃EOFAZ 1 h后的血漿經(jīng)GC-MS分析，檢測出入血成分37個(gè)，其中主要活性成分β-蒎烯、α-蒎烯、莰烯、1,8-桉葉油醇在EOFAZ及入血成分中所占百分含量均較高，且β-蒎烯在EOFAZ及給藥后血漿中都是相對百分含量最高的成分。

圖1 EOFAZ及大鼠EOFAZ灌胃前后血樣GC-MS結(jié)果 Fig.1 GC-MS chromatogram of EOFAZ and blood samples of rats before and after gavage of EOFAZ in rats

3 討論

由于EOFAZ極性小，在前期實(shí)驗(yàn)中分別考察了氯仿、石油醚、正丁醇、乙酸乙酯作為溶劑，將其用分別配制成同一濃度的樣品進(jìn)行GC檢測，根據(jù)GC檢測結(jié)果和溶解現(xiàn)象綜合比較，發(fā)現(xiàn)乙酸乙酯溶解的樣品出峰數(shù)目較多、峰面積較大、分離度良好，且EOFAZ溶液呈澄清透明狀態(tài)。因此，最終確定乙酸乙酯作為EOFAZ的溶劑。同時(shí)考察了不同比例的乙酸乙酯溶解EOFAZ，其結(jié)果表明乙酸乙酯和EOFAZ的體積比為100∶1是最佳的溶解比例。

為了更多地檢測出EOFAZ在大鼠體內(nèi)的入血成分，在預(yù)實(shí)驗(yàn)時(shí)共考察灌胃EOFAZ后15 min、30 min、45 min、1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、7 h、9 h、12 h、24 h共12個(gè)取血點(diǎn)，采用Aglient7890B型氣相色譜儀分析對比空白血漿和含藥血漿的GC色譜圖，發(fā)現(xiàn)大鼠口服EOFAZ后1 h取血點(diǎn)出峰最多，且峰面積較大，因此最終確定取血時(shí)間點(diǎn)為1 h。

表1 EOFAZ及大鼠EOFAZ給藥前后血樣化合物成分的GC-MS分析Tab.1 GC-MS analysis of EOFAZ and blood samples of rats before and after administration of EOFAZ

注：“-”表示無該成分

生物樣品的預(yù)處理是樣品分析中極其重要的一個(gè)環(huán)節(jié)，在測定血樣時(shí)，首先應(yīng)除去樣品中的蛋白質(zhì)，使結(jié)合型的藥物釋放出來以便測定藥物總濃度。沉淀蛋白的方法有鹽析法、有機(jī)溶劑沉淀法、等電點(diǎn)沉淀法等。由于艷山姜揮發(fā)油在常溫下極易揮發(fā)，應(yīng)當(dāng)處理完樣品立即進(jìn)樣檢測，防止有效成分揮發(fā)，有機(jī)溶劑可使蛋白質(zhì)分子內(nèi)及分子之間的氫鍵發(fā)生變化而使蛋白質(zhì)迅速凝聚，使與蛋白質(zhì)結(jié)合的成分釋放出來，因此本實(shí)驗(yàn)選用有機(jī)溶劑去除蛋白，同時(shí)考慮利用有機(jī)溶劑高效萃取血漿中揮發(fā)性入血成分，分別考察了正丁醇、甲苯、石油醚、乙酸乙酯、正己烷等有機(jī)試劑沉淀蛋白及萃取揮發(fā)性入血成分作用，分別取各試劑沉淀蛋白后的上清液，水洗后再取其上清液，采用Aglient7890B型氣相色譜儀進(jìn)樣分析，比較各試劑沉淀蛋白后血樣的出峰數(shù)目、分離度、峰面積等條件后，發(fā)現(xiàn)石油醚雜峰太多且分離度差，正丁醇、乙酸乙酯、甲苯、正己烷的出峰數(shù)目和出峰時(shí)間較為相近，但乙酸乙酯的分離度較高和峰面積較大，最終確定沉淀蛋白及萃取揮發(fā)性入血成分的有機(jī)溶劑為乙酸乙酯。同時(shí)對乙酸乙酯的用量進(jìn)行考察，結(jié)果顯示乙酸乙酯與血漿樣品的比例為4∶1時(shí)，蛋白沉淀較為完全且出峰數(shù)目較多、峰分離度較好，經(jīng)水洗后能有效除去血漿中的水溶性物質(zhì)，使含藥血漿溶液澄清透明，GC-MS檢測更加精準(zhǔn)無干擾。因此，本實(shí)驗(yàn)確定采用乙酸乙酯為蛋白沉淀劑，且乙酸乙酯與血漿樣品的比例為4∶1時(shí)沉淀蛋白的效果最佳。

本實(shí)驗(yàn)通過GC結(jié)合MS法確定EOFAZ在大鼠中的入血成分有37種，主要有β-蒎烯、1,8-桉葉油醇、β-水芹烯、α-蒎烯、莰烯、對傘花烴、樟腦、石竹烯氧化物、α-異松油烯、d-檸檬烯、冰片、α-蓽澄茄烯、α-松油醇、4-松油醇、β-月桂烯、反式松香芹乙酯等(百分含量分別為20.146%、15.072%、9.09%、7.491%、7.318%、4.122%、2.987%、2.85%、2.666%、2.544%、2.223%、1.614%、1.613%、1.513%、1.068%、1.003%)，這37種成分能是EOFAZ藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)，更多入血成分的鑒定有待進(jìn)一步研究[13]。本研究闡釋了艷山姜活性部位揮發(fā)油進(jìn)入大鼠血液中的成分，為進(jìn)一步研究艷山姜藥材的體內(nèi)過程和藥效物質(zhì)奠定了基礎(chǔ)。[22-23]