于莉娜, 田燕, 趙佩佩, 翁雅倩, 劉楨, 華興

(1.南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院 病理科， 廣東 廣州 510515； 2.南方醫(yī)科大學 基礎醫(yī)學院 病理學系， 廣東 廣州 510515； 3.貴州醫(yī)科大學 臨床醫(yī)學院 病理學教研室， 貴州 貴陽 550004； 4.暨南大學醫(yī)學院附屬廣州紅十字會醫(yī)院， 廣東 廣州 510220)

反面高爾基網(wǎng)的癌基因GOLPH3(golgi phosphorprotein-3)又名GPP34/GMx33/MIDAS，是定位于人類染色體5p13.3、全長3.1 kb、編碼分子量為34 kD的磷酸化高爾基體膜蛋白，亦是近年來發(fā)現(xiàn)的首個定位于反面高爾基網(wǎng)(TGN)的癌基因[1]。以往研究認為，定位于TGN的蛋白質與腫瘤的發(fā)生無直接相關性[2]；但近年研究顯示，在蛋白質的修飾中TGN發(fā)揮重要作用，尤其在腫瘤表觀遺傳學中的作用可能遠遠超過預期，定位于TGN的癌基因GOLPH3在多種實體瘤中的異常擴增現(xiàn)象就是有力佐證[3]。目前關于GOLPH3在腫瘤領域所發(fā)揮的確切作用及其機制尚未明確，且缺乏系統(tǒng)的研究和報道。本研究應用生物信息技術對GOLPH3的腫瘤組織分布情況進行分析，篩選出表達上調的癌組織，應用免疫組織化學SP法檢查這些上調癌組織中GOLPH3蛋白的表達水平，采用逆轉錄定量 PCR(qRT-PCR)技術檢測上調腫瘤細胞株中GOLPH3 mRNA表達水平， 探究GOLPH3與這幾種不同類型腫瘤發(fā)生發(fā)展的關系，為闡明腫瘤的發(fā)生發(fā)展提供新的科學依據(jù)，亦為腫瘤的治療提供新的靶點。

1 材料與方法

1.1 組織、細胞及試劑

1.1.1組織 病例來源于廣州市南方醫(yī)院病理科2013年1月～2015年12月確診并經(jīng)手術切除獲得的胃腺癌(STAD)、肝細胞癌(HCC)、乳腺癌(BRCA)、子宮內膜癌(UCEC)、睪丸生殖細胞腫瘤(TGCT)及前列腺癌(SART)組織石蠟標本各30例，選擇其癌旁正常組織石蠟標本各10例作為對照組。采用連續(xù)切片的方式處理所有組織標本(厚4 μm)。

1.1.2細胞株 人STAD細胞株BGC-823、SGC-790，正常胃黏膜上皮細胞株RGM-1，人HCC細胞株Hep G2、HHCC，人永生化肝細胞株THLE-2，人BRCA細胞株MCF7、SKBr-3，人正常乳腺上皮細胞株MCF10A，人SART細胞株LNCap、PC3，人正常前列腺上皮細胞株RWPE-1，均購自美國ATCC。

1.1.3主要試劑 兔抗人GOLPH3多克隆抗體(購自美國Abcam公司)，即用型EliVisionTMplus試劑盒、DAB顯色試劑盒及磷酸鹽緩沖液(PBS，購自福州邁新生物技術有限公司)，總RNA提取試劑(購自美國Invitrogen公司)，PrimeScript逆轉錄試劑盒(Perfect Real Time)及SYBR Premix Ex Taq試劑盒(購自日本TAKARA公司)。

1.2 方法

1.2.1GOLPH3的數(shù)字化細胞表達譜分析 以GOLPH3為查詢對象，應用GCBI-基因雷達數(shù)據(jù)庫進行搜索，統(tǒng)計GOLPH3在不同腫瘤細胞中的表達豐度。

1.2.2免疫組織化學染色 組織標本均在同一條件下采用SP法進行免疫組織化學染色：65 ℃烤片2 h，利用二甲苯及不同濃度乙醇試劑完成脫蠟及水化處理，利用檸檬酸鈉抗原修復液修復抗原后使用雙氧水封閉內源性過氧化物酶，山羊血清封閉液處理1 h，加入相應目的蛋白的一抗，4 ℃孵育過夜，使用PBS清洗3次；二抗室溫孵育2 h，同樣使用PBS清洗樣本3次(5 min/次)，通過DAB顯色，蘇木素復染及樹膠封片后，使用光學顯微鏡采集圖片及分析。選用已知陽性的肺腺癌標本作為陽性對照，PBS液代替一抗作陰性對照。

1.2.3qRT-PCR檢測 將各種細胞種植于6孔板中，待細胞長滿后加入Trizol(1 mL/孔)，充分吹勻后轉移至1.5 mL的EP中，冰上裂解30 min；加入三氯甲烷200 μL，劇烈震蕩后，靜置2 min，在4 ℃及12 000 r/min條件下離心15 min；將上層透明液體轉移至新的1.5 mL EP管中，加入等量的異丙醇，緩慢輕柔地上下顛倒混勻，冰上靜置10 min，再在4 ℃及12 000 r/min條件下離心10 min。去上清，加入75%乙醇溶液清洗沉淀，在4 ℃及12 000 r/min條件下離心10 min；去上清，干燥沉淀后，加入適量的DEPC水溶解沉淀。使用微量紫外分光光度計檢測樣本RNA濃度。以RNA總量1 000 ng的標準進行逆轉錄反應獲得cDNA。GOLPH3基因上下游引物序列分別為5′-AAGCCGTTCTTGACAAATGG-3′和5′-ATTGGTGTTGGCCTTCAGAC-3′；內參GAPDH基因上下游引物序列分別為5′-ACAGTCAGCCGCATCTTCTT-3′和5′-GACAAGCTTCCCGTTCTCAG-3′，每個樣本的檢測均設立3個重復孔，利用ΔΔCT算法計算目的基因的相對表達量。

1.2.4結果判定 細胞質內出現(xiàn)棕黃色至深棕色顆粒為GOLPH3表達陽性細胞，符合以下標準：(1)細胞結構清晰，(2)陽性顆粒定位準確，(3)著色程度明顯高于背景且對比清楚。按陽性細胞的數(shù)量評分(A)：陽性細胞數(shù)≤15%記1分，陽性細胞數(shù)為16%～75%記2分，陽性細胞數(shù)≥75%記3分；按細胞染色程度評分(B)：無顯色細胞記0分，淡黃色記1分，棕黃色記2分，棕褐色記3分?？偡謹?shù)(T)=A×B，T=0時判定為“-”，T=1～2時判定為“+”，T=3～4時判定為“++”，T=6～9時判定為“+++”，“+～+++”為陽性表達。隨機選擇5～10個高倍鏡視野觀察并評分。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 GOLPH3的數(shù)字化組織表達譜

結果顯示，GOLPH3廣泛表達于人類大多數(shù)正常組織，在STAD、BRCA、UCEC及TGCT等多種腫瘤細胞中的表達顯著上調。見圖1。

圖1 GOLPH3在不同腫瘤細胞中的表達情況Fig.1 The expression of GOLPH3 in different tumor cells

2.2 GOLPH3蛋白在6種常見惡性腫瘤中的表達

結果顯示，GOLPH3表達的陽性信號定位于細胞質內，在癌旁組織中多為弱陽性表達(+)，中等強度陽性表達率僅為8.3%，而在相應STAD、HCC、BRCA、UCEC、TGCT及SART等腫瘤組織中，GOLPH3的表達顯著升高，多為中強表達(++/+++)。中強度陽性表達率為96.7%，與相應癌旁組織比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見表1、圖2。

表1 GOLPH3在6種惡性腫瘤組織與癌旁組織中的表達Tab.1 Expression of GOLPH3 in malignant tumors and adjacent normal tissues

注：a為胃、b為肝、c為乳腺、d為子宮內膜、e為睪丸、f為前列腺，A為STAD、 B為HCC，C為BRCA、D為UCEC、E為TGCT、F為SART圖2 GOLPH3在6種常見惡性腫瘤與癌旁正常組織中的表達水平(SP，×200)Fig.2 The expression level of GOLPH3 in common malignant tumors and adjacent normal tissues

2.3 GOLPH3 mRNA在4種常見惡性腫瘤細胞株的表達

結果顯示，GOLPH3 mRNA在人STAD細胞株、人HCC細胞、人BRCA細胞株及人SART細胞株中的表達水平均顯著高于其相對應的正常細胞株，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見圖3。

(1)與正常細胞株比較，P<0.05圖3 GOLPH3 mRNA在4種常見惡性腫瘤細胞株的表達(qRT-PCR)Fig.3 The expression of GOLPH3 mRNA in four common malignant tumor cell lines and their corresponding control cell lines

3 討論

近年來，隨著分子生物學技術的突飛猛進，新發(fā)現(xiàn)的腫瘤相關基因也日益增多[4-6]。在正常細胞基因組中，一旦發(fā)生突變或被異常激活后可使細胞發(fā)生惡性轉化的基因稱之為癌基因，癌基因反映的是一種功能的獲得，即獲得使細胞發(fā)生癌變的能力。但是這種功能的獲得并不是癌基因的唯一作用[7]，正常細胞的生長、分化和增殖均需要原癌基因的參與[8]。因此確切地說，癌基因是一類具有正常的生物學功能，僅在特殊條件下才會使細胞發(fā)生癌變的一類基因[9]。

GOLPH3自首次報道以來，一直被認為是一種磷酸化的高爾基體膜蛋白，參與執(zhí)行細胞正常的高爾基體的蛋白質分選功能[10]。直到2009年Nature有文章提出，GOLPH3是首個定位于TGN的癌基因[1]，能夠促進腫瘤的發(fā)生[11-14]。隨后這一研究成果引起醫(yī)學界的廣泛關注，認為GOLPH3是一個真正意義上的且具有強大轉化能力的癌基因[15-20]。目前關于GOLPH3癌基因功能的研究尚處于起步階段，其在人體常見惡性腫瘤組織中是否均存在基因活化現(xiàn)象、是否也具有癌基因特性等尚缺乏系統(tǒng)性報道。

生物信息學技術是研究新基因并進行功能研究的重要手段，已廣泛地滲透到醫(yī)學的各個領域。本研究首先通過GCBI數(shù)據(jù)庫對GOLPH3的腫瘤組織分布情況進行初步分析，結果顯示GOLPH3廣泛表達于人類大多正常組織，在大部分腫瘤細胞株如STAD、BRCA、UCEC、TGCT及SART中存在顯著的表達上調；隨后，本研究選擇臨床較常見的相應腫瘤組織標本進行GOLPH3表達驗證，結果顯示，GOLPH3蛋白在全身多器官癌組織旁的正常組織中多呈低表達(+)，與GCBI數(shù)據(jù)庫分析結果一致，提示GOLPH3作為原癌基因在正常細胞中具有活性，參與細胞正常的生物學功能，而在STAD、HCC、BRCA、UCEC、TGCT及SART等惡性腫瘤組織中，GOLPH3的表達量相對其配對的正常組織顯著升高，差異具有統(tǒng)計學意義。由于胃、肝、乳腺及前列腺腫瘤發(fā)病率高且嚴重危害人們生命健康，應用qRT-PCR技術從細胞水平檢測了人STAD細胞株、人肝細胞癌細胞、人BRCA細胞株及人SART細胞株及其相對應的正常細胞株中GOLPH3 mRNA表達水平，結果顯示腫瘤細胞株中GOLPH3 mRNA表達顯著高于相對應的正常細胞株(P<0.01)。以上結果均提示在部分惡性腫瘤中GOLPH3作為原癌基因被活化，參與了相應腫瘤的發(fā)生。

綜上所述，目前關于腫瘤標志物的研究發(fā)展飛速，迄今為止，GOLPH3是首個也是唯一被發(fā)現(xiàn)的定位于TGN的癌基因。本研究發(fā)現(xiàn)，GOLPH3表達量的上調與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關。隨著對GOLPH3基因研究的進一步深入，將有力的推動腫瘤的表觀遺傳學研究，為多種常見惡性腫瘤的診治提供新的思路和線索。