張 強(qiáng)，羅勤貴，趙南昕，齊雨薇，張 倩，葛武鵬，楊保偉

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院， 陜西楊凌 712100)

阪崎克羅諾桿菌(Cronobactersakazakii)是一種常見的食源性致病菌，可導(dǎo)致新生兒和免疫力低下人群菌血癥、腦膜炎和壞死性小腸結(jié)腸炎等疾病，并可引起嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥、甚至死亡，致死率高達(dá)40%～60%[1-2]。此外，一些腫瘤、糖尿病患者及老年人等感染該菌還可引起膿毒血癥，泌尿道、呼吸道、創(chuàng)傷面或局部感染。國(guó)際食品微生物標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)已將阪崎克羅諾桿菌列為嬰兒配方奶粉的A類致病菌[3]。

目前，雖對(duì)阪崎克羅諾桿菌的環(huán)境來源尚不清楚，但許多病例報(bào)告均表明嬰兒配方粉是該菌的主要感染載體，2004年，安徽阜陽(yáng)劣質(zhì)嬰兒配方粉事件中患者所表現(xiàn)的頭部腫大和反應(yīng)遲鈍等臨床癥狀與阪崎腸桿菌感染極為相似，研究結(jié)果也證明了該菌和感染間的相關(guān)性[4]。同時(shí)，研究者也已從乳粉原料[5]、谷物[6]、巧克力[6]、馬鈴薯粉[6]、嬰兒干制食品和配方食品[1,4,7]、意大利面食加工廠和家庭環(huán)境中分離出阪崎克羅諾桿菌[7-9]。相對(duì)而言，國(guó)外對(duì)阪崎克羅諾桿菌污染嬰幼兒配方乳粉，進(jìn)而導(dǎo)致嬰幼兒感染該菌引起疾病爆發(fā)的事件較多，而中國(guó)關(guān)于市售嬰幼兒配方食品中該菌的流行狀況及引起疾病爆發(fā)的問題卻鮮見報(bào)道。

本研究調(diào)查從陜西省部分超市和婦幼用品專賣店采集的366份嬰幼兒配方乳粉、米粉及其他食品中阪崎克羅諾桿菌的流行狀況，并對(duì)分離株進(jìn)行藥敏性、基因分型和毒力因子檢測(cè)研究，旨在掌握市售嬰幼兒配方食品中阪崎克羅諾桿菌的污染狀況及相關(guān)特性，為預(yù)警與控制該菌流行及風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

嬰幼兒配方乳粉、米粉和其他食品共366份，分別采集自陜西省西安市、寶雞市、咸陽(yáng)市、武功縣、周至縣、乾縣、禮泉縣、扶風(fēng)縣、岐山縣和眉縣部分超市及孕嬰專賣店。其中，嬰幼兒米粉220份，嬰幼兒奶粉131份，其他品種嬰幼兒食品15份。采集的樣品基本涵蓋了目前市售的國(guó)產(chǎn)和進(jìn)口嬰幼兒食品品牌。

阪崎克羅諾桿菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC29544和ATCC BAA-894由河南省疾病預(yù)防控制中心提供，藥敏性檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控菌大腸埃希氏菌ATCC25922和糞腸球菌ATCC29212為中國(guó)藥品生物制品檢定研究院提供。

Lutia-Bertani(LB)營(yíng)養(yǎng)瓊脂、Mueller Hinton(MH)瓊脂、緩沖蛋白胨水(BPW)、改良月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯-萬古霉素(mLST-Vm)購(gòu)自北京陸橋技術(shù)股份有限公司。TaqDNA聚合酶、dNTPs、DNA Marker DL2000均購(gòu)自Takara寶生物工程(大連)有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 阪崎克羅諾桿菌分離鑒定 按照國(guó)標(biāo)規(guī)定的方法分離檢測(cè)阪崎腸桿菌[10],采用阪崎腸桿菌特異性引物ompA-F和ompA-R擴(kuò)增其ompA基因、測(cè)序后對(duì)菌株進(jìn)行確定(表1)，檢測(cè)中以ATCC29544作為陽(yáng)性對(duì)照。獲得阪崎腸桿菌后，再使用Stoop等[11]建立的方法從阪崎腸桿菌中鑒定出阪崎克羅諾桿菌。

1.2.2 藥敏性測(cè)定 供試抗生素分別為：利福平(RIF)、氨芐西林(AMP)、阿莫西林(AMO)、鏈霉素(STR)、頭孢西丁(FOX)、甲氧芐啶/磺胺甲噁唑(TMP/SMZ)、四環(huán)素(TET)、阿莫西林/克拉維酸(AMC)、氯霉素(CHL)、萘啶酮酸(NAL)、慶大霉素(GEN)、環(huán)丙沙星(CIP)、頭孢曲松(CRO)、加替沙星(GAT)、頭孢哌酮(CEFO)和左氧氟沙星(LEV)。藥敏性測(cè)定按照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(the Clinical and Laboratory Standards Institution，CLSI)推薦的瓊脂稀釋法進(jìn)行，按照CLSI的規(guī)范進(jìn)行藥敏性結(jié)果判讀[12]。

1.2.3 毒力基因檢測(cè) 采用煮沸法制備PCR模板。毒力基因檢測(cè)用引物序列等信息詳見表1，由北京奧科生物技術(shù)有限公司合成。檢測(cè)中以ATCC29544和ATCC BAA-894為陽(yáng)性對(duì)照。

PCR反應(yīng)體系為25 μL。各PCR反應(yīng)物的濃度及相應(yīng)添加量分別為：MgCl2(25 mmol/L)1.5 μL、dNTP(2.5 mmol/L)2 μL、引物(50 pmol/L)各0.3 μL、TaqDNA聚合酶0.25 μL、模板5 μL，加超純水至25 μL。擴(kuò)增條件為94 ℃預(yù)變性10 min；94 ℃變性1 min，退火1 min，72 ℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min；最后4 ℃條件下保溫。退火溫度由擴(kuò)增目標(biāo)基因引物組成確定(表1)。

使用10 g/L的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物。取2 μL PCR產(chǎn)物與適量Loading Buffer混勻，加入瓊脂糖凝膠點(diǎn)樣孔，以DNA Marker DL2000為對(duì)照，100 V恒壓電泳30 min。電泳結(jié)束后將凝膠移入凝膠成像系統(tǒng)照像分析。

1.2.4 脈沖場(chǎng)凝膠電泳(Pulse Field Gel Electrophoresis,PFGE)分型 PFGE基因分型方法主要按照美國(guó)疾病預(yù)防控制中心(the Center for Disease Control and Prevention,CDC)推薦的應(yīng)用于食源性疾病監(jiān)測(cè)網(wǎng)PulseNet中適用于大腸桿菌和沙門氏菌的標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行[13]。

表1 PCR引物及其他參數(shù)Table 1 PCR primers and other parameters

注:F表示上游引物，R表示下游引物。

Note:F represents forward primer,R represents reverse primer.

2 結(jié)果與分析

2.1 阪崎克羅諾桿菌分離與檢測(cè)

366份樣品中共檢出87份阪崎克羅諾桿菌陽(yáng)性樣品，169株阪崎克羅諾桿菌。檢出菌株ompA基因PCR檢測(cè)結(jié)果如圖1所示。

2.2 阪崎克羅諾桿菌的流行狀況

阪崎克羅諾桿菌陽(yáng)性樣品平均檢出率為23.8%。131份嬰幼兒配方乳粉中檢出陽(yáng)性樣品24份，檢出率為18.3%。配方乳粉陽(yáng)性樣品全部為牛乳粉，配方羊乳粉中未檢出該菌。220份嬰幼兒米粉中檢出陽(yáng)性樣品60份，檢出率為27.3%。15份其他嬰幼兒食品中檢出陽(yáng)性樣品3份，檢出率為20.0%(表2)。

M.DL2000 bp DNA marker，1.ATCC29544(陽(yáng)性對(duì)照) ATCC29544 (positive control);2.陰性對(duì)照 Negative control; 3～5.待檢菌株 Strain identified

圖1 阪崎克羅諾桿菌ompA基因
PCR檢測(cè)瓊脂糖凝膠電泳
Fig.1 Agarose based electrophoresis of PCR detection ofompAofCronobactersakazakii

表2 嬰幼兒食品中阪崎克羅諾桿菌檢出狀況Table 2 Prevalence of Cronobacter sakazakii in infant and baby foods

2.3 阪崎克羅諾桿菌的藥敏性

168株(99.4%)阪崎克羅諾桿菌對(duì)利福平產(chǎn)生抗性，對(duì)其他供試抗生素具有抗性的菌株及相應(yīng)比例依次為阿莫西林20.12%、鏈霉素18.93%、四環(huán)素17.16%、氨芐西林12.43%、慶大霉素11.24%、頭孢西丁5.92%、甲氧芐啶/磺胺噁唑5.32%、阿莫西林/克拉維酸4.74%、氯霉素2.96%、加替沙星1.78%、環(huán)丙沙星 1.78%、萘啶酮酸1.78%；頭孢曲松的菌株最少 (0.59%)。未檢測(cè)到對(duì)左氧氟沙星和頭孢哌酮耐藥的菌株(表3)。

17株(10.06%)菌對(duì)四環(huán)素表現(xiàn)出中介耐藥，對(duì)其他供試抗生素中介耐藥的狀況依次為氨芐西林5.92%，頭孢哌酮5.33%，氯霉素和頭孢西丁2.96%，鏈霉素、環(huán)丙沙星和萘啶酮酸2.37%，左氧氟沙星、阿莫西林和阿莫西林/克拉維酸1.18%，利福平0.59%(表3)。

169株阪崎克羅諾桿菌中，48株(28.40%)分離自嬰幼兒配方乳粉。該48株菌全部對(duì)利福平耐藥，對(duì)氨芐西林和阿莫西林耐藥的菌株比例均為35.42%，對(duì)鏈霉素和頭孢西丁的耐藥菌株比例均為14.58%，對(duì)甲氧芐啶/磺胺噁唑?yàn)?2.50%。未檢出乳粉源分離株對(duì)加替沙星、左氧氟沙星和頭孢哌酮耐藥(表4)。

表3 阪崎克羅諾桿菌的藥敏性(n=169)Table 3 Antibiotic susceptibility of Cronobacter sakazakii

注：鏈霉素的耐藥折點(diǎn)參考美國(guó)國(guó)家抗生素監(jiān)測(cè)網(wǎng)耐藥折點(diǎn)值[14]。

Note:The breakpoint for streptomycin referenced to that of the National Antimicrobial Resistance Monitoring System of the United States of America[14].

169株阪崎克羅諾桿菌中，121株(71.60%)源于嬰幼兒米粉和其他食品。其中120 (99.17%)株對(duì)利福平產(chǎn)生抗性，對(duì)氨芐西林和阿莫西林耐藥的米粉源菌株比例均為20.66%，對(duì)鏈霉素為14.05%、頭孢西丁為13.22%。未檢出米粉和其他食品源菌株對(duì)加替沙星、左氧氟沙星、頭孢曲松和頭孢哌酮耐藥(表 4)。

2.4 阪崎克羅諾桿菌的多重耐藥性

169株阪崎克羅諾桿菌至少可抗1種抗生素，有15株菌(8.88%)至少可抗4種抗生素，4株(2.37%)至少可抗7種抗生素，未檢出可抗10種以上抗生素的菌株。12株(63.16%)源于配方乳粉的菌株和7株(36.84%)源于米粉的菌株可抗至少4種抗生素(表5)。

2.5 阪崎克羅諾桿菌毒力基因檢測(cè)

ompX檢出率最高(79.88%)，其次分別為cpa(71.01%)、sip(65.68%)和hly(55.03%)。分離菌株中檢測(cè)到任何目標(biāo)基因(表6)。分離株中同時(shí)檢出3種目標(biāo)毒力基因的情況最為普遍(32.54%)，同時(shí)檢出4種毒力基因的菌株比例為28.99%，檢出2種毒力基因的菌株比例為 19.53%，檢出1種毒力基因的菌株比例最低 (11.83%)(表7)。

2.6 阪崎克羅諾桿菌PFGE分型

對(duì)阪崎克羅諾桿菌進(jìn)行XbaⅠ酶切、PFGE電泳、BioNumerics軟件聚類分析后，按照95%及以上同源性，169株阪崎克羅諾桿菌的可被分為4個(gè)大簇、8個(gè)小簇和1個(gè)單一的基因型(圖2)。

分離自同一種類嬰幼兒食品中的菌株經(jīng)PFGE分型聚類后基本處于同一大簇。T2、T3、T4、T5、T6、T7、T12和T13等8簇中的菌株均分離自米粉，T9和T10簇中的菌株均分離于配方乳粉，表明源于同一種類的嬰幼兒食品中的菌株之間親緣關(guān)系較近。

除了品牌H1和N1源阪崎克羅諾桿菌分離株的基因圖譜較為分散外，其他7個(gè)主要品牌嬰幼兒食品中的菌株的基因圖譜分布均比較集中，基本位于同一小簇或同一簇。如：分離自品牌Y1、M1和F1的菌株主要分布在T3簇，分離自品牌Y2的菌株主要分布在T2簇，分離自品牌W1的菌株主要分布在T1簇和T3簇，分離自品牌B1的菌株主要分布在T3簇和T9簇，表明分離于同一品牌嬰幼兒食品的菌株具有較高的基因同源性。

表4 阪崎克羅諾桿菌分離株的藥敏性Table 4 Antibiotic susceptibility of Cronobacter sakazakii isolates

表5 不同食品源阪崎克羅諾桿菌的多重耐藥性Table 5 Multidrug resistance of Cronobacter sakazakii in different foods

表6 阪崎克羅諾桿菌毒力基因檢測(cè)結(jié)果(n=169)Table 6 Results of virulence genes detection in Cronobacter sakazakii

注：cpa為血漿纖溶酶原激活物編碼基因，hly為溶血素編碼基因，ompX為外膜蛋白編碼基因，sip為免疫相關(guān)蛋白編碼基因。

Note:cpais plasminogen activator gene;hlyis hemolysin gene;ompXis outer membrane gene X;sipsiderophore-interacting gene.

表7 阪崎克羅諾桿菌中同時(shí)檢出多種毒力基因結(jié)果(n=169)Table 7 Results of multi-virulence genes detection in Cronobacter sakazakii (n=169)

3 討 論

阪崎克羅諾桿菌在食品和環(huán)境中分布廣泛，具有較強(qiáng)的增殖力、耐熱性和耐高滲透壓能力，易在食品加工過程形成生物膜[15]。嬰幼兒配方粉中極微量的污染(< 3 cfu/100g)就可能大量繁殖，進(jìn)而導(dǎo)致感染事件的發(fā)生[3,16]。2004年10月，F(xiàn)arber[17]在第一屆國(guó)際食品微生物標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)(International Commission on Microbiological Specifications for Foods，ICMSF)中國(guó)國(guó)際食品安全會(huì)議上指出，不同地區(qū)阪崎克羅諾桿菌的檢出率(0.12%～14.2%)存在明顯的不同。

(圖續(xù)轉(zhuǎn)下頁(yè) Be continued in next page)

T1～T13表示PFGE分型后不同的亞型 T1 to T13 stand for different subtypes after PFGE subtyping

自阪崎腸桿菌發(fā)現(xiàn)至今，人們對(duì)其致病性已有廣泛一致的認(rèn)識(shí)，但對(duì)其致病機(jī)理、流行病學(xué)及病原學(xué)特性研究尚淺。一些研究顯示，即使嬰幼兒配方食品的各項(xiàng)指標(biāo)符合相關(guān)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，也有可能被阪崎腸桿菌污染。本次調(diào)查結(jié)果表明所采集的嬰幼兒配方食品均有不同程度的阪崎克羅諾桿菌污染，且檢出率較高。由于該菌致病性較強(qiáng)，且主要危害嬰幼兒健康，因此國(guó)家應(yīng)制定比較詳細(xì)且較為嚴(yán)格的檢測(cè)指標(biāo)，開發(fā)較為快速的檢測(cè)方法，縮短檢測(cè)時(shí)間，保障嬰幼兒食品安全[18]。

研究中嬰幼兒配方食品源阪崎克羅諾桿菌分離株的耐藥性明顯低于徐英春等[19]對(duì)臨床分離株的研究結(jié)果，原因可能是由于該研究中的分離株來自于食品，而臨床分離株可能受臨床用藥的影響較大，產(chǎn)生了較強(qiáng)的耐藥性。研究表明，阪崎克羅諾桿菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素、特別是頭孢菌素較為敏感，但其對(duì)三代頭孢(頭孢曲松)和四代頭孢(頭孢西丁)的抗性較裴曉燕等[20]在2007年從嬰幼兒奶粉中分離的阪崎腸桿菌的有所提高，表明隨著抗生素的廣泛使用，存在于嬰幼兒食品和環(huán)境中的阪崎克羅諾桿菌在長(zhǎng)期的進(jìn)化過程中耐藥水平也在逐漸提高。

與其他腸桿菌科革蘭氏陰性細(xì)菌相比，阪崎克羅諾桿菌的耐藥程度總體上較低，這可能與該菌主要屬于環(huán)境菌而非嗜性寄宿腸道內(nèi)環(huán)境微生物，相比之下發(fā)病率較低、治療性用藥較少和該細(xì)菌的生物特點(diǎn)等因素有關(guān)。但是，阪崎腸桿菌感染嬰幼兒后的死亡率可高達(dá)50%以上，除兒童的免疫狀況外，合理選擇和有效應(yīng)用抗生素，對(duì)提高治愈率、降低死亡率是非常重要的措施。研究嬰幼兒食品源阪崎克羅諾桿菌的藥敏性對(duì)控制該菌耐藥水平的提高和保障食品安全具有重大意義。

PFGE結(jié)果表明，源于同類食品或同一品牌不同批次食品的菌株具有較高的基因同源性，這與裴曉燕等[1]前期對(duì)中國(guó)市售嬰幼兒配方粉源阪崎腸桿菌的基因型研究結(jié)果相同。究其原因，很可能是用于生產(chǎn)同類嬰幼兒食品時(shí)所用的原輔材料(如：淀粉、各種維生素和DHA等)由同一供應(yīng)商提供，生產(chǎn)環(huán)境部分相同或比較相似，從而導(dǎo)致阪崎克羅諾桿菌在生產(chǎn)源頭或生產(chǎn)過程對(duì)原輔料造成污染，進(jìn)而在不同品牌的同類食品中檢出，分離株在親緣關(guān)系上較為接近。

另外，由于研究中采集的同一品牌的食品樣品并非同一批次生產(chǎn)，這就說明該品牌的嬰幼兒食品在生產(chǎn)過程可能存在某一環(huán)節(jié)的不安全問題，導(dǎo)致該品牌不同批次的嬰幼兒食品均存在被同一基因型的阪崎克羅諾桿菌污染的可能。食用該品牌嬰幼兒奶粉或米粉的嬰幼兒如果受到阪崎克羅諾桿菌的侵染而患病，可能會(huì)出現(xiàn)相同或相似的癥狀，或出現(xiàn)集中爆發(fā)的趨勢(shì)。

PFGE聚類結(jié)果表明除了幾個(gè)小簇由于所涵蓋的菌株數(shù)量較少而無法顯示出具有相同或相似基因型菌株的食品品牌多樣性特征外，其他各大簇中所包含的阪崎克羅諾桿菌陽(yáng)性食品品牌種類都不少于8種，表明分離于這些品牌的嬰幼兒食品的菌株在不同地域之間的流行比較廣泛，在自然界進(jìn)化過程中可能有著較近的同源關(guān)系，或這些不同品牌的嬰幼兒食品在生產(chǎn)過程使用了被同一克隆的阪崎克羅諾桿菌污染的同一基料或輔料。例如，T3簇中的14-20(1)為品牌H2的嬰幼兒奶粉，但酶切圖譜顯示它與從品牌為Y2的嬰幼兒米粉中分離的14-10(1)之間同源性高達(dá) 99.5%以上。在不同品牌的嬰幼兒食品中檢出具有相同或相似基因型的阪崎克羅諾桿菌表明該菌具有在大范圍導(dǎo)致嬰幼兒疾病爆發(fā)的可能性，應(yīng)引起相關(guān)食品安全檢測(cè)部門的高度重視。