曹霞飛 毛新武 宋安華 肖 劍 戚 平 彭明軍 劉 肅

1.廣州市食品檢驗所，廣東廣州 511405；2.廣州市藥品檢驗所，廣東廣州 510160

注射用還原型谷胱甘肽鈉主要成分是還原型谷胱甘肽鈉，是人類細胞中自然合成的一種肽，由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸組成，廣泛分布于機體各器官內(nèi)，為維持細胞生物功能發(fā)揮著重要的作用?？捎糜诟螕p傷及某些藥物（化療藥、抗腫瘤藥、抗結(jié)核藥、精神抑郁藥、抗抑郁藥、撲熱息痛）導(dǎo)致的中毒的輔助治療，另外，還原型谷胱甘肽是常用微整形的“美白針”的主要成分[1-3]，隨著現(xiàn)今國內(nèi)微整形的盛行，注射用還原型谷胱甘肽鈉在國內(nèi)的需求量大，進口量大。不法商家為了暴利而生產(chǎn)出各種假劣藥品，嚴(yán)重威脅著群眾生命健康。

近紅外光是介于可見光（VIS）和中紅外（MIR）之間的電磁波，美國材料檢測協(xié)會（ASTM）定義的近紅外光譜的波長范圍為780～2526nm（12820～3959cm-1），習(xí)慣上又劃分為短 波近紅外區(qū)（700～1100nm）和長波近紅外區(qū)（1100～2526nm）[4]。一致性檢驗是一種快捷的圖譜比較方法，通過比較待測樣品的光譜與已知樣品的一組參考光譜是否具有一致性，從而判斷待測樣品與已知樣品是否具有一致的藥品質(zhì)量[5]。

傳統(tǒng)的藥品質(zhì)量檢測控制方法如色譜法、光譜法等儀器昂貴、操作復(fù)雜、檢驗耗時，試劑量多，樣品處理復(fù)雜，難以實現(xiàn)在基層藥品的現(xiàn)場監(jiān)督、快速打假。近紅外光譜分析技術(shù)以其簡便、快速、高效、綠色、重復(fù)性好、穩(wěn)定性好、無損分析、應(yīng)用范圍廣，可實時在線分析等優(yōu)點，可應(yīng)用于藥品的定性和定量快速篩查，在藥品監(jiān)管和打假方面發(fā)揮著重要作用[6]。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

甲、乙兩臺儀器為同一廠家同一型號：德國 Bruker M atrix-F 型傅里葉變換近紅外光譜儀（配有1.5m 長的固體光纖探頭，InGaAs 型檢測器；OPUS5.0 及7.0 光譜分析軟件）。

1.2 試藥

在進口藥品抽樣系統(tǒng)中隨機抽取合格的進口樣品注射用還原型谷胱甘肽鈉，包括Pharminvest SPA 廠家的古拉定14 批，每批6 瓶，共84 個樣品和BIOMEDICA FOSCAMA 廠家的泰特兩批，每批兩瓶共4 個樣品。規(guī)格及包裝均為：0.6g/甁，透明玻璃瓶裝。

2 方法與結(jié)果

2.1 光譜的采集與處理

實驗開始前先進行儀器自檢，檢測合格后開始采集近紅外漫反射光譜。分別用甲、乙兩臺儀器采集樣品，用近紅外光譜測樣統(tǒng)一程序測定，采集譜圖時，先采用隔玻璃瓶底測試法將光纖探頭抵住玻璃瓶底采集譜圖，波數(shù)范圍12000～4000cm-1，分辨率8cm-1，每批樣品6 瓶，每瓶測定1 次，收集樣品編號1～16 光譜信息。然后再采用直接接觸樣品測試法采集譜圖，先將樣品玻璃瓶塞拆除，將瓶內(nèi)粉末整平，用近紅外光譜儀光纖探頭伸入瓶內(nèi)，壓實粉末，使光纖探頭緊貼粉末，測定，收集光譜。

在OPUS 的Setup Conformity Test 模塊建模軟件中，取8998.9～7795.5 cm-1、7413.6～6985.5 cm-1、 6823.5～4023.1cm-1譜段范圍，分別對兩種方法采集的譜圖信息進行矢量歸一化法、一階導(dǎo)數(shù)化法、一階導(dǎo)數(shù)化+矢量歸一化法、二階導(dǎo)數(shù)化法等數(shù)據(jù)預(yù)處理后，選擇最佳數(shù)據(jù)預(yù)處理方法，建立合格性測試模型。比較兩種模型的優(yōu)劣，確定最佳模型，并進行專屬性、耐用性驗證。

2.2 結(jié)果與分析

甲、乙兩臺儀器采用隔玻璃瓶底測試法測得古拉定近紅外光譜比較及同一儀器古拉定與泰特光譜比較見圖1，甲、乙兩臺儀器采用直接接觸法測得古拉定近紅外光譜比較及同一儀器古拉定與泰特光譜比較見圖2。

圖1 隔玻璃瓶底測得各譜圖比較圖

圖2 直接接觸測得各譜圖比較圖

2.2.1 一致性檢驗光譜預(yù)處理方法和建模譜段的選擇 由于一致性檢驗對測試光譜的要求非?？量?，因此必須對光譜進行一定的預(yù)處理，盡量消除各種物理和電子噪音信號的干擾。在不同儀器上測定的近紅外光譜圖，可能會因儀器條件等原因，導(dǎo)致對同一樣品測得的光譜稍有差異，這種差異主要表現(xiàn)為基線的偏移和旋轉(zhuǎn)[7-8]。對于基線偏移，可以通過矢量歸一化或者一階導(dǎo)數(shù)化來消除；對于基線旋轉(zhuǎn)，可以采用一階導(dǎo)數(shù)化結(jié)合矢量歸一化處理來消除，或使用二階導(dǎo)數(shù)化[9-10]。

現(xiàn)分別取隔玻璃瓶底和直接接觸測試法兩種方式采集不同儀器測得的古拉定譜圖進行各種預(yù)處理比較，見圖3～4。通過對比不同預(yù)處理后圖譜情況，可以看出，矢量歸一化處理后基線的旋轉(zhuǎn)沒有消除，一階導(dǎo)數(shù)化結(jié)合適量歸一化基本消除了基線偏移和旋轉(zhuǎn)帶來的影響，而二階導(dǎo)數(shù)化容易放大噪音和散射光帶來的影響，因此平滑點不宜太少，設(shè)置為13 或17 為宜，也不宜太多，否則會導(dǎo)致平滑掉一些光譜信息。另外，觀察不同儀器測得注射用還原型谷胱甘肽鈉近紅外 圖 譜，在8900～7800cm-1、7500～6900cm-1、6500～4000cm-1譜段圖譜中均有較豐富的譜圖信息。綜上所述，要建立一致性檢驗?zāi)Ｐ?，可選擇一階導(dǎo)數(shù)化+矢量歸一化預(yù)處理方法，平滑點數(shù)13或17，譜 段8900～7800cm-1、7500～6900cm-1、6500～4000cm-1。

圖3 隔玻璃瓶底測得古拉定譜圖預(yù)處理比較圖

圖4 直接接觸測得古拉定譜圖預(yù)處理比較圖

2.2.2 建立一致性檢驗?zāi)Ｐ秃万炞C 在OPUS的Setup Conformity Test 建模模塊中，取古拉定12 批，編號1～12 的光譜信息作為參考光譜分別建立隔玻璃瓶底測試法一致性檢驗?zāi)Ｐ停úＡＰ停┖椭苯咏佑|測試法一致性檢驗?zāi)Ｐ停ǚ遣ＡＰ停?，結(jié)果見圖5～6。參數(shù)設(shè)置為：一階導(dǎo)數(shù)化+矢量歸一化預(yù)處理，平滑點為13，譜段范圍 為8998.9～7795.5cm-1、7413.6～6985.5cm-1、6823.5～4023.1cm-1，CI 限度為6。

圖5 隔玻璃瓶底測一致性檢驗?zāi)Ｐ停úＡＰ停?/p>

圖6 直接接觸測一致性檢驗?zāi)Ｐ停ǚ遣ＡＰ停?/p>

另取古拉定2 批，編號13～14 和泰特2 批，編號15～16 的光譜信息作為驗證光譜對模型進行專屬性驗證。見圖7～8。

圖7 玻璃模型專屬性驗證結(jié)果

圖8 非玻璃模型專屬性驗證結(jié)果

取古拉定3 批，采用隔玻璃瓶底測方式，分別用甲、乙兩臺儀器采集近紅外光譜，對玻璃模型進行耐用性驗證。見圖9。

圖9 玻璃模型耐用性驗證

3 討論

采用近紅外光譜分析法鑒定進口藥品注射用還原型谷胱甘肽鈉的近紅外漫反射光譜，在OPUS光譜分析軟件的Setup Conformity Test 建模模塊中，建立Pharminvest SPA 廠家的注射用還原型谷胱甘肽鈉合格性測試模型，計算每個波長點吸收度平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差，將吸收度平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差5 倍作為專屬性波長點的可信區(qū)間（即CI 限度=5），然后根據(jù)待測樣品光譜CI 值是否超出CI 限度定性真假。

依照國家基本藥物和進口藥物近紅外光譜快速比對模型建模技術(shù)規(guī)范，建立一致性檢驗?zāi)Ｐ停瑓⒖紭悠窇?yīng)至少3～6 批次，參考光譜的數(shù)量應(yīng)至少30 張，方能有較好的代表性[11]。本研究課題實驗選用了12 批次作為參考光譜的測定，共測定有144 張光譜，實驗按照規(guī)范要求進行操作。

從圖1～2 可見，不同儀器采集樣品的光譜信息有所差異，因為光譜測定時候受影響因素有較多，如儀器噪音、環(huán)境溫度、樣品韓數(shù)量等均會影響樣品吸光值的變化。因此，每一次的采集譜圖都可能發(fā)生漂移等變化，經(jīng)過預(yù)處理后，基線漂移可被消除，不影響樣品的建模。從圖5～6 可見，12 批古拉定所得參考光譜建立一致性檢驗?zāi)Ｐ蜁r，參考光譜最大CI 值均在模型設(shè)定CI 限度為6 范圍內(nèi)。

模型專屬性通常用已知樣品的鑒別正確率表示，不僅需要驗證真品的鑒別正確率，還需要用別的廠家相同品種樣品進行挑戰(zhàn)驗證，證明模型能區(qū)分出不同廠家樣品[12-13]。從圖7可見，隔玻璃瓶底測得12 批古拉定所得參考光譜建立的快速比對模型進行專屬性驗證時，同一廠家的古拉定樣品光譜最大CI 值均在設(shè)定CI 限度6 范圍以內(nèi)，而不同廠家的泰特樣品光譜則全部在設(shè)定CI 限度6 范圍外，結(jié)果顯示，該快速比對模型專屬性可行。從圖8可見，直接接觸測得12 批古拉定所得參考光譜建立的快速比對模型進行專屬性驗證時，同一廠家的古拉定樣品光譜與不同廠家的泰特樣品光譜最大CI 值都在設(shè)定CI 限度6 范圍內(nèi)，無法區(qū)分出不同廠家的樣品，結(jié)果顯示，該快速比對模型專屬性不可行。

模型的耐用性系指在不改變模型參數(shù)的情況下，考查正常操作中的微小變化對模型預(yù)測結(jié)果的影響。從圖9可見，不同儀器隔玻璃瓶底測試法采集的古拉定光譜信息，其最大CI 值均在設(shè)定CI 限度6 范圍內(nèi)，結(jié)果顯示，該快速比對模型耐用性可行。

近紅外一致性檢驗?zāi)Ｐ徒ｎA(yù)處理方法有矢量歸一化、一階導(dǎo)數(shù)化、一階導(dǎo)數(shù)化+矢量歸一化、二階導(dǎo)數(shù)化和二階導(dǎo)數(shù)化+矢量歸一化[14-15]。將各預(yù)處理方法處理后所建模型進行比較，一階導(dǎo)數(shù)化+矢量歸一化預(yù)處理所得古拉定樣品光譜CI值與泰特樣品光譜CI 值相差較大，更顯現(xiàn)模型的專屬性，見圖7。矢量歸一化處理所得泰特樣品光譜CI 值在CI 限度6 附近，與古拉定樣品光譜最大CI 值的差值較小，容易造成混淆，見圖10。一階導(dǎo)數(shù)化處理所得泰特樣品光譜CI 值基本在CI 限度6 以內(nèi)，容易與參考光譜混淆，見圖11。二階導(dǎo)數(shù)化和二階導(dǎo)數(shù)+矢量歸一化預(yù)處理所得古拉定和泰特的樣品的信息點較分散，不能區(qū)分開兩個廠家樣品，見圖12～13。實驗證明，建模時采用一階導(dǎo)數(shù)+矢量歸一化預(yù)處理方法優(yōu)于其他方法。

圖10 矢量歸一化模型

圖11 一階導(dǎo)數(shù)化模型

圖12 二階導(dǎo)數(shù)化模型

圖13 二階導(dǎo)數(shù)+矢量歸一化模型

實驗中每一次實驗前均進行儀器自檢的校驗，信噪比、100%透射線偏差、干涉圖高峰最大允許值的能量測試，水蒸汽、聚苯乙烯樣品材料在特定峰位最大允許偏差的X 軸頻率校準(zhǔn)測試，A、B 濾光片最大允許偏差的Y 軸重現(xiàn)性測試均合格。

建模的專屬性與建模樣品的代表性密切相關(guān)，同一品種兩個廠家生產(chǎn)的工藝及輔料差異會造成光譜的細微變化。從圖6～7 可見，可能由于原料藥相同，輔料差異不大，從而使直接接觸測試法所建立的快速比對模型無法區(qū)分出兩個廠家；而使用隔玻璃瓶底測試法時，由于廠家生產(chǎn)工藝存在較明顯差異以及外包材工藝的不同從而使隔玻璃瓶底法所建立的快速比對模型能夠很好地區(qū)分出兩個廠家樣品。

4 結(jié)論

本研究結(jié)合藥品檢驗車現(xiàn)場快篩打假特點，采用隔玻璃瓶底測樣方式建立進口藥品“注射用還原型谷胱甘肽鈉”快速比對模型具有綠色、無污染、不損壞產(chǎn)品包裝、快速等優(yōu)點，該方法專屬性較好，耐用性可行，可應(yīng)用于藥品快檢車現(xiàn)場快篩打假。