劉婧妮,王軟林,梁愛華

(山西大學(xué) 生物技術(shù)研究所,化學(xué)生物學(xué)與分子工程教育部重點實驗室,山西 太原 030006)

0 引言

組織蛋白酶B(Cathepsin B,CTSB)是一類木瓜蛋白酶類半胱氨酸蛋白水解酶[1],廣泛存在于從病毒到哺乳動物和人等生物體內(nèi)。CTSB 的合成與其他蛋白酶相似[2],首先由糙面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的核糖體合成無活性的前體酶原,隨后信號肽在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中被水解掉,形成只含前體肽和催化結(jié)構(gòu)域的酶原;接著酶原經(jīng)過糖基化和磷酸化等修飾,與高爾基體上的甘露糖-6-磷酸受體結(jié)合,包裹在分泌小泡中轉(zhuǎn)移至溶酶體;在溶酶體的酸性環(huán)境下,前體肽在自身或其他酶的催化作用下被水解,從而形成有活性的成熟 CTSB。

CTSB 的催化作用由天冬酰胺殘基、半胱氨酸殘基以及組氨酸殘基組成的活性中心實現(xiàn),除了內(nèi)肽酶活性外,大部分的 CTSB 具有一個約由20個氨基酸組成的封閉環(huán) (occluding loop) 結(jié)構(gòu)[3],這使得 CTSB 具有除肽鏈內(nèi)切酶以外的羧基二肽酶(外肽酶)活性,在封閉環(huán)結(jié)構(gòu)中,有兩個起關(guān)鍵作用的組氨酸殘基,這兩個殘基能夠直接影響組織蛋白酶 B 對酸堿環(huán)境的偏好性[4],如若封閉環(huán)缺失將導(dǎo)致內(nèi)切酶活性上升而外肽酶活性下降,也會增加該酶與大分子抑制劑結(jié)合的能力[5]。此外,CTSB 還具有底物特異性,與組織蛋白酶L(CTSL)相比,CTSB 除可以催化 Z-Phe-Arg-AMC 底物的水解外,還可以催化 Z-Arg-Arg-AMC 底物的水解[6-7],這與 C 端 S2 domain 特殊氨基酸組成密切相關(guān)[8]。在高等真核生物的 CTSB 中,該位點為酸性氨基酸,能夠催化 Z-Arg-Arg-AMC 和 Z-Phe-Arg-AMC 兩種底物的水解。

目前關(guān)于 CTSB 的研究主要集中在抗寄生蟲藥物研發(fā)及癌癥治療[9]等方面。CTSB 除具有蛋白水解功能外,有研究已證明 CTSB 在寄生蟲的免疫逃避[10]、營養(yǎng)攝取、包囊的形成和脫包囊等過程中也發(fā)揮著重要的作用。在大量寄生蟲病的治療中,CTSB 也被證實可以作為寄生蟲病藥物治療的候選疫苗[11-12]。CTSB 還參與腫瘤的發(fā)生、血管生成、侵襲及轉(zhuǎn)移等過程,被用作檢測腫瘤惡性程度的標(biāo)志物[13-14]。此外,CTSB 還參與寄生蟲體內(nèi)卵細(xì)胞的成熟過程中,它可以參與卵黃蛋白的水解[15],導(dǎo)致胚胎存活率下降。

八肋游仆蟲(Euplotesoctocarinatus)是一種淡水纖毛蟲,具有一個營養(yǎng)大核和一個生殖小核,其大核基因組高度片段化[16]。八肋游仆蟲在蛋白質(zhì)翻譯水平上,存在著特殊的編程性核糖體移碼現(xiàn)象[17-19],在遺傳密碼子的使用上,UGA 不是作為終止密碼子而是重新編碼為半胱氨酸,UAA 和UAG 作為終止密碼子[20]。實驗室前期通過對八肋游仆蟲組織蛋白酶 B (EuplotesoctocarinatusCathepsinB,EoCTSB) 基因家族的分析,得到了6條可以編碼EoCTSB的基因,且根據(jù)其與人CTSB基因相似性從低到高依次命名為EoCTSB-1、EoCTSB-2、EoCTSB-3、EoCTSB-4、EoCTSB-5、EoCTSB-6。本文選取EoCTSB-1進(jìn)行表達(dá)純化及其性質(zhì)的研究,為進(jìn)一步探討八肋游仆蟲中 6 個 EoCTSB 在細(xì)胞中的水解作用及其他功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料及主要生化試劑

八肋游仆蟲由本課題組培養(yǎng);大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞E.coliDH5α和E.coliBL21由本實驗室制備保存;PCR引物由上海生工生物公司合成,DNA序列測定由華大基因公司完成;TaqDNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶、質(zhì)粒抽提試劑盒、DNA膠回收試劑均購自TaKaRa公司;EasyScript?First-Strand cDNA Synthesis SuperMix試劑盒購自北京全式金公司;His親和層析柱材料購于GE Healthcare公司;Anti-His抗體購于上海生工生物公司;熒光合成肽底物 N-芐氧羰基L苯丙氨酸L精氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素(Z-Phe-Arg-AMC)購于peptide公司;其他生化試劑均購于山西鯤鵬公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 數(shù)據(jù)來源

EoCTSB-1的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)由本實驗室前期測得,嗜熱四膜蟲的數(shù)據(jù)下載自http:∥ciliate.org/index.php/home/welcome,人、小鼠及斑馬魚的CTSB序列分別下載自GenBank No:NP001899、No:AH001867.2、No:NP998501。

1.2.2 序列分析

利用MegAlign 程序中 Clustal W 算法對 EoCTSB-1 與其他生物 CTSB 的氨基酸序列進(jìn)行比對;利用DNAStar軟件包中的 SeqBuilder 程序?qū)oCTSB-1進(jìn)行氨基酸翻譯,利用在線軟件ExPASy (http:∥web.expasy.org/compute-pi/) 對EoCTSB-1 的理論等電點及分子量進(jìn)行分析。

表1 實驗所用引物序列

1.2.3 八肋游仆蟲基因組 DNA 的提取及 cDNA 的合成

饑餓處理生長良好的八肋游仆蟲5～7 d,然后室溫下4 000 r/min離心5 min收集細(xì)胞,利用酚-氯仿法提取基因組DNA。利用miRNeasy Mini Kit (50)提取八肋游仆蟲總RNA,隨后利用EasyScript?First-Strand cDNA Synthesis SuperMix試劑盒合成cDNA的第一條鏈,并于-40℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4EoCTSB-1基因的克隆

根據(jù)八肋游仆蟲基因組及轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析得到EoCTSB-1序列,設(shè)計引物CTSB-1-F1、CTSB-1-R1,CTSB-1-F2、CTSB-1-R2(表1),分別以八肋游仆蟲基因組和cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,利用質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物?；厥誔CR產(chǎn)物,將其與pMD18-T過夜連接,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞中,過夜培養(yǎng)后,挑取單菌落于5 ml LB培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng),提取質(zhì)粒pMD18-T-EoCTSB-1,并測序。

1.2.5 重組質(zhì)粒 pET-30a-EoCTSB-1 的構(gòu)建

將測序正確的重組質(zhì)粒pMD18-T-EoCTSB-1作為模板,利用特異性引物CTSB-1-F2、CTSB-1-R2進(jìn)行PCR擴(kuò)增,膠回收產(chǎn)物和載體pET-30a經(jīng)EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切。酶切產(chǎn)物回收后經(jīng)T4連接酶連接,轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài),第二日裂菌篩選陽性克隆,提取重組質(zhì)粒pET-30a-EoCTSB-1,酶切鑒定后送測序。

1.2.6 EoCTSB-1 蛋白的表達(dá)和純化

將構(gòu)建成功的重組表達(dá)質(zhì)粒pET-30a-EoCTSB-1轉(zhuǎn)化至E.coliBL21 感受態(tài)細(xì)胞中,于37℃培養(yǎng)箱中倒置過夜培養(yǎng)。首先進(jìn)行小量誘導(dǎo)表達(dá),從轉(zhuǎn)化的平板挑單克隆到5 mL含相應(yīng)抗性的LB液體培養(yǎng)基中,37℃培養(yǎng),培養(yǎng)至OD=0.6-0.8,IPTG(0.5 mmol·L-1)誘導(dǎo),37℃培養(yǎng)4 h，取1 mL誘導(dǎo)的菌液,12 000 r/mim,離心 1 min,超聲破碎,分別取上清和沉淀(沉淀用50～100 μL 10 mmol·L-1Tris-HCl(pH 8.0)溶液吹散)加入與緩沖液等體積的2×loading buffer,100℃煮5 min,電泳檢測。

小量表達(dá)的結(jié)果顯示蛋白表達(dá)形式為包涵體,采用蛋白變復(fù)性方法獲得可溶性蛋白。根據(jù)小量表達(dá)的最優(yōu)條件,進(jìn)行 EoCTSB-1蛋白的大量表達(dá)。8 000 r/min,離心6 min 收菌,棄上清。菌體用20～30 mL 10 mmol·L-1Tris-HCl(pH 8.0)溶液吹散,超聲波破碎(500 W, 180次,每次5 s,間隔5 s)。13 000 r/min,離心20 min,棄去上清,沉淀用50 μL 10 mmol·L-1Tris-HCl(pH 8.0)溶液吹散。然后經(jīng)過Ni柱純化,用10 mmol·L-1Tris-HCl(pH 8.0)溶液平衡鎳柱,約100 mL,再用含8 mol·L-1尿素、0.5 mol·L-1氯化鈉的 10 mmol·L-1Tris-HCl(pH 8.0)溶液平衡鎳柱,約50 mL。然后上樣,上樣結(jié)束后,用含 8 mol·L-1尿素、0.5 mol·L-1氯化鈉的10 mmol·L-1Tris-HCl(pH 8.0)溶液洗柱。最后分別用含15 mmol·L-1咪唑、60 mmol·L-1咪唑、500 mmol·L-1咪唑的10 mmol·L-1Tris-HCl(pH 8.0)(含8 mol·L-1尿素、0.5 mol·L-1氯化鈉)溶液洗脫,分別收集蛋白。最后利用western blot檢測。

1.2.7 溫度對 EoCTSB-1 活性的影響

1.2.7.1 最適反應(yīng)溫度的測定

以Z-Phe-Arg-AMC為底物,在pH 5.5的條件下,測定EoCTSB-1酶液在20℃～80℃的肽水解活性,每5℃為一個間隔,反應(yīng)時間為10 min。

1.2.7.2 熱穩(wěn)定性的測定

將EoCTSB-1酶液放置在pH 5.5的條件下,在20℃～80℃的溫度范圍內(nèi),每5℃為一個間隔,放置60 min。然后用冰水冷卻至4℃。以Z-Phe-Arg-AMC為底物,在pH 5.5的條件下,測定肽水解活性,反應(yīng)時間為 10 min。實驗重復(fù)3次。

1.2.8 pH 對 EoCTSB-1 活性的影響

pH范圍:用0.2 mol·L-1Na2HPO4和 0.1 mol·L-1檸檬酸配成pH值為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0的反應(yīng)緩沖液。實驗重復(fù)3次。

1.2.8.1 最適pH的測定

以ZPhe-Arg-AMC為底物,在37℃下,測定EoCTSB-1酶液在不同反應(yīng)pH條件下的肽水解活性,反應(yīng)時間為10 min。實驗重復(fù)3次。

1.2.8.2 pH穩(wěn)定性的測定

將 EoCTSB-1 酶液在 20℃,3.0～8.0的不同pH范圍內(nèi),每0.5個pH單位為一個間隔,放置60 min,然后將pH調(diào)回至反應(yīng)pH,pH為5.5,以Z-Phe-Arg-AMC為底物,測定肽水解活性,反應(yīng)時間為 10 min。實驗重復(fù)3次。

2 結(jié)果分析

2.1 八肋游仆蟲EoCTSB-1基因的克隆與序列分析

分別利用特異性端粒引物CTSB-1-F1/R1和ORF引物CTSB-1-F2/R2(見表1),分別以基因組和cDNA為模板擴(kuò)增EoCTSB-1的全長及ORF區(qū)。序列分析顯示EoCTSB-1全長為980 bp,5′-Leader 區(qū)長31 bp,3′-Trailer 區(qū)長23 bp,ORF區(qū)為862 bp,無內(nèi)含子,該基因在翻譯過程中需要一次+1編程性移碼[17],EoCTSB-1基因所編碼蛋白產(chǎn)物的氨基酸數(shù)目為286個,分子量為32 570.66 D,理論等電點為6.22。

2.2 EoCTSB-1的氨基酸序列分析

利用DNAStar 軟件中的 MegAlign 程序?qū)oCTSB-1及其他生物的CTSB進(jìn)行氨基酸序列比對,結(jié)果顯示(圖1),EoCTSB-1在進(jìn)化上既具有保守性,也具有特殊性。

EoCTSB-1具有保守的催化三聯(lián)體結(jié)構(gòu)(天冬酰胺殘基N、半胱氨酸殘基C以及組氨酸殘基H),也具有前體肽結(jié)構(gòu),前體肽因其在空間結(jié)構(gòu)會對催化活性中心有覆蓋,降低底物和酶的結(jié)合能力,所以也被稱作組織蛋白酶的內(nèi)源抑制劑。在酸性條件下,前體酶原會發(fā)生自剪切,形成有活性的成熟蛋白。

EoCTSB-1的特殊性表現(xiàn)在不具有信號肽、封閉環(huán)結(jié)構(gòu)及不能催化特異底物三個方面。信號肽的缺失推測EoCTSB-1不是分泌型蛋白,而是在胞內(nèi)發(fā)揮催化功能。封閉環(huán)是CTSB催化活性部位一段額外的肽段,完整的封閉環(huán)結(jié)構(gòu)由上下游兩個保守的半胱氨酸和兩個關(guān)鍵的組氨酸殘基組成,序列比對結(jié)果顯示,在人、斑馬魚、小鼠和四膜蟲的CTSB中均具有完整的封閉環(huán)結(jié)構(gòu),EoCTSB-1缺失該結(jié)構(gòu),將導(dǎo)致外肽酶活性的消失。CTSB催化特異性底物的能力與S2 domain的特殊位點氨基酸有關(guān),氨基酸序列比對結(jié)果顯示,EoCTSB-1和四膜蟲在S2 domain的特殊位點的氨基酸為中性氨基酸,推測它們均不具有催化特異性底物Z-Arg-Arg-AMC的能力。

Three highly conserved CTSB active sites are indicated by red shadow.The signal peptide region is indicated by red shadow.The propeptite is showed by blue box. The occluding loop region is showed by yellow box,the histidine residues critical are indicated by the arrows. The S2 domain is indicated by green box,with the critical substrate specificity residue indicated by a filled arrow.Fig.1 Sequence alignment of CTSB fromEuplotes octocarinatusCTSB-1 with those from other organisms紅色陰影表示三個保守的活性位點;紅色框表示信號肽;藍(lán)色框表示前體肽;黃色框表示封閉環(huán);綠色框表示S2區(qū)域;黑色箭頭表示關(guān)鍵性殘基。圖1 八肋游仆蟲組織蛋白酶B-1與其他物種的CTSB 氨基酸序列比較

2.3 重組表達(dá)質(zhì)粒pET-30a-EoCTSB-1的構(gòu)建與EoCTSB-1蛋白的表達(dá)純化

重組表達(dá)質(zhì)粒pET-30a-EoCTSB-1經(jīng)雙酶切和測序鑒定構(gòu)建成功(圖2A),將構(gòu)建成功的重組表達(dá)質(zhì)粒pET-30a-EoCTSB-1轉(zhuǎn)入感受態(tài)E.coliBL21中,進(jìn)行小量試表達(dá)。結(jié)果顯示在37℃誘導(dǎo)后的全菌中,出現(xiàn)新增蛋白條帶且分子量約42 kD,這與預(yù)測融合蛋白的大小一致,在未加IPTG的全菌中沒有此條帶,分別對誘導(dǎo)后全菌的沉淀和上清提取物分析,結(jié)果顯示新增蛋白條帶在沉淀中出現(xiàn),上清則檢測不到,利用His-Tag抗體進(jìn)行western blot檢測,也表明該蛋白表達(dá)形式主要為包涵體(圖2B)。之后大量表達(dá)目的蛋白,利用Ni柱親核層析純化目的蛋白(圖2C),將500 mmol·L-1咪唑洗脫得到的變性蛋白,利用尿素濃度逐漸降低的緩沖液過夜透析,使蛋白逐漸復(fù)性,最后利用30 kD的濃縮管將目的蛋白濃縮。Western印跡分析表明,濃縮后可溶性EoCTSB-1蛋白可與Anti-His抗體產(chǎn)生特異性的反應(yīng)(圖2D),表明通過變復(fù)性獲得了可溶的 EoCTSB-1。

(A)Construction of recombinant plasmid pET-30a-EoCTSB-1 lane M:Trans2KTMPlusⅡ DNA Marker,lane1: Recombinant plasmid pET-30a-EoCTSB-1, lane2: Recombinant plasmid pET-30a-EoCTSB-1 was digested byEcoRⅠ andXhoⅠ. (B) Western Blotting was used to detect the expression of EoCTSB-1 protein;(C) Mass purification of EoCTSB-1,lane M: Marker, lane1 and 2: whole cell extract and supernatantprotein fraction ofE.coilpost IPTG induction; lane 3-4:15 mmol·L-1imidazole elution, lane 5-6:60 mmol·L-1imidazole elution, lane7-9:500 mmol·L-1imidazole elution;(D) Western Blotting detects the concentrated EoCTSB-1 protein.Fig.2 Construction of recombinant plasmid pET-30a-EoCTSB-1 and expression and purification of EoCTSB-1(A) 重組表達(dá)質(zhì)粒pET30aEoCTSB-1的構(gòu)建,lane M:Trans2KTMPlusⅡ DNA Marker,lane1:重組質(zhì)粒pET-30a-EoCTSB-1,lane2:重組質(zhì)粒pET-30a-EoCTSB-1經(jīng)EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切;(B) Western Blotting 檢測 EoCTSB-1 蛋白的表達(dá);(C) EoCTSB-1的大量純化,lane M:Marker,lane1:蛋白原樣,lane2:IPTG誘導(dǎo)后上清,lane3-4:15 mmol·L-1咪唑洗脫,lane5-6:60 mmol·L-1咪唑洗脫,lane7-9:500 mmol·L-1咪唑洗脫;(D) Western Blotting檢測濃縮后的EoCTSB-1蛋白。圖2 重組質(zhì)粒pET-30a-EoCTSB-1構(gòu)建及EoCTSB-1蛋白的表達(dá)與純化

2.4 溫度對 EoCTSB-1 活性的影響

對EoCTSB-1的最適反應(yīng)溫度及熱穩(wěn)定性進(jìn)行測定,從圖3A中可以看出EoCTSB-1的最適反應(yīng)溫度為35℃。從圖3B中可以看出,EoCTSB-1在40℃放置1 h后,只殘留18%的活性。

Fig.3 (A) Profile of temperature-dependent of EoCTSB-1; (B) Profile of thermal stability of EoCTSB-1圖3 (A) EoCTSB-1的最適反應(yīng)溫度;(B) EoCTSB-1的熱穩(wěn)定性

2.5 pH 對 EoCTSB-1 活性的影響

對 EoCTSB-1 的最適反應(yīng) pH 及 pH 的穩(wěn)定性進(jìn)行測定,從圖 4A 中可以得出 EoCTSB-1 的最適反應(yīng) pH 為 5.0。從圖 4B 中可以得出,EoCTSB-1 在 pH 為 3.5 的緩沖液中放置1 h后,仍保持 85% 的活性,隨著緩沖液 pH 的增加,酶活明顯的下降,但EoCTSB-1在 pH 為 7.0 的緩沖液中處理1 h后,仍有 30% 的活性。

Fig.4 (A) Profile of pH-dependent of EoCTSB-1;(B) Profile of pH stability of EoCTSB-1圖4 (A) EoCTSB-1的最適反應(yīng)pH;(B)EoCTSB-1的pH穩(wěn)定性

3 討論

近年來,關(guān)于CTSB的報道主要集中于寄生蟲病和人腫瘤細(xì)胞的治療中,在其他生物中的研究較少。實驗室前期對八肋游仆蟲進(jìn)行了基因組和轉(zhuǎn)錄組測序,通過分析,我們在八肋游仆蟲數(shù)據(jù)庫中找到6條可以編碼EoCTSB的基因,而在高等真核生物和人體內(nèi),CTSB基因只有1條。為了進(jìn)一步探討纖毛蟲中組織蛋白酶B的功能,本文選取EoCTSB-1進(jìn)行進(jìn)一步研究,首先擴(kuò)增得到EoCTSB-1基因的全長序列,并對由其核酸序列推導(dǎo)出的氨基酸序列進(jìn)行了分析,與其他真核生物的CTSB的氨基酸序列比對結(jié)果顯示,EoCTSB-1含有保守的催化活性位點和前體肽結(jié)構(gòu),但缺乏信號肽結(jié)構(gòu),推測其不是分泌型蛋白,細(xì)胞內(nèi)的具體功能還需進(jìn)一步的研究。此外,EoCTSB-1還缺乏完整的封閉環(huán)結(jié)構(gòu),即沒有外肽酶活性,通過查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)在一些藻類、寄生蟲和原生動物中,封閉環(huán)結(jié)構(gòu)也發(fā)生了不同程度的變化,包括氨基酸或小肽片段的插入、大片段的刪減以及完全缺失[21],所以此現(xiàn)象并不是八肋游仆蟲所特有的。有文獻(xiàn)報道,封閉環(huán)的缺失雖然消除了外肽酶活性,但不影響內(nèi)肽酶活性,且對其有促進(jìn)作用[22]。

在序列分析基礎(chǔ)上,本研究對EoCTSB-1蛋白進(jìn)行了表達(dá)和純化,在SDS-PAGE中顯示純化的蛋白大小約為42 kD,比前期預(yù)測的組織蛋白酶B分子量32 kD大了10 kD左右,這是因為pET-30a載體在N端除具有His標(biāo)簽外,還具大小約8 kD的N-Thrombin標(biāo)簽。小量預(yù)表達(dá)結(jié)果顯示蛋白表達(dá)形式主要為包涵體,我們通過變復(fù)性的方法獲得了可溶性蛋白,然后對其酶活性質(zhì)進(jìn)行了研究。結(jié)果分析顯示,EoCTSB-1的最適溫度是35℃,最適pH為5.0,與其他報道的CTSB的最適酶活一致[23]。與利用酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)純化的蛋白熱穩(wěn)定性[24]相比,EoCTSB-1熱穩(wěn)定性較差,推測EoCTSB-1熱穩(wěn)定性較差可能與它在大腸桿菌中表達(dá)不能被糖基化有關(guān)。EoCTSB-1的pH穩(wěn)定性測定結(jié)果顯示,在pH 7.0的緩沖液處理1 h后,仍具有30%的活性,這與其他生物CTSB的報道是一致的[25]。分析EoCTSB-1的氨基酸序列,找到序列中存在3個可能的糖基化位點,下一步可嘗試在酵母中表達(dá)EoCTSB-1,從而通過糖基化提高該蛋白的熱穩(wěn)定性以便開展更多的性質(zhì)研究?？傊?本研究為我們后續(xù)對其他5條EoCTSB基因的研究提供了實驗數(shù)據(jù),對下一步制備特異性抗體開展CTSB在八肋游仆蟲中功能的研究奠定基礎(chǔ)。