朱彥濤,張志剛

(山西大學(xué) 分子科學(xué)研究所,化學(xué)生物學(xué)與分子工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山西 太原 030006)

0 引言

以納米粒子載運(yùn)抗癌藥物正成為化學(xué)、醫(yī)學(xué)及材料科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn),受到了人們的廣泛關(guān)注[1-2]。當(dāng)納米粒子用于載運(yùn)抗癌藥物時(shí),可使藥物避免被人體網(wǎng)狀內(nèi)皮組織體系清除,從而延長藥物在血液中的循環(huán)時(shí)間,還可使藥物更易進(jìn)入腫瘤組織的毛細(xì)血管中,從而使藥物更高效地分布于腫瘤細(xì)胞中,為此已發(fā)展出了各種各樣的納米粒子載藥體系,如金納米粒子、聚合物納米粒子等等[3-4]。在這些眾多的納米粒子載藥體系中,氨基硅烷修飾的Fe3O4@SiO2磁性復(fù)合納米粒子因具有良好生物相容性且其表面可通過氨基偶聯(lián)各種靶向分子,引起了各國研究者的廣泛興趣[5]。目前這類復(fù)合納米粒子已被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域,如蛋白質(zhì)固定、DNA純化、磁共振成像中的細(xì)胞標(biāo)記等方面[6-8]。包裹熒光體的氨基硅烷修飾的Fe3O4@SiO2磁性復(fù)合納米粒子用于抗癌藥物的載體時(shí),將會(huì)使其具有實(shí)時(shí)可追蹤的特性,有利于腫瘤的診斷和治療,因而具有重要的應(yīng)用前景,但目前尚未見到包裹熒光體的氨基硅烷修飾的Fe3O4@SiO2磁性復(fù)合納米粒子的報(bào)道。本文合成了一種新的包裹熒光體羅丹明6G的氨基硅烷修飾的熒光磁性復(fù)合納米粒子,并對(duì)影響復(fù)合納米粒子的粒徑因素進(jìn)行了初步探索。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料

正硅酸乙酯(TEOS),國藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司;3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES),國藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司;四甲基氫氧化銨(TMAH),阿拉丁試劑公司;羅丹明6G (R6G),西亞試劑公司;其他試劑均為分析純。

1.2 Fe3O4磁性納米粒子的合成

根據(jù)文獻(xiàn)方法[9]以共沉淀法制備Fe3O4磁性納米粒子。具體步驟如下:將0.65 g FeSO4·7H2O 和1.255 g FeC13·6H2O溶于40 mL蒸餾水中,攪拌并恒溫30℃的條件下,通入氮?dú)獬?。在持續(xù)通入氮?dú)夂蛿嚢杓訜釛l件下向反應(yīng)體系中滴加5 mL濃氨水(質(zhì)量分?jǐn)?shù)25%),調(diào)節(jié)溶液pH=10,體系中逐漸有黑色沉淀生成。繼續(xù)反應(yīng)10 min后,將反應(yīng)混合物于室溫下靜置片刻。以稀氨水、蒸餾水磁分離洗滌黑色固體數(shù)次后,得到產(chǎn)物Fe3O4磁性納米粒子。

1.3 包裹有R6G的熒光磁性復(fù)合納米粒子的合成

稱取0.12 g羅丹明6G與2 mL APTES混合,加入5 mL乙醇使其全部溶解,避光放置18 h。將0.8 g新合成的Fe3O4分散于20 mL乙醇中,滴加濃氨水(質(zhì)量分?jǐn)?shù)25%)調(diào)節(jié)溶液至pH=9,超聲分散15 min。在持續(xù)攪拌下將R6G、APTES和乙醇的混合溶液逐滴加入上述體系,攪拌1 h后,將適量TEOS、TMAH及5 mL乙醇的混合溶液緩慢滴加入反應(yīng)體系,室溫反應(yīng)24 h后通過磁分離得到沉淀,以乙醇、少量蒸餾水交替洗滌數(shù)次后50℃烘干,得到熒光磁性復(fù)合納米粒子(Fe3O4/R6G)@SiO2。將不同反應(yīng)條件下合成的產(chǎn)物分別標(biāo)記為1a、1b、1c(見表1)。

1.4 氨基硅烷修飾的熒光磁性復(fù)合納米粒子的合成

稱取300 mg (Fe3O4/R6G)@SiO2分散于60 mL乙醇中,超聲分散30 min。量取200 μL APTES加入2.3 mL乙醇,靜置5 min后滴加到前述混合物中,以濃氨水(質(zhì)量分?jǐn)?shù)25%)調(diào)節(jié)體系pH=8。50℃水浴中持續(xù)攪拌下反應(yīng)5 h后,磁分離得到沉淀物,并分別以蒸餾水和乙醇洗滌數(shù)次,再置于烘箱50℃烘干,得到包裹有R6G且經(jīng)氨基硅烷修飾的熒光磁性復(fù)合納米粒子 (Fe3O4/R6G)@SiO2-APTES。

1.5 氨基硅烷修飾的熒光磁性復(fù)合納米粒子對(duì)pBR322 DNA損傷情況的研究

利用瓊脂糖凝膠電泳法研究了(Fe3O4/R6G)@SiO2-APTES對(duì)pBR322 DNA的損傷情況。如果復(fù)合納米粒子對(duì)DNA造成損傷,DNA的空間構(gòu)型將可由共價(jià)閉環(huán)(ccc)轉(zhuǎn)變?yōu)殚_環(huán)(oc)甚至線性(Linear)構(gòu)型,而這三種構(gòu)型的DNA在電場中的遷移速率不同,因此可通過凝膠電泳法了解復(fù)合納米粒子對(duì)DNA的損傷情況。具體步驟如下:

將24.2 g Tris-base、5.71 mL冰醋酸和40 mL EDTA (0.125 mol·L-1)水溶液混合于100 mL燒杯中,再加入40 mL滅菌蒸餾水充分溶解后轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶,并以滅菌蒸餾水定容,得到TAE電泳液,將之搖勻后轉(zhuǎn)移至試劑瓶內(nèi)保存,用時(shí)稀釋50倍。

將0.121 g Tris-base、0.036 g NaCl 溶于80 mL滅菌蒸餾水中,以鹽酸調(diào)節(jié)溶液pH值為7.26,并以滅菌蒸餾水定容于100 mL容量瓶,得到實(shí)驗(yàn)所需的緩沖液。

稱取1.5 mg熒光磁性復(fù)合納米粒子超聲分散于1 mL DMF中,按照實(shí)驗(yàn)需求以緩沖液稀釋成一系列不同濃度的復(fù)合納米粒子分散液,并將適量pBR322 DNA (0.5 μg/μL)以緩沖液稀釋8倍。向每個(gè)EP管中分別加入3 μL pBR322 DNA稀釋液,再分別加入7 μL不同濃度的復(fù)合納米粒子分散液。將各管混合液吹打均勻后,37℃水浴恒溫平衡30 min。再向每個(gè)EP管中分別加入2 μL 6×Glycerol Gel Loading Dye I (BPB),混合均勻后上樣于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.8%的瓊脂糖凝膠上。

在稀釋50倍的TAE電泳液中,保持電壓65 V,電泳1 h,于凝膠成像系統(tǒng)下拍照得到凝膠電泳圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 復(fù)合納米粒子的合成與表征

2.1.1 不同實(shí)驗(yàn)條件對(duì)復(fù)合納米粒子粒徑的影響

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,粒徑介于50～200 nm的納米粒子最容易被腫瘤細(xì)胞攝入[1],因此了解并控制復(fù)合納米粒子的粒徑對(duì)載藥納米粒子來說顯得非常重要。本文以Zetasizer Nano ZS型激光粒度儀測定了不同實(shí)驗(yàn)條件下合成的包裹有R6G的熒光磁性復(fù)合納米粒子粒徑,其結(jié)果如表1所示。

表1 不同實(shí)驗(yàn)條件下的1a-1c的粒徑

表1中產(chǎn)物1a和1b分別是在其他反應(yīng)條件相同的情況下,添加TMAH和不添加TMAH時(shí)得到的復(fù)合納米粒子(Fe3O4/R6G)@SiO2,它們?cè)谒械牧椒謩e為342.0 nm 和476.5 nm。由此可見,穩(wěn)定劑TMAH的存在對(duì)納米粒子的粒徑影響顯著,這可能是由于帶正電荷的TMAH更好地防止了復(fù)合納米粒子的聚集、穩(wěn)定了復(fù)合納米粒子并使之分散性增強(qiáng)的緣故。此外,從表1還可看出,TEOS的用量不宜過大,增大TEOS的用量會(huì)使復(fù)合納米粒子的粒徑增大。因此,在制備(Fe3O4/R6G)@SiO2的過程中,產(chǎn)物1b的合成條件最為合適。

2.1.2 紅外譜圖分析

由圖1可見,(Fe3O4/R6G)@SiO2-APTES的紅外光譜中,2 926 cm-1可歸屬為APTES的氨丙基的-CH2-基團(tuán)的振動(dòng)[10],1 564 cm-1可歸屬為APTES上—NH2的彎曲振動(dòng)[11],1 385 cm-1則對(duì)應(yīng)于Si—CH2的剪式振動(dòng)[12]。紅外光譜的數(shù)據(jù)表明,氨基硅烷已成功地修飾到了(Fe3O4/R6G)@SiO2的表面。

2.1.3 (Fe3O4/R6G)@SiO2-APTES的DLS表征

將少量(Fe3O4/R6G)@SiO2-APTES超聲分散于超純水中得到該樣品分散液,以Zetasizer Nano ZS型激光粒度儀測得其ζ電位為20.0 mV,見圖2。結(jié)果表明該熒光磁性復(fù)合納米粒子表面帶正電荷,進(jìn)一步證實(shí)氨基硅烷已成功修飾于(Fe3O4/R6G)@SiO2表面。

Fig.1 IR spectra: (a) (Fe3O4/R6G)@SiO2(1b),(b) (Fe3O4/R6G)@SiO2-APTES圖1 紅外光譜:(a) (Fe3O4/R6G)@SiO2(1b),(b) (Fe3O4/R6G)@SiO2-APTES

Fig.2 Zeta potential of (Fe3O4/R6G)@SiO2-APTES圖2 (Fe3O4/R6G)@SiO2-APTES的Zeta電位

此外,還經(jīng)DLS測定得知(Fe3O4/R6G)@SiO2-APTES的水合粒徑為255.0 nm,相比于未被氨基硅烷修飾的(Fe3O4/R6G)@SiO2(1b)的水合粒徑(342.0 nm),其粒徑明顯減小,這可能也是由于氨基硅烷修飾的(Fe3O4/R6G)@SiO2表面帶有正電荷,因靜電排斥作用的存在減少了復(fù)合納米粒子的團(tuán)聚,從而穩(wěn)定了復(fù)合納米粒子的緣故。

2.1.4 熒光譜圖

(a) (Fe3O4/R6G)@SiO2, (b) (Fe3O4/R6G)@SiO2-APTES dispersed in water (the concentration was 0.67 mg·mL-1)Fig.3 Fluorescence spectra(a)(Fe3O4/R6G)@SiO2,(b) (Fe3O4/R6G)@SiO2-APTES(濃度均為0.67 mg·mL-1)圖3 熒光譜圖

分別將適量(Fe3O4/R6G)@SiO2和(Fe3O4/R6G)@SiO2-APTES超聲分散于蒸餾水中,得到濃度為0.67 mg·mL-1的樣品分散液,將上述兩種分散液分別置于FluoroMax-4熒光光度計(jì),固定激發(fā)波長480 nm進(jìn)行譜圖掃描,掃描波長范圍為500～600 nm。由圖3可知,上述兩種復(fù)合納米粒子均在最大發(fā)射峰位于547 nm處出現(xiàn)較強(qiáng)的熒光發(fā)射峰,這與文獻(xiàn)中報(bào)道的R6G在水中的熒光發(fā)射峰位置一致[13],表明熒光染料R6G已被成功地包裹在熒光磁性復(fù)合納米粒子之中。此外,從圖3中亦可看到,(Fe3O4/R6G)@SiO2-APTES的熒光強(qiáng)度明顯弱于(Fe3O4/R6G)@SiO2,這是由于進(jìn)一步攪拌反應(yīng)會(huì)降低R6G的包裹率所致。

2.2 氨基硅烷修飾的熒光磁性復(fù)合納米粒子對(duì)DNA的損傷情況

Lane 1: 3 μL DNA+7 μL buffer; Lane 2-6: 3 μLDNA+7 μL magnetic nanoparticles(concentration of the dispersion from left to right was 0.2, 0.5, 0.8, 1.2 and 1.5 mg·mL-1, respectively.)Fig.4 Electrophoresis analyses of DNA mixed with different concentrations of (Fe3O4/R6G)@SiO2-APTES1:1:3 μL DNA+7 μL緩沖液;2-6:3 μL DNA+7 μL (Fe3O4/R6G)@SiO2-APTES分散液(分散液濃度從左至右分別為0.2、0.5、0.8、1.2、1.5 mg·mL-1)圖4 熒光磁性復(fù)合納米粒子(Fe3O4/R6G)@SiO2-APTES與DNA作用的凝膠電泳圖

由圖4可知,氨基硅烷修飾的熒光磁性復(fù)合納米粒子(Fe3O4/R6G)@SiO2-APTES幾乎不會(huì)對(duì)pBR322 DNA造成損傷,即使納米粒子的濃度達(dá)到1.5 mg·mL-1時(shí),DNA的ccc泳帶沒有發(fā)生明顯變化。我們以前報(bào)道過檸檬酸修飾的磁性納米復(fù)合粒子(Fe3O4/CA)@SiO2有著很好的生物相容性[9],但當(dāng)納米粒子的濃度達(dá)到0.33 mg·mL-1時(shí),即會(huì)對(duì)DNA造成明顯的損傷,DNA的oc泳帶條紋亮度明顯增強(qiáng),可見本文合成的氨基硅烷修飾的熒光磁性復(fù)合納米粒子要比(Fe3O4/CA)@SiO2具有更好的生物相容性。

3 結(jié)論

本文合成并表征了一種包裹熒光染料羅丹明6G的氨基硅烷修飾的熒光磁性復(fù)合納米粒子,初步探索了影響這類復(fù)合納米粒子粒徑的因素。這類納米粒子在水中具有很好的分散性和穩(wěn)定性,且有良好的生物相容性,有望成為一種新型抗癌藥物載體,值得進(jìn)行深入研究。

致謝:本工作中所用到的Zetasizer Nano ZS型激光粒度儀由山西大學(xué)大型儀器中心提供。