汪青波,田葉,田艷花,張立偉*

(1.山西大學(xué) 分子科學(xué)研究所 化學(xué)生物學(xué)與分子工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山西 太原 030006;2.山西大學(xué) 中醫(yī)藥現(xiàn)代研究中心,山西 太原 030006)

0 引言

肉制品在加工貯藏過(guò)程中,由于氧氣、微生物等作用,易發(fā)生腐敗和脂肪氧化,甚至?xí)a(chǎn)生有毒物質(zhì)[1]。出于保鮮和儲(chǔ)存需要,香腸中常加入抗氧化劑和防腐劑以延長(zhǎng)其保質(zhì)期。常用的食品添加劑亞硝酸鹽對(duì)肉制品雖具有一定的防腐作用,但其易轉(zhuǎn)化生成對(duì)人體有害的強(qiáng)致癌物質(zhì)N-亞硝胺[2-3];同時(shí),出于安全考慮,合成抗氧化劑(BHT、BHA)等在食品工業(yè)中的應(yīng)用也受到限制。目前,正在研究的天然抗氧化劑主要有茶葉提取物、中草藥提取物、果蔬提取物、香辛料提取物、維生素類物質(zhì)、含氮化合物等,其中茶葉提取物茶多酚在肉類產(chǎn)業(yè)中已得到廣泛應(yīng)用[4]。相對(duì)化學(xué)合成抗氧化劑和防腐劑,天然抗氧化劑和防腐劑的毒性要低很多[5-6]。因此,探索和開(kāi)發(fā)低毒性及高效能的天然抗氧化劑、防腐劑依然是前沿研究的熱點(diǎn)方向,具有重要現(xiàn)實(shí)意義。

連翹為木犀科植物連翹[(Forsythiasuspensa(Thunb.) Vahl)]的干燥果實(shí)[7],傳統(tǒng)以果實(shí)入藥,連翹葉為其干燥葉,《中華本草》記載“連翹莖葉,味苦,性寒,主治心肺積熱”。連翹葉含有豐富的多酚類物質(zhì)[8],主要成分為連翹酯苷A、連翹苷等[9-10]。黃芩為唇形科植物黃芩(ScutellariabaicalensisGeorgi)的干燥根[11],為我國(guó)傳統(tǒng)常用中藥,具有清熱燥濕、瀉火解毒等功效。黃芩的主要化學(xué)成分為黃酮類[12],包括黃芩苷、黃芩素、漢黃芩苷、漢黃芩素等。研究表明,連翹葉[13-16]和黃芩[17-18]都具有較強(qiáng)的抗氧化、抗菌活性。目前,關(guān)于連翹葉和黃芩提取物在此方面的報(bào)道較多,田葉[19]等研究了連翹葉清除亞硝酸鹽和阻斷亞硝胺形成及抗氧化活性,結(jié)果表明,連翹葉水提取液經(jīng)D101大孔樹(shù)脂分離,40%乙醇(體積百分比，下同)洗脫部位總酚含量最高,具有較強(qiáng)的清除亞硝酸鹽和抗氧化能力,并能阻斷亞硝胺的形成;徐放等[20]采用中草藥結(jié)合涂膜保鮮技術(shù),比較了鹿蹄草、黃芩、半邊蓮、黃柏、北豆5種中藥提取液及復(fù)配制劑對(duì)草莓的保鮮作用,結(jié)果表明,黃芩提取液的保鮮效果僅次于鹿蹄草提取液,同時(shí)黃芩提取液對(duì)青霉、灰霉等霉菌的生長(zhǎng)也有較強(qiáng)的抑制作用。然而,對(duì)于連翹葉及黃芩活性組分的復(fù)配在香腸保鮮防腐中的研究應(yīng)用卻鮮有報(bào)道。本課題組前期對(duì)黃芩清除亞硝酸鹽和阻斷亞硝胺形成及抗氧化活性有效部位進(jìn)行了篩選,結(jié)果表明黃芩醇提取液經(jīng)D101大孔樹(shù)脂分離,60%乙醇洗脫部位總黃酮含量最高,黃芩素為其主要活性成分,且清除DPPH·、抑制亞硝胺形成及抗菌活性最強(qiáng),可作為天然抗氧化劑和防腐劑的來(lái)源;因此,本論文在前期研究基礎(chǔ)上選用連翹葉和黃芩抗氧化有效部位的復(fù)配物研究了對(duì)香腸抗氧化保鮮作用。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 材料與試劑

連翹葉采摘于山西省陵川縣野生連翹基地,黃芩采挖于山西省陵川縣黃芩種植基地,經(jīng)本校分子科學(xué)研究所張立偉教授鑒定分別為木犀科植物連翹[(Forsythiasuspensa(Thunb.) Vahl)]的干燥葉和唇形科植物黃芩(ScutellariabaicalensisGeorgi)的干燥根。

1,1,3,3-四乙氧基丙烷(體積百分比97%)、抗壞血酸鈉(麥克林 上海生化科技有限公司);NaCl(優(yōu)級(jí)純 天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司);優(yōu)質(zhì)豬肉、五香粉、食鹽、味精、淀粉購(gòu)于太原市華聯(lián)超市;實(shí)驗(yàn)用水為娃哈哈純凈水,其他化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 1260高效液相色譜儀(美國(guó)Agilent公司);先行者CP114萬(wàn)分之一電子天平(美國(guó)奧豪斯 上海儀器有限公司);力可美LKM-JR08不銹鋼手搖式灌腸機(jī)(深圳市力可美科技有限公司);CARY 50紫外分光光度計(jì)(美國(guó)瓦里安公司);HH-ZK4二列圓孔水浴鍋(鞏義市予華有限責(zé)任公司);pH計(jì)(FZ-600復(fù)合電極)(成都世紀(jì)方舟科技有限公司);DZ500-2D真空包裝機(jī)(溫州市新泰包裝機(jī)械廠);SHK-99-Ⅱ臺(tái)式空氣恒溫?fù)u床(北方同正);高速冷凍離心機(jī)(金壇市水北科普實(shí)驗(yàn)儀器廠);FSH-2A可調(diào)高速勻漿機(jī)(金壇市友聯(lián)儀器研究所)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品制備及分析

精密稱取100 g連翹葉粉末(過(guò)40目篩),依次用料液比1∶10、1∶8的蒸餾水于100℃下回流提取2次,每次1 h[21],冷卻、過(guò)濾,合并2次濾液于60℃下減壓濃縮,冷凍干燥,得連翹葉粗提物。將預(yù)處理好的D101大孔樹(shù)脂濕法裝柱,精密稱取粗提物10 g,用水溶解、過(guò)濾、上樣。依次用20%、40%、60%、80%乙醇洗脫,得4個(gè)樣品組分。經(jīng)HPLC分析[22],將主要活性成分為連翹酯苷A[19]的40%乙醇洗脫液減壓濃縮,冷凍干燥,得連翹葉提取物(Fr)。

精密稱取100 g黃芩粉末(過(guò)40目篩),用料液比1∶35的53%乙醇70℃下回流提取2 h[23],冷卻、過(guò)濾,濾液于60℃下減壓濃縮,冷凍干燥,得黃芩粗提物。精密稱取黃芩粗提物10 g,用乙醇溶解后加入預(yù)處理好的D101大孔樹(shù)脂,依次用水、20%、40%、60%、80%乙醇洗脫,得5個(gè)樣品組分。經(jīng)HPLC分析[23],將主要活性成分為黃芩素[24]的60%乙醇洗脫液減壓濃縮,冷凍干燥,得黃芩提取物(S)。

1.3.2 樣品的復(fù)配

前期經(jīng)過(guò)對(duì)Fr和S配伍比例為3∶1，1∶1，1∶3的抗氧化、抑菌活性的初步篩選, Fr∶S=1∶3固定比的復(fù)配物活性最好; 另外就抑菌活性而言,Fr和S對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用相當(dāng),但S對(duì)大腸桿菌的抑制作用顯著高于Fr,因此選用Fr∶S=1∶3進(jìn)行樣品對(duì)香腸保鮮作用的研究。

將1.3.1制備的樣品Fr和S,按1∶3的比例混合均勻,得復(fù)配樣品(FS)。

1.3.3 香腸制作

取肥瘦比例約3∶7的豬后腿肉,剔除淋巴、血管等結(jié)締組織,用絞肉機(jī)攪碎,加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.01%亞硝酸鈉、0.15%味精、0.2%五香粉、2.5%食鹽、5%淀粉、10%冰水(均以肉重計(jì)),攪勻后分成5組:空白對(duì)照組(CT)、陽(yáng)性對(duì)照組、添加0.25%、0.5%、1%復(fù)配物,分別標(biāo)記為T、V、FS1、FS2、FS3。其中,陽(yáng)性對(duì)照組添加0.05%抗壞血酸鈉(Vc-Na)?？烧{(diào)高速勻漿機(jī)攪勻后于4℃下腌制48 h,真空包裝。沸水蒸40 min后冷卻,室溫(22℃)保存。在第0、1、2、3、4周取樣,進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)的測(cè)定。

1.3.4 香腸理化指標(biāo)的測(cè)定

1.3.4.1 pH值

參照GB/T 9695.5-2008進(jìn)行。取10 g香腸研碎后置于具塞錐形瓶中,加入90 mL蒸餾水,25℃恒溫?fù)u床上振搖30 min,過(guò)濾,測(cè)pH值。

1.3.4.2 過(guò)氧化值(POV)

標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制:采用比色法,參照GB/T 5009.37-2003進(jìn)行。以吸光度A為縱坐標(biāo),Fe2+的濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得其線性回歸方程y=0.295c+0.000 8(R2=0.999 8),線性檢測(cè)范圍為0.2～4 μg/mL.

樣品測(cè)定:稱2 g香腸樣品,加入15 mL三氯甲烷∶甲醇=7∶3混合溶劑,13 000 r/min下均質(zhì)30 s,加入3 mL NaCl(0.5%)溶液,4℃下3 000 r/min離心10 min。取下層溶液5 mL到具塞比色管中,加入5 mL三氯甲烷∶甲醇=7∶3混合溶劑,加入50 μL FeCl2(3.5 g/L),搖勻后加入50 μL硫氰酸鉀(300 g/L),混勻,靜置5 min,于500 nm處測(cè)吸光度值。

1.3.4.3 硫代巴比妥酸值(TBA)

采用分光光度法,參照GB 5009.181-2016進(jìn)行。以吸光度A為縱坐標(biāo),丙二醛的濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得其線性回歸方程y=0.779 8c+0.000 5(R2=1),線性檢測(cè)范圍為0.018～0.627 μg/mL.

1.3.4.4 揮發(fā)性鹽基氮(TVB-N)

采用半微量定氮法,參照GB 5009.228-2016進(jìn)行。稱取10 g樣品置于250 mL具塞錐形瓶中，加入100 mL去離子水，搖勻，靜置30 min后過(guò)濾。取濾液10 mL于半微量凱氏定氮裝置的小玻管中，再加入5 mL氧化鎂混懸液(10 g/L)，同時(shí)向接受瓶?jī)?nèi)加入10 mL硼酸溶液(20 g/L)和5滴混合指示劑(1 g/L甲基紅乙醇溶液與1 g/L的溴甲酚綠乙醇溶液按1∶5混合)蒸餾1 min。以0.01 mol/L的鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定到紫紅色。根據(jù)消耗鹽酸的量計(jì)算揮發(fā)性鹽基氮的含量(TVB-N)。

1.3.4.5 亞硝酸鹽的測(cè)定

采用分光光度法,參照GB 5009.33-2010進(jìn)行。以吸光度A為縱坐標(biāo),NaNO2濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到線性回歸方程y=0.751 8c+0.003 1(R2=0.999 8),線性檢測(cè)范圍為0.02～0.22 μg/mL.

1.3.4.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與處理

2 結(jié)果與分析

2.1 pH值隨貯藏時(shí)間的變化

pH值是評(píng)價(jià)肉制品品質(zhì)的指標(biāo)之一,肉制品酸敗會(huì)導(dǎo)致pH值降低,嚴(yán)重影響肉制品品質(zhì)及保質(zhì)期。表1顯示了香腸pH值隨貯藏時(shí)間的變化,空白對(duì)照組、Vc-Na組、樣品組pH值都隨貯存時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸下降。其中,pH值在第0～1周下降較快,具有顯著性差異(P<0.05),這可能是由于香腸中蛋白質(zhì)分解為氨基酸或碳水化合物分解成有機(jī)酸導(dǎo)致[25];在第2～4周,各組pH值下降速度減緩,可能是隨貯藏時(shí)間延長(zhǎng),蛋白質(zhì)分解酶活性增強(qiáng),蛋白質(zhì)被分解為氨或堿性胺類物質(zhì)。相比空白組,樣品組pH值下降速度較慢,表明FS樣品具有延緩香腸酸敗的作用;同時(shí),較高的pH環(huán)境可抑制香腸中致癌物質(zhì)亞硝胺的形成[26],保障了香腸的質(zhì)量安全。另外,在同周期下,樣品組pH值為FS3>FS2>FS1,表明FS對(duì)香腸酸敗的抑制作用與劑量呈正相關(guān)。本研究表明,FS樣品能有效延緩香腸中蛋白質(zhì)及碳水化合物的分解酸化,對(duì)香腸具有較好的保鮮作用。

表1 pH值的變化

2.2 POV值隨貯藏時(shí)間的變化

氫過(guò)氧化物是不飽和脂肪酸氧化的初級(jí)產(chǎn)物[27],POV值越大,脂肪氧化程度越高,生成的氫過(guò)氧化物越多。氫過(guò)氧化物不穩(wěn)定,易進(jìn)一步降解成醛、酮和酸等物質(zhì)[28],從而影響香腸品質(zhì)。

表2顯示,空白對(duì)照組、Vc-Na組和樣品組POV值都隨貯藏時(shí)間延長(zhǎng)而升高;其中,第0～1周氧化速度緩慢,各組POV值無(wú)顯著差異(P>0.05);第2～4周,各組POV值顯著升高,原因可能是:脂肪氧化反應(yīng)是自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng),包括引發(fā)、傳遞和終止三個(gè)階段,第1周屬于引發(fā)階段,氧化速度相對(duì)緩慢,第2周進(jìn)入傳遞階段,脂肪氧化速度迅速加快。分析發(fā)現(xiàn),從第3周開(kāi)始,樣品組和Vc-Na組POV值較空白組顯著降低;在第4周,樣品中、高劑量組POV值還顯著低于Vc-Na組(P<0.05),這說(shuō)明復(fù)配樣品和Vc-Na都能顯著抑制脂肪的氧化,同比下,樣品中、高劑量組抑制作用強(qiáng)于Vc-Na。比較樣品組POV值差異可知,樣品對(duì)脂肪氧化的抑制作用與劑量呈正相關(guān)。

表2 POV值的變化(單位:meq/kg)

2.3 TBARS值隨貯藏時(shí)間的變化

TBARS用于測(cè)定肉制品中丙二醛含量,是評(píng)價(jià)肉制品中脂肪氧化程度的另一種方法。與POV類似,其值越大,脂肪氧化程度越高。脂肪氧化會(huì)導(dǎo)致肉制品脂肪酸和脂溶性維生素嚴(yán)重?fù)p失,是肉制品貯藏過(guò)程中品質(zhì)惡化的一個(gè)主要原因。

從表3可知,隨貯藏時(shí)間延長(zhǎng),各組TBARS值升高,說(shuō)明脂肪氧化程度隨貯藏時(shí)間增加而增強(qiáng)。在第0～1周,各組TBARS值上升較慢,此階段可能為脂肪初級(jí)氧化產(chǎn)物生成階段。在1～3周,各組(FS3除外)TBARS值上升較快,此階段可能是由于過(guò)氧化物積累,分解速度加快導(dǎo)致。比較第4周TBARS值可知,Vc-Na組和樣品組TBARS值均顯著小于空白組(P<0.05),且樣品組劑量越大,TBARS值越小,表明Vc-Na及復(fù)配樣品均可抑制香腸中脂肪氧化次級(jí)產(chǎn)物的形成,且復(fù)配樣品對(duì)脂肪氧化的抑制與劑量呈正相關(guān)。在第3～4周,樣品中、高劑量組TBARS值均顯著小于Vc-Na組(P<0.05),說(shuō)明隨貯藏時(shí)間的延長(zhǎng),樣品中、高劑量組對(duì)脂肪氧化次級(jí)產(chǎn)物形成的抑制作用強(qiáng)于Vc-Na組。

表3 TBARS值的變化(單位:mg/kg)

2.4 TVB-N值隨貯藏時(shí)間的變化

TVB-N是指在內(nèi)源酶和細(xì)菌作用下,肉制品中的蛋白質(zhì)被分解成的揮發(fā)性氨及胺類(二甲胺、三甲胺)等含氮堿性物質(zhì),一定量生物胺對(duì)人體具有重要的生理功能[29],但含量過(guò)高則會(huì)起毒害作用[30]。TVB-N含量與肉制品腐敗程度具有一定相關(guān)性,是衡量肉制品腐敗變質(zhì)的重要指標(biāo)之一。

從表4可知,隨貯藏時(shí)間的延長(zhǎng),各組TVB-N值逐漸增大。與空白組相比,Vc-Na組在第1周有顯著性差異(P<0.05),2～4周差異不明顯(P>0.05),表明Vc-Na在第1周延緩了香腸中蛋白質(zhì)的腐敗,但由于Vc-Na不穩(wěn)定,隨著時(shí)間延長(zhǎng)逐漸失活,故在2～4周TVB-N值快速增大,這也反映了Vc-Na抑菌作用不明顯。在1～4周樣品組與空白組的TVB-N值差異顯著(P<0.05),說(shuō)明樣品有效抑制了香腸中蛋白質(zhì)的分解;比較樣品組間TVB-N值的差異可知,樣品對(duì)蛋白質(zhì)分解的抑制能力與劑量呈正相關(guān)。第4周時(shí),樣品中、高劑量組的TVB-N值均顯著小于Vc-Na組(P<0.05),說(shuō)明樣品中、高劑量組對(duì)抑制蛋白質(zhì)分解的能力強(qiáng)于Vc-Na組。

表4 TVB-N值的變化(單位:mg/kg)

2.5 亞硝酸鹽含量隨貯藏時(shí)間的變化

亞硝酸鹽作為肉制品添加劑歷史悠久,但它的安全性一直受國(guó)內(nèi)外廣泛關(guān)注。在酸性條件下它會(huì)分解成亞硝酸,亞硝酸又易分解成亞硝基,而亞硝基能與蛋白質(zhì)分解產(chǎn)物仲胺類物質(zhì)反應(yīng)生成亞硝胺[31]。亞硝胺具有致癌作用,所以亞硝酸鹽含量是評(píng)價(jià)香腸品質(zhì)的重要指標(biāo)之一。

從表5可知,隨著貯存時(shí)間延長(zhǎng),各組亞硝酸鹽含量逐漸降低,值得注意的是:在0周,Vc-Na組、樣品組中的亞硝酸鹽含量顯著低于空白組(P<0.05),說(shuō)明Vc-Na、樣品均可減少香腸中的亞硝酸鹽含量,且樣品對(duì)亞硝酸鹽的清除作用呈劑量依賴關(guān)系。在貯藏期間樣品中、高劑量組亞硝酸鹽的含量顯著低于Vc-Na組(P<0.05),可知樣品中、高劑量組對(duì)亞硝酸鹽的清除作用強(qiáng)于Vc-Na組。同時(shí)Vc-Na組和復(fù)配樣品組中亞硝酸鹽含量的減少,也有利于抑制香腸中亞硝胺的形成。

表5 亞硝酸鹽含量的變化(單位:mg/kg)

3 結(jié)論

本文通過(guò)對(duì)香腸各項(xiàng)理化指標(biāo)pH值、POV值、TBA值、TVB-N值和亞硝酸鹽含量的測(cè)定來(lái)評(píng)價(jià)連翹葉及黃芩提取物經(jīng)分離后抗氧化有效部位的復(fù)配對(duì)香腸的抗氧化保鮮作用。研究表明,不同劑量(0.25%、0.5%、1%)Fr與S復(fù)配樣品能有效抑制香腸各理化指標(biāo)含量的增加,且保鮮程度與劑量呈正相關(guān),同比下,樣品中、高劑量組作用強(qiáng)于陽(yáng)性對(duì)照Vc-Na組,對(duì)香腸具有較好的防腐作用,從而延長(zhǎng)香腸的保質(zhì)期。因此,本研究為探索和開(kāi)發(fā)高效、安全的天然抗氧化劑具有重要指導(dǎo)意義,同時(shí)對(duì)連翹資源的深度開(kāi)發(fā)利用提供了理論支持。