李 杰，孟慶玲，喬 軍，張星星，王曉婷，李 妍，張國武，蔡擴軍，才學(xué)鵬

（1. 石河子大學(xué)動物科技學(xué)院，石河子 832003； 2. 新疆農(nóng)墾科學(xué)院 綿羊遺傳改良與健康養(yǎng)殖省部共建國家重點實驗室，石河子 832000；3. 烏魯木齊市動物疾病控制與診斷中心，烏魯木齊 830063；4. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所，蘭州 730046）

單核細(xì)胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes，LM）是一種重要的食源性人獸共患病原菌，該菌可在高鹽、低溫、酸堿等多種復(fù)雜環(huán)境下生長繁殖，有較強的環(huán)境適應(yīng)性[1]。LM可通過消化道進(jìn)入體內(nèi)，入侵宿主機體后可在吞噬細(xì)胞和非吞噬細(xì)胞內(nèi)存活并大量增殖，并能穿越腸道屏障、血胎屏障、血腦屏障能引起腸胃炎、腦膜炎和流產(chǎn)等[2-3]。新生兒、孕婦、老年人以及免疫功能缺陷者易通過動物源性食品感染LM，致死率高達(dá)20%～30%[4-6]，因此世界衛(wèi)生組織（world health organization，WHO）將LM列為僅次于大腸桿菌O157、沙門氏菌、志賀氏菌之后的第四大食源性致病菌，也是必檢的食源性致病菌之一[7-8]。

作為一種兼性胞內(nèi)寄生的革蘭氏陽性菌，LM可以依賴其特有的表面蛋白侵入宿主非吞噬細(xì)胞，進(jìn)而突破宿主腸道屏障、血胎屏障和血腦屏障，其感染的過程受多種因素的調(diào)控[7]。有研究發(fā)現(xiàn)，AraC家族轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白在不同病原微生物中均發(fā)揮著十分重要的作用，與細(xì)菌的多重耐藥性、代謝反應(yīng)、致病力等密切相關(guān)[9-13]。目前，李斯特菌AraC家族轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白的功能尚不清楚。

Chatterjee等[14]通過李斯特菌強毒株和弱毒株的基因組DNA文庫的比較鑒定顯示，lmo2672屬于一個新的致病基因；Toledo等[15]進(jìn)一步研究表明，lmo2672基因?qū)儆贏raC家族的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，可調(diào)控LM多個基因的表達(dá)。然而，lmo2672具體的生物學(xué)功能尚不清楚。為了探究lmo2672基因的功能，本研究對單增李斯特菌綿羊分離株LM-SB5lmo2672基因進(jìn)行克隆、編碼蛋白分子特征和系統(tǒng)進(jìn)化分析，為下一步探討lmo2672基因在LM毒力和環(huán)境應(yīng)激中的調(diào)控作用奠定了理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株、培養(yǎng)基及試劑 LM新疆野毒株SB5由本實驗室從發(fā)病綿羊體內(nèi)分離，鑒定后保存；大腸桿菌E. coliDH5α由本實驗室保存。腦心浸液培養(yǎng)基（BHI）購自青島高科技園海博生物技術(shù)有限公司；DL2000 DNA Marker、pMD19-T（simple）載體購自TaKaRa公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購自諾維森生物公司。

1.2 引物設(shè)計與合成 根據(jù)GenBank登錄的lmo2672基因序列（登錄號：CP019616.1）設(shè)計擴增lmo2672基因引物，由北京華大基因公司合成。上游引物lmo2672F：5'-GGAATTCATGGCTAAGCTA GAAAC-3'（下劃線堿基為EcoRⅠ酶切位點），下游引物lmo2672R：5'-CCTCGAGTCATTGTAT ATTTGCGACA-3'（下劃線堿基為XhoⅠ酶切位點）。

1.3 LMlmo2672基因的克隆及測序 挑取LM野毒株SB5單菌落于BHI培養(yǎng)基中，置于37℃溫箱培養(yǎng)15 h，按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒的說明書提取LM分離株SB5基因組DNA。PCR的反應(yīng)體系：ddH2O 9 μL，PCR Mix 8 μL，上下游引物各0.5 μL，DNA模板2 μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min；94℃變性40 s，57℃退火1 min，72℃延伸50 s，30個循環(huán)；72℃延伸10 min，4℃保存。將目的片段用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒純化回收，純化后的PCR產(chǎn)物與pMD19-T（simple）載體過夜連接，然后轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，通過菌液PCR進(jìn)一步篩選，將陽性克隆送至華大基因生物公司測序。

1.4lmo2672基因編碼蛋白質(zhì)的生物信息學(xué)分析利用ProtParam在線軟件（http://web.expasy.org/protparam/）計算蛋白質(zhì)的理論分子質(zhì)量、理論等電點；通過Protscale（http://web.expasy.org/protscale/）分析蛋白質(zhì)的親水性與疏水性；利用PrositeScan（https://prosite.expasy.org/prosite.html）分析蛋白的結(jié)構(gòu)域；通過SignalP（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）進(jìn)行蛋白質(zhì)的信號肽預(yù)測；利用DNAStar軟件預(yù)測Lmo2672蛋白的二級結(jié)構(gòu)，應(yīng)用SWISS-MODEL（http://www.swissmodel.expasy.org/）預(yù)測蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)。

1.5lmo2672基因核苷酸序列系統(tǒng)進(jìn)化分析 將LM野毒株SB5lmo2672基因與GenBank已知的LM不同菌株及其他種屬細(xì)菌的AraC家族轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)基因核苷酸序列進(jìn)行對比，應(yīng)用MEGA5.0軟件對lmo2672基因核苷酸序列進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析，并采用鄰接法（Neighbor-Joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié)果

2.1lmo2672基因的擴增、克隆及測序 用lmo2672F/lmo2672R引物擴增lmo2672基因，產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測得到約807 bp的目的條帶（圖1A）。PCR產(chǎn)物與pMD19-T（simple）載體連接，轉(zhuǎn)化至DH5α后通過菌液PCR篩選陽性克隆pMD19-T-lmo2672（圖1B），對陽性克隆進(jìn)行測序分析，結(jié)果顯示，該基因與GenBank中預(yù)期的LMlmo2672基因片段大小一致。

2.2lmo2672基因核苷酸及編碼氨基酸序列分析 測序結(jié)果顯示，LM野毒株SB5lmo2672基因全長807 bp，編碼268 aa；通過Motif Scan （https://myhits.isb-sib.ch/cgi-bin/motif_scan）在線軟件分析發(fā)現(xiàn)含1個cAMP和cGMP依賴性蛋白激酶磷酸化位點（246～249 aa），5個酪蛋白激酶II磷酸化位點（83～86 aa，87～90 aa，139～142 aa，146～149 aa，252～255 aa），1個N端?；稽c（226 aa～231 aa）和3個蛋白激酶C磷酸化位點（13～15 aa，186～188 aa，205～207 aa）；1個DNA結(jié)合域（185～259 aa），2個由螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋構(gòu)成的HTH結(jié)構(gòu)域（184～198 aa，226～249 aa）（圖2）。

2.3lmo2672基因的理化特性分析 利用ExPASY在線軟件中ProtParam工具分析LM野毒株SB5的lmo2672基因編碼蛋白的理化性質(zhì)，該蛋白分子式為C1396H2151N357O396S11，理論分子量為30.62 kDa，理論等電點為5.47，原子總數(shù)：4311。不穩(wěn)定指數(shù)為30.79，所以該蛋白為穩(wěn)定蛋白。帶負(fù)電荷的殘基總數(shù)為33個，帶正電荷的殘基總數(shù)為27個；脂溶指數(shù)為87.72，總疏水性平均數(shù)為-0.133。ProtScale 在線工具進(jìn)一步預(yù)測表明，Lmo2672氨基酸序列中疏水最大值為2.244，最小值為-2.589，大部分氨基酸屬于親水性氨基酸，可見該蛋白屬于親水性蛋白，易溶于水。

圖1 lmo2672基因的PCR擴增結(jié)果(A)及pMD19-T-lmo2672菌液PCR驗證(B)Fig.1 lmo2672 gene amplified by PCR(A) and pMD19-T-lmo2672 identificated by bacterial PCR(B)

2.4 Lmo2672蛋白分子結(jié)構(gòu)特征分析 DNAStar軟件分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白由5個α-螺旋、6個β-折疊、4個β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲組成。TMHMM 2.0 Server分析顯示，Lmo2672蛋白不存在跨膜結(jié)構(gòu)。SignalP 4.1 Server分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白無信號肽序列，屬于非分泌性蛋白；SWISS-MODEL分析平臺預(yù)測該蛋白的三級結(jié)構(gòu)（圖3），用NCBI預(yù)測了Lmo2672蛋白的螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋（helix-turn helix）結(jié)構(gòu)域（圖4）。與肺炎克雷伯菌和腸球菌AraC家族轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子相比，三者在其C端均具有2個H-T-H超二級結(jié)構(gòu)域，LM Lmo2672在N端還具有一個HTH-11結(jié)構(gòu)域（圖5），提示不同的細(xì)菌AraC家族轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白存在一定的差異。

圖2 lmo2672基因核苷酸序列及其編碼氨基酸序列Fig. 2 Nucleotide sequences and amino acid sequences of lmo2672

圖3 Lmo2672蛋白的三級結(jié)構(gòu)Fig.3 Predicted the 3D structure of Lmo2672

圖4 Lmo2672蛋白的螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋結(jié)構(gòu)域Fig.4 Predicted the Helix-turn-helix domain of Lmo2672

2.5lmo2672基因序列的系統(tǒng)進(jìn)化分析 將克隆測序所得LM野毒株SB5lmo2672核苷酸序列與GenBank上公布的不同來源的lmo2672核苷酸序列以及同為AraC家族的不同基因的菌株進(jìn)行同源性比對。結(jié)果顯示：LM野毒株SB5的lmo2672核苷酸序列（下劃線）與李斯特譜系II型菌株親緣性關(guān)系較近，其中與NTSN株（4b型，綿羊腦，中國揚州）的同源性為99.63%，與SLCC2378株（4e型，德國）、CIIMS L2株（印度，血液）、81-0592株（4b型，加拿大，胎血）、02-1792株（4b型，加拿大，奶酪）、F2365株（4b型，奶酪，美國）的同源性均為99.75%，與J1-220株（4b型，臨床）、H34株（1/2b型，烏拉圭，血液）、LI0521株（美國，臨床）同源性均為99.26%。而與譜系I型菌株國際標(biāo)準(zhǔn)株EGD-e株（1/2a型，美國）、10-5024株（1/2a型，加拿大，食物）、10-5025株（1/2c型，加拿大，培根片）親緣性關(guān)系較遠(yuǎn)，其核苷酸同源性為97.52%～97.77%。肺炎克雷伯菌RarA基因和腸球菌ECBG-00297基因均為AraC家族轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)基因，兩者位于同一分支，親緣關(guān)系較近，但與LM轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)基因lmo2672的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)（圖6）。

圖5 LM Lmo2672的H-T-H結(jié)構(gòu)域模式圖Fig.5 H-T-H domains pattern of Lmo2672 protein of LM

3 討論

LM是一種重要的食源性人獸共患菌，可進(jìn)入宿主細(xì)胞并通過破壞液泡膜進(jìn)入宿主細(xì)胞胞質(zhì)的胞內(nèi)寄生菌之一[12]。目前有研究發(fā)現(xiàn)，AraC家族轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白在不同病原微生物中發(fā)揮著十分重要的作用，AraC家族轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白的特征是其結(jié)構(gòu)中都含有序列保守的AraC DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，位于該蛋白的C端，一般由99個氨基酸組成[16-17]。不同的AraC家族轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域以外的可變結(jié)構(gòu)域序列差異比較大，提示不同的AraC家族轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白功能可能存在差異。在肺炎克雷伯菌中，AraC家族轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白RarA可通過調(diào)節(jié)主動外排泵的表達(dá)而導(dǎo)致肺炎克雷伯菌產(chǎn)生多重耐藥性[9]。在枯草芽孢桿菌中，AraC家族轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白Prkc通過磷酸化代謝途徑中的蛋白來調(diào)節(jié)枯草芽孢桿菌的代謝[10]。在霍亂弧菌中，AraC家族轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白ToxT通過激活霍亂毒素和毒素協(xié)同調(diào)節(jié)菌毛的表達(dá)而增強霍亂弧菌的致病力[11]，在腸球菌中，AraC家族轉(zhuǎn)錄影響蛋白生物膜的形成來調(diào)節(jié)毒力[18]。

Lmo2672是LM基因組中發(fā)現(xiàn)的一種AraC家族轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子編碼基因[12]。有研究發(fā)現(xiàn)，lmo2672在不同的培養(yǎng)基和不同培養(yǎng)環(huán)境中表達(dá)量差異顯著[15]，然而其生物學(xué)功能尚不清楚。本試驗采用PCR方法從LM野毒株SB5克隆lmo2672基因，經(jīng)測序和序列比對后獲得lmo2672全長序列807 bp，共編碼268個氨基酸，氨基酸序列總疏水性平均數(shù)為-0.133，可見該蛋白屬于親水性蛋白。在蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測中發(fā)現(xiàn)，無信號肽序列及跨膜結(jié)構(gòu)，說明屬于非分泌性蛋白。該蛋白以α-螺旋為主（占55.02%），含有螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋結(jié)構(gòu)域，由兩個α螺旋間隔以一定角度的轉(zhuǎn)角構(gòu)成的結(jié)構(gòu)域，其中一個α螺旋可插入DNA大溝中與專一DNA序列結(jié)合，發(fā)揮調(diào)控作用[19]。

圖6 lmo2672基因核苷酸序列系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系Fig.6 Phylogenetic tree of based on LM lmo2672 gene

同源性分析顯示，lmo2672核苷酸序列與國際標(biāo)準(zhǔn)株EGD-e株（1/2a 型，美國）同源性為97.77%，與中國揚州綿羊源4b型LM NTSN株同源性99.63%，提示新疆綿羊源LM野毒株SB5與中國揚州綿羊源NTSN株親緣關(guān)系較近。系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示，LM野毒株SB5的lmo2672核苷酸序列與李斯特譜系II型菌株親緣性關(guān)系較近；而與譜系I型菌株（EGD-e株）形成另外一分支，親緣性關(guān)系較遠(yuǎn)，提示lmo2672基因可能在不同譜系李斯特菌中有一定差異；同時，與其他菌株的AraC家族轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白親緣性較遠(yuǎn)，提示不同菌株的AraC家族轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白功能可能存在較大差異。

本研究首次克隆了綿羊源LM野毒株SB5轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子lmo2672基因，并利用生物學(xué)軟件對其分子結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行分析，證實Lmo2672蛋白含有螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋結(jié)構(gòu)域，推測其可與LM某些基因的順式作用元件DNA序列結(jié)合，從而發(fā)揮基因表達(dá)調(diào)控作用，為進(jìn)一步研究該蛋白在LM中的調(diào)控作用及其機制提供了理論基礎(chǔ)。