姚添奇 張默 何小奪 陳健 吳迪 丁玉川

腦梗死是一種致殘率和致死率較高的腦血管疾病，腦白質(zhì)纖維束損傷是腦梗死主要表現(xiàn)之一，與患者的臨床預(yù)后密切相關(guān)。MR功能成像技術(shù)能夠較早期地評(píng)估腦白質(zhì)損傷。擴(kuò)散張量成像(diffusion tensor imaging，DTI)是評(píng)價(jià)腦白質(zhì)纖維束的影像學(xué)新技術(shù),其在臨床中屬于水彌漫成像技術(shù)，主要是對(duì)人體水分子的彌散定量來(lái)直接反映人腦深部灰質(zhì)及白質(zhì)發(fā)生的微結(jié)構(gòu)變化[1]。DTI是從多個(gè)方向獲取擴(kuò)散加權(quán)圖像,得到每一個(gè)體素的擴(kuò)散張量的成像過(guò)程。DTI作為非侵入性的分析大腦內(nèi)部結(jié)構(gòu)的重要工具，是唯一能夠進(jìn)行活體測(cè)量神經(jīng)纖維的成像技術(shù)。DTI技術(shù)不僅能夠動(dòng)態(tài)跟蹤患者腦白質(zhì)纖維變化，還能夠?qū)⒒颊吣X部發(fā)生病變部位對(duì)其腦白質(zhì)纖維結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的影響展示出來(lái)[2]。恒河猴與人類的許多生物學(xué)特性(腦部結(jié)構(gòu)、灰白質(zhì)組成、血管分布等)接近，因此恒河猴腦缺血模型是轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)的重要方法[3]。本研究采用中國(guó)科學(xué)院自動(dòng)化研究所開發(fā)的DiffusionKit軟件，應(yīng)用MR DTI動(dòng)態(tài)評(píng)估恒河猴局部腦缺血模型的白質(zhì)纖維變化，通過(guò)自身比較，評(píng)估非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物模型局部腦缺血后白質(zhì)纖維束的損傷及修復(fù)過(guò)程[4]。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

成年雄性恒河猴4只，清潔級(jí)，年齡分別為8.0、8.5、9.5、6.0歲，平均(8.0±1.5)歲；體質(zhì)量為11.0、10.2、8.6、8.5 kg,平均(9.6±1.2) kg，由解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[合格證號(hào)：SCXK(軍)2012-0019][5]。動(dòng)物日常喂養(yǎng)在首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物室[SYXK(京)2014-0018]，每只動(dòng)物均單獨(dú)飼養(yǎng)，喂養(yǎng)1個(gè)月以上后用于實(shí)驗(yàn)。所用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物經(jīng)檢測(cè)排除結(jié)核分枝桿菌、志賀菌、沙門菌、寄生蟲、B病毒等感染。實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)首都醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(倫理號(hào)：AEEI-2016-174)。

1.2 主要試劑與儀器

麻醉藥品：丙泊酚(10 ml/100 mg，批號(hào)：320040,AstraZeneca UK Limited)；氯胺酮(2 ml/0.1 g，批號(hào)：111207，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司)；速眠新(批號(hào)：201403，廣州萊綠寵商貿(mào)有限公司)。實(shí)驗(yàn)所用磁共振設(shè)備為德國(guó)Simens公司生產(chǎn)的Verio 3.0 T超導(dǎo)磁共振掃描儀，搭配使用Simens 32通道頭部線圈；其他器材包括微導(dǎo)絲(Traxcess 14，美國(guó))、Rebar18 微導(dǎo)管(Micro Therapeutics，美國(guó))。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

模型動(dòng)物術(shù)前8 h禁水，2 h禁食，對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的生命體征全程監(jiān)測(cè)，手術(shù)臺(tái)通過(guò)電熱毯輔助加熱，動(dòng)物肛溫控制在37 ℃，肌內(nèi)注射氯胺酮(2 ml)+速眠新(1 ml)誘導(dǎo)麻醉，丙泊酚0.3～0.4 mg/(kg·h)持續(xù)靜脈滴注麻醉。采用冠狀動(dòng)脈造影并應(yīng)用5 F動(dòng)脈鞘組穿刺針、導(dǎo)引鋼絲、動(dòng)脈鞘行經(jīng)皮穿刺股動(dòng)脈。在0.889 mm(0.035英寸)超滑導(dǎo)絲引導(dǎo)下，將5 F導(dǎo)引導(dǎo)管置入右側(cè)頸內(nèi)動(dòng)脈，退出導(dǎo)絲造影。然后通過(guò)微導(dǎo)絲將微導(dǎo)管頭送達(dá)右側(cè)大腦中動(dòng)脈M1段，撤導(dǎo)絲，將一根10 cm自體血栓送至M1段，閉塞2.5 h后給予重組組織型纖溶酶原激活劑溶栓治療。手術(shù)過(guò)程中對(duì)體溫、血壓、心率、呼吸、血氧持續(xù)監(jiān)測(cè)。結(jié)束后對(duì)穿刺點(diǎn)加壓包扎，待恢復(fù)自主呼吸后，送至磁共振室進(jìn)行腦成像檢查，檢查結(jié)束送回動(dòng)物房，給予甘露醇等對(duì)癥治療以及保暖、營(yíng)養(yǎng)等支持[6]。

1.4 掃描序列與參數(shù)

分別于腦缺血后4 h、7 d、30 d進(jìn)行MR掃描，掃描時(shí)采用頭部固定裝置擺正頭部位置，以前聯(lián)合與后聯(lián)合連線為中心線進(jìn)行掃描?；緟?shù)：重復(fù)時(shí)間(repetition time，TR)、回波時(shí)間(echo time,TE)、視野(field of view，F(xiàn)OV)。常規(guī)掃描序列：(1)T1加權(quán)三維磁化強(qiáng)度預(yù)備梯度回波序列，TR=1 900 ms,TE=2.99 ms,FOV=230 mm×230 mm；(2)T2加權(quán)成像,TR=4 000 ms,TE=100 ms,FOV=180 mm×180 mm；(3)T2 MR液體衰減反轉(zhuǎn)恢復(fù)序列,TR=9 000 ms,TE=96 ms,FOV=220 mm×220 mm；(4)時(shí)間飛躍-MR血管成像,TR=20 ms,TE=3.6 ms,FOV=220 mm×220 mm；(5)擴(kuò)散加權(quán)成像,TR=6 000 ms,TE=100 ms,FOV=220 mm×220 mm；(6)DTI,TR=9 000 ms,TE=92 ms,FOV=131 mm×131 mm。

1.5 后處理方法

纖維束示蹤成像軟件為中國(guó)科學(xué)院自動(dòng)化研究所開發(fā)的DiffusionKit軟件[4]。將獲得的DICOM圖像在DiffusionKit軟件上進(jìn)行圖像預(yù)處理(a：格式轉(zhuǎn)換；b：渦流矯正；c：頭骨剝離)、圖像配準(zhǔn)、重組、纖維束成像、可視化。通過(guò)冠狀面圖像的內(nèi)囊層面，左右內(nèi)囊白質(zhì)處選定感興趣區(qū)，感興趣區(qū)采用統(tǒng)一的半徑，通過(guò)感興趣區(qū)來(lái)追蹤纖維束，可視化之后可以看到纖維束走向和纖維束數(shù)量。測(cè)量病灶內(nèi)的各向異性分?jǐn)?shù)(fractional anisotropy,FA)值并與健側(cè)對(duì)比，同時(shí)選擇病灶側(cè)和對(duì)側(cè)的額葉和小腦評(píng)估FA值和纖維束數(shù)量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

圖1顯示，注射血栓后恒河猴大腦中動(dòng)脈M1段閉塞，經(jīng)局部動(dòng)脈溶栓治療后，M1段實(shí)現(xiàn)血管再通。對(duì)于梗死灶側(cè)(右側(cè))和對(duì)側(cè)(左側(cè))，以及額葉、小腦區(qū)域的FA動(dòng)態(tài)分析顯示，梗死灶側(cè)(右側(cè))腦缺血后4 h、7 d、30 d FA比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=8.565，P<0.05)，其中梗死灶區(qū)缺血后7 d FA低于缺血后4 h(P=0.04) 和30 d(P=0.043)的FA。梗死灶對(duì)側(cè)(左側(cè))、額葉(右側(cè)和左側(cè))及小腦(右側(cè)和左側(cè))FA動(dòng)態(tài)比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，見(jiàn)表1。

對(duì)梗死灶側(cè)(右側(cè))和對(duì)側(cè)(左側(cè))以及額葉、小腦區(qū)域的纖維束數(shù)量動(dòng)態(tài)分析結(jié)果顯示，僅梗死灶側(cè)(右側(cè))纖維束數(shù)量動(dòng)態(tài)比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=10.658,P<0.05)，其中梗死灶區(qū)缺血后7 d纖維束數(shù)量低于缺血后4 h(P=0.045)和30 d (P=0.033)的纖維束數(shù)量。梗死灶對(duì)側(cè)(左側(cè))、額葉(右側(cè)和左側(cè))及小腦(右側(cè)和左側(cè))的纖維束數(shù)量動(dòng)態(tài)比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，見(jiàn)表2。

表1 大腦中動(dòng)脈閉塞-再通恒河猴模型腦缺血后4 h、7 d、30 d不同腦區(qū)各向異性分?jǐn)?shù)的變化

表2 大腦中動(dòng)脈閉塞-再通恒河猴模型腦缺血后4 h、7 d、30 d不同腦區(qū)纖維束數(shù)量的變化

3 討論

DTI是能在活體狀態(tài)下顯示白質(zhì)纖維束走向的成像技術(shù)，在臨床與科研方面有重要價(jià)值，可顯示纖維束形態(tài)變化與梗死灶的空間位置關(guān)系，可以結(jié)合臨床癥狀，指導(dǎo)患者的康復(fù)治療。DTI的基本原理是水分子在不均質(zhì)組織具有彌散各向異性的特征，在平行于纖維方向的彌散速度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于垂直方向的彌散速度，這種方向依賴性的彌散就是FA。FA是描述腦白質(zhì)纖維各向異性特征的主要參數(shù)之一，其大小與髓鞘的完整性、纖維致密性及平行性有密切關(guān)系，能夠反映白質(zhì)纖維束的完整性[7]。FA越大，神經(jīng)傳導(dǎo)功能越強(qiáng)。通過(guò)FA可以反映水分子彌散方向的強(qiáng)度，也可以通過(guò)白質(zhì)纖維束成像直觀反映組織的形態(tài)[8]。

在非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物上制備局部腦缺血模型，并進(jìn)行臨床相關(guān)的再通實(shí)驗(yàn)，能夠完全模擬疾病的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程。非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物在基因上接近人類，大腦解剖結(jié)構(gòu)、血管分布、灰質(zhì)和白質(zhì)的構(gòu)成與人類似，適合MRI檢查，尤其適合進(jìn)行DTI研究[3]。因此，國(guó)際卒中圓桌會(huì)議特別推薦，神經(jīng)保護(hù)藥物在臨床試驗(yàn)之前應(yīng)以非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物模型進(jìn)行研究。大腦中動(dòng)脈是腦缺血的好發(fā)部位，大多數(shù)模型均是針對(duì)大腦中動(dòng)脈展開[9]。血管介入制備模型與腦梗死發(fā)病、治療過(guò)程非常相似。因此，標(biāo)準(zhǔn)化的DTI數(shù)據(jù)能夠?yàn)榕R床研究提供準(zhǔn)確的參照。

3.0 T MRI的DTI序列為腦梗死的科研和臨床應(yīng)用提供了重要參照。DTI使用至少在6個(gè)方向的擴(kuò)散梯度測(cè)定水分子的擴(kuò)散。本研究采用64個(gè)方向擴(kuò)散梯度的DTI，對(duì)恒河猴模型進(jìn)行自身前后對(duì)照，并應(yīng)用中國(guó)科學(xué)院自動(dòng)化研究所開發(fā)的纖維束示蹤成像軟件DiffusionKit軟件對(duì)恒河猴局部腦缺血后的纖維束進(jìn)行了動(dòng)態(tài)分析。結(jié)果顯示，局部腦缺血后右側(cè)(缺血側(cè))梗死灶FA值和纖維束數(shù)量均呈現(xiàn)先降低再升高的趨勢(shì)，提示腦缺血急性期后腦白質(zhì)和纖維束逐步恢復(fù)。

近年來(lái)隨著取栓治療的開展，血管再通率顯著提高，相關(guān)腦保護(hù)研究陸續(xù)開展[10]。采用多種核磁程序序列，包括DTI，將為臨床轉(zhuǎn)化研究提供更多療效評(píng)估的工具，非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物模型也將更多地被應(yīng)用于腦保護(hù)研究中。