劉巖 洪凡 王朋

[摘要] 目的 探討絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路在硫氧還蛋白過氧化物酶1（Prx-1）抗硅沉著病肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程中的作用。 方法 將40只雄性C57BL/6小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組（生理鹽水）、模型組[二氧化硅（SiO2）]、轉(zhuǎn)染對(duì)照組（SiO2+慢病毒載體）和Prx-1轉(zhuǎn)染組（SiO2+Prx-1慢病毒）。生理鹽水、SiO2及慢病毒均經(jīng)支氣管灌注。造模后，小鼠常規(guī)飼養(yǎng)12周。采用免疫組化法和免疫熒光法分別檢測α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）及8-羥基脫氧鳥苷（8-OHdG）表達(dá)。Western blot法檢測Ⅰ型、Ⅲ型膠原、Prx-1、磷酸化細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（p-ERK1/2）、磷酸化-絲裂原活化蛋白激酶p38（P-p38）、磷酸化氨基末端激酶（p-JNK）表達(dá)。 結(jié)果 模型組和轉(zhuǎn)染對(duì)照組可見矽結(jié)節(jié)和肺間質(zhì)纖維化，但Prx-1轉(zhuǎn)染組的上述病變減輕。模型組和轉(zhuǎn)染對(duì)照組Prx-1表達(dá)無區(qū)別，但Prx-1轉(zhuǎn)染組較模型組Prx-1表達(dá)增高。與對(duì)照組比較，其余各組肺組織α-SMA、8-OHdG、Ⅰ型及Ⅲ型膠原、p-ERK1/2、p-P38、p-JNK表達(dá)增多；與模型組和轉(zhuǎn)染對(duì)照組比較，Prx-1轉(zhuǎn)染組的上述指標(biāo)表達(dá)減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。 結(jié)論 Prx-1具有抑制SiO2誘導(dǎo)的肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化和肺纖維化作用，這種作用與降低活性氧并抑制MAPK通路活化有關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化；硫氧還蛋白過氧化物酶1；活性氧；絲裂原活化蛋白激酶

[中圖分類號(hào)] R135.2 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2019）04（a）-0025-05

MAPK pathway mediates the ability of Prx-1 to inhibite myofibroblast transformation in mice with silicosis

LIU Yan HONG Fan WANG Peng LI Qian BAI Zhaorong SUN Ying▲

Department of Pathology， School of Basic Medical Science， North China University of Science and Technology， Hebei Province， Tangshan 063210， China

[Abstract] Objective To investigate the role of mitogen-activated protein kinase （MAPK） pathway in the transformation of thioredoxin peroxidase-1 （Prx-1） against myofibroblasts of silicosis. Methods Forty male C57BL/6 mice were randomly divided into control group （saline）， model group （SiO2）， transfection control group （SiO2 + lentivirus vector） and PRX-1 transfection group （SiO2 + Prx-1 lentivirus）. Normal saline， SiO2 and lentivirus were perfused through bronchus. After modeling， mice were fed for 12 weeks. Immunohistochemistry and immunofluorescence were used to detect the expression of α-smooth muscle actin （α-SMA） and 8-hydroxydeoxyguanosine （8-OHdG） respectively. Western blot was used to detect the expression of collagen type Ⅰ， collagen type Ⅲ， Prx-1， phosphorylated extracellular signal-regulated kinase （p-ERK1/2）， phosphorylated-mitogen-activated protein kinase p38 （P-p38） and phosphorylated amino-terminal kinase （p-JNK）. Results Silicon nodules and pulmonary interstitial fibrosis were found in model group and transfection control group， but the lesions were alleviated in Prx-1 transfection group. There was no difference in Prx-1 expression between model group and transfection control group， but compared with model group， Prx-1 expression increased in Prx-1 transfection group. Compared with control group， the expression of α-SMA， 8-OHdG， collagen type Ⅰ and collagen type Ⅲ， p-ERK1/2， p-P38 and p-JNK were increased in lung tissue of the other groups. Compared with the model group and the transfection control group， the expression of the above indicators in the Prx-1 transfection group were decreased. Conclusion Prx-1 can inhibit SiO2-induced myofibroblast transformation and pulmonary fibrosis， which is related to the reduction of oxygen-active substances and the inhibition of activation of MAPK pathway.

[Key words] Myofibroblast transformation； Thioredoxin peroxidase 1； Reactive oxygen species； Mitogen-activated protein kinase

硅沉著病是由長期吸入二氧化硅（SiO2）而引起的一種肺纖維化性疾病。在纖維化過程中，肺成纖維細(xì)胞可轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞，從而獲得遷移能力及更強(qiáng)的合成膠原能力[1]?；钚匝酰╮eactive oxygen species，ROS）及其介導(dǎo)的絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）傳導(dǎo)通路在這一轉(zhuǎn)化中發(fā)揮著重要的促進(jìn)作用[2-3]。硫氧還蛋白過氧化物酶-1（peroxiredoxin-1，Prx-1）是一種新型過氧化物酶，前期研究發(fā)現(xiàn)Prx-1通過降低ROS抑制來肌成纖維細(xì)胞分化，抗硅沉著病纖維化形成[4]。然而，Prx-1如何抑制肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，目前并不清楚。本研究利用小鼠硅沉著病模型，觀察Prx-1對(duì)SiO2誘導(dǎo)的肺肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化及膠原合成的影響，并探討MAKP通路的作用，為進(jìn)一步明確Prx-1抗硅沉著病纖維化作用提供參考。

1 對(duì)象與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雄性C57BL/6小鼠40只，8周齡，購于北京華阜康生物科技股份有限公司，許可證號(hào)SCXK（京）2014-0004，動(dòng)物合格證號(hào)11401300075648。小鼠常規(guī)飼養(yǎng)于華北理工大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心潔凈級(jí)動(dòng)物房[SYXK（冀）2015-0038]。溫度22～25℃，相對(duì)濕度40%～60%，晝夜替換12/12 h，自由進(jìn)食飲水。本研究經(jīng)華北理工大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（華北理工大學(xué)動(dòng)物倫理審批號(hào)：2015050）。

1.2 主要試劑

SiO2粉塵（美國sigma公司）；Prx-1慢病毒（蘇州吉瑪公司）；8-羥基脫氧鳥苷（8-OHdG）抗體、Prx-1抗體及人α平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）抗體（美國Abcam公司，生產(chǎn)批號(hào)：307233-9、282828-11、YH160753）；Ⅰ型膠原抗體、Ⅲ型膠原抗體、磷酸化-絲裂原活化蛋白激酶p38抗體（P-p38）抗體（美國Affinity公司，生產(chǎn)批號(hào)：122712、15217、2111740）；磷酸化的細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（p-ERK1/2）抗體、磷酸化c-Jun氨基末端激酶（p-JNK）抗體（美國BD公司，生產(chǎn)批號(hào)：4038733、155642-16）。

1.3 分組

采用摸球法將小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、轉(zhuǎn)染對(duì)照組和Prx-1轉(zhuǎn)染組，每組10只。對(duì)照組小鼠經(jīng)支氣管灌注生理鹽水200 μL，模型組小鼠以相同方式給予50 mg/mL SiO2 200 μL，轉(zhuǎn)染對(duì)照組給予SiO2懸液與慢病毒載體（107 TU/只），Prx-1轉(zhuǎn)染組灌注SiO2懸液與Prx-1慢病毒（107 TU/只）。模型制備后，普通飼養(yǎng)12周。

1.4 HE染色

造模并普通飼養(yǎng)12周末，麻醉小鼠，取出肺組織，左肺固定于4%多聚甲醛，常規(guī)石蠟包埋，HE染色。

1.5 免疫組織化學(xué)法檢測α-SMA表達(dá)

肺組織切片水化、修復(fù)和血清封閉后，α-SMA Ⅰ抗（1∶200稀釋）4℃孵育過夜，次日Ⅱ抗孵育、DAB顯色和蘇木精復(fù)染。結(jié)果判斷：每張切片隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野，以胞漿出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性細(xì)胞。陽性細(xì)胞比例評(píng)分：<5%（0分），5%～25%（1分），>25%～50%（2分），>50%～75%（3分），>75%（4分）。染色強(qiáng)度評(píng)分：無著色（0分），淺棕黃色（1分），棕黃色（2分），棕褐色（3分）。陽性細(xì)胞比例和染色強(qiáng)度的乘積為α-SMA染色評(píng)分[5]。

1.6 免疫熒光法檢測8-OHdG水平

肺組織切片水化、修復(fù)及封閉后，8-OHdG Ⅰ抗4℃孵育過夜；次日Ⅱ抗避光室溫孵育、封片。熒光顯微鏡下每張切片隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野，Image-Pro Plus 6.0軟件檢測積分光密度值（IOD），以平均值為8-OHdG表達(dá)水平。

1.7 免疫印跡法檢測Prx-1、p-ERK1/2、p-JNK、P-p38及Ⅰ、Ⅲ型膠原表達(dá)水平

右肺組織經(jīng)裂解、離心后收集上清。40 μg總蛋白行SDS-PAGE凝膠電泳并轉(zhuǎn)膜，相應(yīng)Ⅰ抗4℃孵育過夜，次日Ⅱ抗室溫孵育后電化學(xué)發(fā)光（ECL）顯影，Image J軟件行灰度掃描。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用LSD-t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠肺組織病理變化及α-SMA表達(dá)

對(duì)照組肺組織結(jié)構(gòu)完整，肺泡壁薄，無明顯炎癥細(xì)胞滲出。模型組和轉(zhuǎn)染對(duì)照組的肺組織結(jié)構(gòu)紊亂，肺泡間隔增寬，可見細(xì)胞-纖維性矽結(jié)節(jié)。與模型組比較，Prx-1轉(zhuǎn)染組肺泡間隔變窄，矽結(jié)節(jié)數(shù)量及面積減小。

α-SMA主要分布在矽結(jié)節(jié)和肺泡間隔。與對(duì)照組比較，模型組α-SMA表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。轉(zhuǎn)染對(duì)照組和模型組α-SMA表達(dá)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）；Prx-1轉(zhuǎn)染組α-SMA表達(dá)較模型組下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見圖1。

2.2 各組小鼠肺組織Ⅰ、Ⅲ型膠原表達(dá)

與對(duì)照組比較，模型組Ⅰ、Ⅲ型膠原表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。轉(zhuǎn)染對(duì)照組和模型組Ⅰ、Ⅲ型膠原表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05），但Prx-1轉(zhuǎn)染組Ⅰ、Ⅲ型膠原表達(dá)明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見圖2、表1。

2.3 各組小鼠肺組織8-OHdG水平

8-OHdG是一種DNA過氧化產(chǎn)物，其形成后由細(xì)胞核轉(zhuǎn)至細(xì)胞漿，但由于其不能通過細(xì)胞膜或被降解，可穩(wěn)定地存在于細(xì)胞漿，故可準(zhǔn)確地反映ROS水平[6]。本研究中8-OHdG呈綠色熒光，對(duì)照組8-OhdG表達(dá)極少，模型組表達(dá)增多，主要位于矽結(jié)節(jié)和肺泡間隔；兩組8-OhdG表達(dá)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。與模型組比較，轉(zhuǎn)染對(duì)照組8-OhdG表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05），但Prx-1轉(zhuǎn)染組8-OhdG表達(dá)明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見圖3、表1。

2.4 各組小鼠肺組織Prx-1、p-ERK1/2、P-p38及p-JNK的表達(dá)

各組ERK1/2、p38和JNK表達(dá)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。與對(duì)照組比較，模型組Prx-1、p-ERK1/2、P-p38及p-JNK表達(dá)增多（均P < 0.05）。轉(zhuǎn)染對(duì)照組與模型組的上述指標(biāo)表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05），但與模型組比較，Prx-1轉(zhuǎn)染組Prx-1水平增高，p-ERK1/2、P-p38及p-JNK水平下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P < 0.05）。見圖4、表1。

3 討論

硅沉著病的主要病理特點(diǎn)是矽結(jié)節(jié)形成和肺間質(zhì)纖維化，肌成纖維細(xì)胞在硅沉著病形成中發(fā)揮重要促進(jìn)作用[7]。肌成纖維細(xì)胞是一種含有肌動(dòng)蛋白和肌球蛋白等蛋白質(zhì)的成纖維樣細(xì)胞，因其分泌膠原能力強(qiáng)，被認(rèn)為是促進(jìn)器官纖維化形成過程中最重要和最主要的細(xì)胞之一[1，8]。成纖維細(xì)胞數(shù)量在正常肺組織中肌很少，TGF-β1等細(xì)胞因子可誘導(dǎo)肺成纖維細(xì)胞、肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞等細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞，ROS介導(dǎo)的MAPK通路活化參與這一轉(zhuǎn)化過程[9-10]。Lai等[11]報(bào)道TGF-β1通過ROS/P38和ROS/JNK通路激活Notch3，導(dǎo)致成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞。Wu等[12]報(bào)道蓽茇酰胺（一種中藥提取的單體物質(zhì)）可有效降低血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)心臟成纖維細(xì)胞ROS增多，并通過抑制ROS/ERK1/2通路抑制成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞，最終抑制膠原合成，提示ROS/ERK1/2通路在心臟肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化中具有促進(jìn)作用。

SiO2粉塵本身及SiO2激活的肺泡巨噬細(xì)胞均可產(chǎn)生ROS[13-14]。本研究中，與對(duì)照組比較，模型組小鼠肺泡間隔增寬，可見矽結(jié)節(jié)形成，Ⅰ/Ⅲ型膠原和8-OHdG表達(dá)水平升高，提示硅沉著病形成過程中ROS生成增多。成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維化細(xì)胞的重要標(biāo)志是α-SMA在成纖維細(xì)胞中表達(dá)很低，但在肌成纖維化細(xì)胞中高表達(dá)[1]。本研究中模型組α-SMA表達(dá)明顯高于對(duì)照組，且主要存在于矽結(jié)節(jié)和肺泡間隔內(nèi)，同時(shí)伴隨ERK1/2、JNK及p38通路的激活，提示SiO2誘導(dǎo)ROS生成后，ROS/MAPK通路及肌成纖維化細(xì)胞轉(zhuǎn)化間可能有密切聯(lián)系。

Prx-1是一種新型抗過氧化物酶，可有效降低ROS水平，并抑制ROS介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)通路的活化[15-17]。既往報(bào)道[4，18-20]指出，Prx-1具有抗硅沉著病纖維化作用。本研究中，Prx-1轉(zhuǎn)染組Prx-1表達(dá)較模型組明顯增高，提示Prx-1慢病毒轉(zhuǎn)染后的肺組織Prx-1高表達(dá)。與模型組比較，Prx-1轉(zhuǎn)染組α-SMA和Ⅰ/Ⅲ型膠原表達(dá)降低，同時(shí)8-OHdG、p-ERK1/2、P-p38和p-JNK水平也明顯降低，說明Prx-1通過降低ROS抑制MAPK通路活化，從而抑制肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化和膠原合成。

綜上所述，Prx-1具有抑制SiO2誘導(dǎo)的肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化和肺纖維化形成，這種抑制作用與降低ROS并抑制MAPK通路活化有關(guān)。

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（收稿日期：2018-11-05 本文編輯：王 蕾）