戰(zhàn)欣 吳士恒 鄧林

[摘要] 目的 探討Hsp90抑制劑17-烯丙基-17脫甲氧基格爾德霉素（17-AAG）聯(lián)合卡泊芬凈（CAS）治療中性粒細(xì)胞缺乏的侵襲性曲霉菌?。↖PA）的效果。 方法 將40只Wistar雄性大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為4組，即A組（空白對照）、B組、C組及D組，每組10只。四組大鼠均用環(huán)磷酰胺腹腔注射制備中性粒細(xì)胞缺乏模型，再經(jīng)鼻吸入煙曲霉孢子懸液。A組正常飼養(yǎng)，作為空白對照，B組和C組分別給予1 mg/kg的CAS和1 mg/kg的17-AAG腹腔注射，D組給予17-AAG聯(lián)合CAS（用法、用量同上），共用藥10 d。記錄大鼠的生存狀況。檢測治療第3天及第7天大鼠的血清半乳糖甘露醇聚糖抗原（GM），并對肺組織進(jìn)行GMS染色，觀察感染部位的真菌負(fù)荷。 結(jié)果 與A組比較，B組及D組生存率均明顯較高（P < 0.01），且D組平均生存時(shí)間長于B組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。與A組比較，治療第3天各組GM值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）；治療第7天，各治療組GM值低于A組（P < 0.01），D組低于B組（P < 0.05）。肺組織切片GMS染色顯示，各治療組真菌感染病灶均減小，且D組減小最為顯著，其治療第15天未發(fā)現(xiàn)病灶。 結(jié)論 17-AAG可通過抑制應(yīng)激反應(yīng)來提高CAS對大鼠IPA的療效。

[關(guān)鍵詞] 煙曲霉；卡泊芬凈；17-烯丙基-17脫甲氧基格爾德霉素；中性粒細(xì)胞缺乏

[中圖分類號] R519.1 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2019）04（a）-0016-04

Effect of 17-AAG combined with Caspofungin on invasive pulmonary aspergillosis in rats with neutrophil deficiency

ZHAN Xin1 WU Shiheng1 DENG Lin1 ZHANG Hongyue1 GAO Fusheng2▲

1.Clinical Medical School， Weifang Medical University， Shandong Province， Weifang 261000， China； 2.Department of Respiratory Medicine， Affiliated Hospital of Weifang Medical University， Shandong Province， Weifang 261000， China

[Abstract] Objective To explore the effects of the combination of Hsp90 inhibitor 17-AAG （17-allyl-17-demethoxygeldanamycin） and Caspofungin （CAS） in the treatmemt of invasive aspergillosis （IPA） with neutrophil deficiency. Methods Forty male Wistar rats were divided into 4 groups， group A， group B， group C and group D， according to random number table method， with 10 rats in each group. Neutrophil deficiency models were made by intraperitoneal injection of Cyclophosphamide in four groups of rats， and then Aspergillus fumigatus spore suspension was inhaled through nose. Group A was fed normally and served as blank control. Group B and C were given CAS of 1 mg/kg and 17-AAG of 1 mg/kg respectively by intraperitoneal injection. Group D was given 17-AAG combined with CAS （the same usage and dosage） for 10 days. The survival status of rats was recorded. The serum galactomannan antigen （GM） was detected on the 3rd and 7th day after treatment， and the lung tissues were stained with GMS to observe the fungal load at the infected sites. Results Compared with group A， the survival rates of group B and group D were significantly increased （P < 0.01）， and the average survival time of group D was longer than that of group B， but the difference was not statistically significant （P > 0.05）. Compared with group A， there was no significant difference in GM values between the groups on the third day of treatment （P > 0.05）. On the 7th day of treatment， the GM values of each treatment group were lower than those of group A （P < 0.01）， while group D was lower than group B （P < 0.05）. GMS staining of lung slices showed that the lesions of fungal infection decreased in all treatment groups， and the most significant reduction was found in group D. No lesions were found on the 15th day of treatment. Conclusion 17-AAG improves the efficacy of CAS in the treatment of IPA by inhibiting stress response.

[Key words] Aspergillus fumigatus； Caspofungin； 17-allyl-17 demethoxygeldemycin； Neutrophil deficiency

侵襲性肺曲霉菌?。↖PA）是嚴(yán)重的機(jī)會(huì)性感染性疾病。應(yīng)用免疫抑制劑以及中性粒細(xì)胞缺乏的患者是IPA的高危人群。美國感染病學(xué)會(huì)推薦伏立康唑作為IPA首選治療藥物。曲霉菌常常對伏立康唑耐藥，臨床常使用卡泊芬凈（CAS）作為補(bǔ)救治療方法[1-4]。CAS通過抑制真菌細(xì)胞壁1，3-β-D-葡聚糖的合成，抑制真菌的生長和分裂[5-6]。Cowen等[7]研究發(fā)現(xiàn)真菌可通過應(yīng)激反應(yīng)減輕抗真菌藥對細(xì)胞壁的損傷，推測阻斷細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)信號通路可能會(huì)提高抗真菌藥物的療效[8]。Hsp90是一種高度保守的分子伴侶，它能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和激活多種客戶蛋白并在細(xì)胞應(yīng)激通路中發(fā)揮重要的效應(yīng)，是最常見的調(diào)節(jié)因子[9]。在無脊椎動(dòng)物大蠟螟模型中，CAS與Hsp90抑制劑格爾得霉素合用可以使感染煙曲霉的幼蟲存活率顯著提高[9]。但目前尚不清楚其是否在哺乳動(dòng)物中也有效。為此，本研究制備了中性粒細(xì)胞缺乏IPA大鼠模型并給予CAS聯(lián)合17-烯丙基-17脫甲氧基格爾德霉素（17-AAG）治療，探討抑制Hsp90聯(lián)合CAS治療IPA的效果。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康雄性Wistar大鼠40只，購自濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司[生產(chǎn)許可號：SCXK（魯）20140007，合格證號：0000053]，5～6周齡，體重140～180 g，實(shí)驗(yàn)前1周飼養(yǎng)于濰坊醫(yī)學(xué)院動(dòng)物房內(nèi)，清潔恒溫環(huán)境，標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，自由取水。

1.2 試藥

煙曲霉菌株由濰坊醫(yī)學(xué)院檢驗(yàn)科提供。水合氯醛（上海國藥集團(tuán)）、環(huán)磷酰胺（江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司）、卡泊芬凈（CAS，上海源葉生物科技有限公司）、17-AAG（medchemexpress公司）、蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）、GMS染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）、曲霉菌酶免檢測試劑盒（合肥萊爾生物科技有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 煙曲霉孢子懸液制備 參考文獻(xiàn)[10-11]的方法，將煙曲霉菌菌株接種于沙氏瓊脂平板培養(yǎng)基上，37℃恒溫條件下培養(yǎng)7 d。用含有0.1%吐溫80的生理鹽水10 mL沖洗培養(yǎng)基表面，收集沖洗液并過濾，將孢子懸液1000 r/min離心10 min，并調(diào)整孢子濃度為1×105 cfu/mL。

1.3.2 制備中性粒細(xì)胞缺乏侵襲性煙曲霉感染大鼠模型 所有大鼠煙曲霉接種前4 d及接種前1 d腹腔注射環(huán)磷酰胺75 mg/kg，接種前1 d及接種后第4天采用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)中性粒細(xì)胞均<200×106/L，中性粒細(xì)胞缺乏IPA大鼠模型制備成功。造模成功后參考Havaux和Denis的方法[12-13]，腹腔注射給予10%的水合氯醛0.3 mL/100 g，麻醉大鼠，每側(cè)鼻孔各緩慢滴入50 μL煙曲霉孢子懸液。

1.3.3 分組 采用隨機(jī)數(shù)字表法將40只Wistar雄性大鼠分為4組，每組各10只：A組（空白對照）正常飼養(yǎng)，B組腹腔注射給予1 mg/kg CAS，C組腹腔注射給予1 mg/kg 17-AAG，D組腹腔注射給予17-AAG + CAS（用法、用量同上），均為1次/d，共治療10 d。

1.3.4 動(dòng)物標(biāo)本處理 接種真菌后第3天及第7天，將大鼠麻醉后固定，經(jīng)內(nèi)眥靜脈收集血液，3000 r/min離心10 min，留取血清，采用ELISA法測定半乳甘露聚糖抗原（GM），評估其中的真菌負(fù)荷，按說明書操作并根據(jù)試劑盒提供的標(biāo)準(zhǔn)閾值血清及換算公式計(jì)算出被檢血清的GM值。GM值=被檢樣品血清OD值/標(biāo)準(zhǔn)品血清OD值均值，GM<1為陰性，GM>1.5為陽性，1

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，繪制Kaplan-Meier生存曲線，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用q檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，用log秩檢驗(yàn)評估大鼠存活率的差異；計(jì)數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況

接受環(huán)磷酰胺免疫抑制后第2天，大鼠出現(xiàn)精神狀態(tài)不佳，飲食及活動(dòng)減少，毛色灰黃。經(jīng)鼻接種煙曲霉孢子懸液后，大鼠以上表現(xiàn)加劇，且出現(xiàn)眶周、鼻周帶血。治療7 d后，各組大鼠一般情況略有好轉(zhuǎn)，食欲增加，呼吸平穩(wěn)，生存時(shí)間延長。

2.2 大鼠生存期觀察

A組大鼠均在煙曲霉滴鼻后第3天至第8天死亡。與A組比較，C組存活率未提高（P = 0.27），B、D組存活率均在15 d后達(dá)到20%（P < 0.01）。其中，D組平均生存時(shí)間[（9.80±1.20）d]>B組[（8.8±1.06）d]>C組[（5.6±0.64）d]>A組[（4.7±0.52）d]，中位數(shù)平均生存時(shí)間D組（8 d）=B組（8 d）>C組（5 d）>A組（4 d）；與B組比較，D組大鼠的存活率沒有提高（P = 0.54），但D組大鼠平均生存時(shí)間延長。見圖1。

2.3 GM試驗(yàn)

接種煙曲霉后第3天，各治療組血清GM值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。接種后第7天，各組大鼠血清GM值均低于A組（P < 0.01），提示隨著治療時(shí)間的延長，對大鼠的治療效果逐漸明顯；與治療前比較，B、D組其療效呈時(shí)間依賴性的趨勢（P < 0.05），其中D組的GM值明顯低于B組（P < 0.05），提示聯(lián)合17-AAG可顯著提高CAS的治療效果。

2.4 肺組織GMS染色

本研究應(yīng)用GMS染色顯示大鼠肺內(nèi)的煙曲霉菌絲。GMS染色下真菌孢子呈明顯的黑褐色。煙曲霉滴鼻后第3、4天，各組均可發(fā)現(xiàn)煙曲霉菌絲，但在真菌負(fù)荷方面沒有明顯差異。曲霉滴鼻后第6、7天，各組肺組織發(fā)現(xiàn)真菌菌絲明顯增多，肺部感染嚴(yán)重。其中，D組菌絲少于其他各組。觀察至接種后第15天，僅B、D組有大鼠存活，B組有微量的煙曲霉感染灶，D組未發(fā)現(xiàn)煙曲霉感染。見圖2。

3 討論

IPA是一種由曲霉菌引起的疾病，極易危及免疫缺陷患者的生命安全[14-15]。由于IPA發(fā)病率和死亡率的增加及抗真菌藥物選擇的局限性，亟待開發(fā)新的IPA治療方法或藥物。近年來，抗癌藥物Hsp90抑制劑作為新的抗真菌治療靶點(diǎn)引起了人們的興趣[16]。Hsp90為一組進(jìn)化上高度保守的蛋白，在應(yīng)激條件下觸發(fā)適應(yīng)性反應(yīng)而發(fā)揮作用[17]。抑制真菌分子伴侶Hsp90的功能可以使耐藥病原菌對抗真菌藥物反應(yīng)更快，并能阻止其耐藥性的產(chǎn)生[8]。CAS通過抑制真菌細(xì)胞壁1，3-β-D-葡聚糖的合成而對真菌產(chǎn)生抑菌作用，細(xì)胞壁完整性的喪失誘發(fā)了真菌的急性應(yīng)激反應(yīng)[7]，Hsp90在其中起了關(guān)鍵作用[18-20]。由此推斷，抑制Hsp90在應(yīng)激狀態(tài)下的功能可以更好地發(fā)揮CAS的抗真菌作用。為此，本研究制備了中性粒細(xì)胞缺乏IPA模型大鼠，探討抑制應(yīng)激反應(yīng)對CAS治療大鼠IPA的效果影響。

本研究結(jié)果顯示，各治療組經(jīng)治療后病情都有緩解，其中聯(lián)合用藥效果最為顯著，且與CAS單藥治療比較，其平均生存時(shí)間延長。通過測定血清GM值顯示，與CAS單藥治療比較，聯(lián)合用藥GM值降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05），提示聯(lián)合用藥治療更為有效。同時(shí)本研究對大鼠肺組織的病理學(xué)檢測也顯示對照組、CAS組、17-AAG組的煙曲霉負(fù)荷高于聯(lián)合用藥組，提示了兩種藥物具有協(xié)同作用，抗真菌效果更強(qiáng)。

總之，17-AAG可以通過抑制應(yīng)激反應(yīng)提高CAS對大鼠IPA的療效，提示Hsp90抑制劑與抗真菌藥物的聯(lián)合可能為提高抗真菌治療效果開辟新的途徑，Hsp90可能成為煙曲霉感染治療的新靶點(diǎn)。

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（收稿日期：2018-08-23 本文編輯：王 蕾）