呂典一 武付霞 陳鳳儀

[摘要] 目的 探討miR-145下調(diào)靶基因ACVR1B促進(jìn)急性川崎?。↘D）的病理進(jìn)程。 方法 回顧性分析宜昌市第一人民醫(yī)院2015年11月～2018年6月收治的108例KD患兒的病歷資料，根據(jù)病情將其分為4組，KD急性組為確診的KD急性期患兒28例，KD康復(fù)組為同期入院進(jìn)行治療后康復(fù)期的兒童24例，發(fā)熱對照組為急性上呼吸道感染的發(fā)熱患兒30例，正常對照組為同期健康體檢者26名。分別抽取其血清檢查miR-145的表達(dá)水平。進(jìn)行靶基因數(shù)據(jù)庫、熒光素酶報告基因法、qRT-PCR及Western blot等相關(guān)檢驗。 結(jié)果 KD急性組白細(xì)胞計數(shù)、C反應(yīng)蛋白和紅細(xì)胞沉降率均顯著高于正常對照組（P < 0.05）；KD急性組血清miR-145水平顯著高于KD康復(fù)組、發(fā)熱對照組及正常對照組（P < 0.05）；發(fā)熱對照組血清中ACVR1B mRNA的表達(dá)水平顯著低于正常對照組（P < 0.05）；KD急性組血清中ACVR1B mRNA表達(dá)水平顯著低于正常對照組、發(fā)熱對照組和KD康復(fù)組（P < 0.05）。結(jié)論 miR-145可以結(jié)合ACVR1B的3′-UTR并抑制ACVR1B的表達(dá)，兩者的調(diào)控關(guān)系能促進(jìn)急性KD的病理發(fā)展。

[關(guān)鍵詞] miR-145；川崎??；靶基因ACVR1B；冠狀動脈內(nèi)皮細(xì)胞

[中圖分類號] R725.4 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2019）04（c）-0013-05

miR-145 promotes the pathological process of acute Kawasaki disease by downregulating the target gene ACVR1B

LYU Dianyi WU Fuxia CHEN Fengyi

Department of Pediatrics， Yichang First People′s Hospital， Hubei Province， Yichang 443000， China

[Abstract] Objective To investigate the effect of down-regulation of ACVR1B gene by miR-145 in promoting the pathological process of acute Kawasaki disease （KD）. Methods A total of 108 children who were treated in Yichang First People′s Hospital from November 2015 to June 2018 were included in the retrospective analysis， according to the disease conditions， children were divided into acute KD group （n = 28）， with a confirmed diagnosis of acute KD； KD recovery group （n = 24）， who was admitted to the hospital during the same period and in the recovery stage after treatment； pyrexia control group （n = 30）， who had pyrexia due to upper respiratory tract infection； and normal control group （n = 26）， who underwent physical examination during the same period. Serum was taken from the patients to check the expression level of miR-145. Target gene database was searched， and chemical-activated luciferase gene expression， qRT-PCR， and Western blot were performed. Results The white blood cell count， C-reactive protein， and erythrocyte sedimentation rate of acute KD group were significantly higher than the normal control group （P < 0.05）， the acute KD group had significantly higher expression of miR-145 in serum than the KD recovery group， the pyrexia control group， and the normal control group （P < 0.05）. The expression level of ACVR1B mRNA in serum of the fever control group was significantly lower than that of the normal control group （P < 0.05）. The expression level of ACVR1B mRNA in serum of the acute KD group was significantly lower than that of the normal control group， the fever control group and the KD rehabilitation group （P < 0.05）. Conclusion miR-145 can bind the 3′-UTR of ACVR1B and inhibit the expression of ACVR1B， and the regulatory relationship between miR-145 and ACVR1B can promote the pathological development of acute KD.

[Key words] miR-145； Kawasaki disease； Target gene ACVR1B； Coronary endothelial cells

川崎?。↘awasaki disease，KD）是一種常見的兒童自身免疫性血管炎綜合征，并發(fā)冠狀動脈瘤（CAA）和冠脈狹窄是青壯年猝死和心肌梗死發(fā)生的重要原因[1-2]。根據(jù)近期的研究顯示，兒童KD是成人缺血性心臟病發(fā)生的新增危險因素。目前，KD已取代風(fēng)濕熱成為兒童后天性心臟病的主要原因[3]。雖然靜脈輸注丙種球蛋白（IVIG）和阿斯匹林聯(lián)合治療方案廣泛應(yīng)用后，KD死亡率和冠狀動脈并發(fā)癥發(fā)生率明顯下降，但近年來發(fā)現(xiàn)IVIG治療耐藥病例增多，迄今病因及發(fā)病機(jī)制未明。因此，深入研究KD及其冠狀動脈損害發(fā)生發(fā)展的相關(guān)機(jī)制，做好預(yù)防工作，做到早發(fā)現(xiàn)、早治療將非常有助于降低KD及其冠狀動脈損害發(fā)病率及死亡率[4-5]。

本文通過研究miR-145及其靶基因?qū)跔顒用}內(nèi)皮細(xì)胞（HCAEC）功能影響，從而為明確miR-145及靶基因ACVR1B在KD冠狀動脈損害中可能的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)，所以深入研究miRNA與KD的關(guān)系，對認(rèn)識KD的發(fā)生和演進(jìn)、臨床診斷與治療有十分重要的意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

回顧性分析宜昌市第一人民醫(yī)院（以下簡稱“我院）2015年11月～2018年6月收治的108例患兒的病歷資料。根據(jù)病情狀況分為四組：KD急性組，我院收治的確診的KD急性期患兒28例；KD康復(fù)組，同期入住我院進(jìn)治療后康復(fù)期的兒童24例，選擇未發(fā)現(xiàn)器質(zhì)性疾病且血液相關(guān)實(shí)驗室檢查無異常及年齡、性別與KD患兒相匹配的兒童；正常對照組血標(biāo)本采集來自同期我院健康體檢兒童26名，選擇未發(fā)現(xiàn)器質(zhì)性疾病且血液相關(guān)實(shí)驗室檢查無異常及年齡、性別與KD患兒相匹配的兒童；發(fā)熱對照組血標(biāo)本采集自同期本醫(yī)院急性上呼吸道感染的發(fā)熱患兒30例，選擇未發(fā)現(xiàn)器質(zhì)性疾病且血液相關(guān)實(shí)驗室檢查無異常及年齡、性別與KD患兒相匹配的兒童。四組兒童的性別、年齡等一般資料比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05），具有可比性。見表1。

1.2 方法

1.2.1 血清采集 抽取所有對象的清晨空腹外周靜脈血：采用一次性血清分離膠管，抽取外周靜脈血約3 mL；待血清析出后以1000 g離心10 min，取上層血清保存至-80℃冰箱待檢測[6]。

1.2.2 qRT-PCR檢測血清miR-145和ACVR1B的表達(dá) 取0.5 mL血清標(biāo)本，采用Trizol法提取血清總RNA，實(shí)驗步驟按照Trizol試劑盒說明書進(jìn)行。將提取到的總RNA按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒的說明書進(jìn)行RNA逆轉(zhuǎn)錄，合成cDNA。按照qRT-PCR試劑盒說明書進(jìn)行進(jìn)行PCR反應(yīng)。

1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng) 取急性KD合并冠脈并發(fā)癥患兒的冠狀動脈組織標(biāo)本，0.25%胰蛋白酶消化，待細(xì)胞分散后，過濾收集HCAEC細(xì)胞。取HCAEC細(xì)胞，在含10%胎牛血清的培養(yǎng)基中于37℃，5%的CO2的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，再用2.5%的胰蛋白酶每2天進(jìn)行消化，傳代，并取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗。

1.2.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 取對數(shù)生長期HCAEC細(xì)胞（1～1.5）×106個分板，接種于6孔板中，置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細(xì)胞密度60%～70%時，將細(xì)胞分為3組：miR-145 mimics轉(zhuǎn)染組，轉(zhuǎn)染miR-145 mimics；miR-145 mimics+ACVR1B轉(zhuǎn)染組，轉(zhuǎn)染miR-145 mimics和ACVR1B；對照組，轉(zhuǎn)染negative control miRNA mimics （miR-NC）。將培養(yǎng)基換為無血清無雙抗的培養(yǎng)基，每孔1 mL，miRNA及轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000分別用100 μL OMEM稀釋后，依照說明書所需比例混勻后靜置20 min后，逐滴加入并且輕晃混勻，培養(yǎng)6 h后，再換為含完全培養(yǎng)基，待48 h后收集細(xì)胞進(jìn)行下一步分析。

1.2.5 熒光素酶報告基因法檢測miR-145與靶基因ACVR1B的結(jié)合 通過microRNA靶基因數(shù)據(jù)庫進(jìn)行篩選，預(yù)測ACVR1B為miR-145的潛在靶基因（圖1）。構(gòu)建ACVR1B野生型3′-UTR熒光素酶報告基因質(zhì)粒pMIR-ACVR1B-wt，并以pMIR-ACVR1B-wt質(zhì)粒為模板，利用PCR搭橋法（overlapping PCR）構(gòu)建其潛在結(jié)合位點(diǎn)突變型報告基因質(zhì)粒pMIR-ACVR1B-Mut。將miR-145 mimics，negative control miRNA mimics（miR-NC）內(nèi)參海腎熒光素酶以及pMIR-ACVR1B-wt和pMIR-ACVR1B-Mut報告基因質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染進(jìn)HCAEC細(xì)胞中，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h后收取細(xì)胞液，使用雙熒光素酶報告基因試劑盒測定熒光素酶活性。

1.2.6 Western blot 采用含50 mmol/L Tris-HCl（pH 7.4），150 mmonl/L NaCl，0.5%脫氧膽酸鈉，0.1% SDS和蛋白酶抑制劑及1 mmonl/L苯甲基磺酰氟的RIPA裂解液分離蛋白質(zhì)。通過SDS-PAGE凝膠進(jìn)行電泳，按說明書進(jìn)行Western blot實(shí)驗。

1.2.7 CCK8檢測細(xì)胞增殖 取對數(shù)生長期HCAEC細(xì)胞，以1×105/mL接種于96孔培養(yǎng)板，每孔培養(yǎng)基200 μL，每組6個復(fù)孔。在37℃條件下培養(yǎng)，進(jìn)過48 h后每孔加入200 μL CCK-8持續(xù)培養(yǎng)2 h。使用酶標(biāo)儀檢測各孔在450 nm處吸光度數(shù)值。

1.2.8 流式細(xì)胞法檢測細(xì)胞周期 懸浮并收集不同時間點(diǎn)細(xì)胞，生理鹽水沖洗細(xì)胞兩遍，70%乙醇固定細(xì)胞。加入碘化丙啶DNA熒光染色（propidium iodide，PI：50 mg/L，1% Triton X-100），4℃冰箱避光染色30 min，銅網(wǎng)過濾，使樣本成為合格的單細(xì)胞懸液，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期[7]。

1.2.9 Transwell遷移實(shí)驗檢測細(xì)胞遷移能力 采用24孔Transwell小室檢測細(xì)胞的遷移能力，在下層小室加入含10% FBS的RPMI1640完全培養(yǎng)基，在上層小室加入處于對數(shù)生長期HCAEC細(xì)胞，將Transwell小室置37℃，5%CO2孵箱培養(yǎng)，24 h后，取出侵襲小室，用甲醇固定20 min，采用結(jié)晶紫染色，在顯微鏡下觀察并計數(shù)貼在濾膜反面的所有細(xì)胞，選取代表性視野拍照。實(shí)驗重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用方差分析，兩組間比較采用t檢驗，方差非齊性的兩組比較采用非參數(shù)檢驗；計數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗；采用Pearson進(jìn)行相關(guān)性分析。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-145、ACVR1B在KD患兒血清中的表達(dá)關(guān)系

KD急性組患兒的WBC、CRP和ECP均高于正常對照組（均P < 0.05），見表2。qRT-PCR檢測結(jié)果顯示：KD急性組血清中miR-145較KD康復(fù)組、發(fā)熱對照組、正常對照組顯著升高（均P < 0.05），見圖2。KD康復(fù)組與正常對照組血清中ACVR1B mRNA的表達(dá)水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）；與正常對照組比較，發(fā)熱對照組血清中ACVR1B mRNA的表達(dá)水平顯著降低（P < 0.05）；KD急性組血清中ACVR1B mRNA表達(dá)水平顯著低于正常對照組、發(fā)熱對照組和KD康復(fù)組（P < 0.05），見圖3。

2.2 miR-145的靶基因及相關(guān)靶向調(diào)控關(guān)系檢測

雙熒光素酶檢測結(jié)果顯示，miR-145 mimics組的pMIR-ACVR1B-wt質(zhì)粒熒光素酶活性明顯低于miR-NC組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）；而兩組的pMIR-ACVR1B-Mut熒光素酶活性差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。說明miR-145 mimics可顯著抑制pMIR-ACVR1B-wt質(zhì)粒熒光素酶活性；而對pMIR-ACVR1B-Mut熒光素酶活性無明顯影響（圖4A）。為進(jìn)一步驗證miR-145對ACVR1B的調(diào)控作用，qRT-PCR檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-145 mimics轉(zhuǎn)染組中ACVR1B的mRNA表達(dá)水平顯著低于對照組（圖4B）；Western blot檢測結(jié)果顯示，miR-145 mimics轉(zhuǎn)染組ACVR1B蛋白表達(dá)灰度值為（0.86±0.05），明顯高于miR-NC組ACVR1B蛋白表達(dá)灰度值（0.41±0.03），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）?？梢姡啾葘φ战M，miR-145 mimics轉(zhuǎn)染組中ACVR1B蛋白表達(dá)水平顯著降低（圖4C）。

2.3 miR-145與ACVR1B調(diào)控HCAEC細(xì)胞增殖、遷移及周期的相關(guān)影響

CCK8實(shí)驗結(jié)果顯示，miR-145 mimics轉(zhuǎn)染組的OD值顯著高于對照組（miR-NC）（P < 0.05），而miR-145 mimics+ACVR1B轉(zhuǎn)染組的OD值顯著低于miR-145 mimics轉(zhuǎn)染組（P < 0.05），見圖5A。流式細(xì)胞法檢測結(jié)果顯示，miR-145 mimics轉(zhuǎn)染組S期細(xì)胞比值顯著高于對照組（P < 0.05），而miR-145 mimics+ACVR1B轉(zhuǎn)染組S期細(xì)胞比值顯著低于miR-145 mimics轉(zhuǎn)染組（P < 0.05），見圖5B。Tranwell遷移實(shí)驗顯示，miR-145 mimics轉(zhuǎn)染組細(xì)胞遷移效果顯著高于對照組（P < 0.05），而miR-145 mimics+ACVR1B轉(zhuǎn)染組細(xì)胞遷移效果顯著低于miR-145 mimics轉(zhuǎn)染組（P < 0.05），見圖4C。

3 討論

KD是一種以全身血管炎為主要病變的急性發(fā)熱出疹性疾病，在歐美等發(fā)達(dá)國家KD已取代風(fēng)濕熱成為兒童后天獲得性心臟病的首位病因。KD急性期各種免疫細(xì)胞被激活，從而促進(jìn)多種炎癥因子基因的表達(dá)，而T細(xì)胞介導(dǎo)的異常免疫應(yīng)答及細(xì)胞因子的級聯(lián)放大效應(yīng)導(dǎo)致血管內(nèi)皮功能障礙是KD血管炎性損傷的基礎(chǔ)[8-9]。

miRNA是一類長約22nt的非編碼單鏈RNA分子，其可通過與靶mRNA結(jié)合抑制靶mRNA的剪切或翻譯[10]。miRNA對基因表達(dá)的調(diào)控作用涉及到生物體生長發(fā)育的諸多過程，包括發(fā)育時序的控制，細(xì)胞的生長、分化、增殖、凋亡等，其在致病機(jī)制的研究、疾病的診斷和治療方面的重要性越來越受到人們的關(guān)注[11-14]。既往研究發(fā)現(xiàn)，多種miRNA與炎癥細(xì)胞分化發(fā)育、炎性因子的調(diào)控、血管炎性損害相關(guān)[15]。miRNA可以反映心臟和血管對損傷的易感性及哺乳動物對于持久心血管功能的依賴性[16]。一項對心血管疾病小鼠模型和人類活檢標(biāo)本miRNA的分析結(jié)果表明，miRNA的標(biāo)記模式可用于診斷多種心血管疾病，包括心力衰竭、心肌梗死局部缺血等[17]。本研究使用qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，KD急性組血清中miR-145表達(dá)水平較KD康復(fù)組、發(fā)熱對照組、正常對照組顯著升高，提示miR-145對急性KD有促進(jìn)作用。

TGF-β超家族成員通過參與細(xì)胞增殖、分化、黏附、遷移、凋亡等過程，在維持機(jī)體穩(wěn)定方面起著至關(guān)重要的作用[18]，TGF-βⅠ型受體又稱激活素受體類似激酶（ALK），是TGF-β信號通路的核心分子。研究表明，TGF-β信號通路最主要的作用是抑制細(xì)胞生長[19]。TGF-βⅠ型受體與不同的TGF-βⅡ型受體結(jié)合可介導(dǎo)不同配體產(chǎn)生不同信號，有研究表示TGF-β不僅能與ALK5結(jié)合還能與ALKl結(jié)合，AMH能與ALK2、ALK6結(jié)合[20]。ACVR1B是一種TGF-βⅠ型受體，但ACVR1B基因與急性KD相關(guān)性研究未見報道，所以深入研究靶基因ACVR1B在急性KD中的影響，將為理解KD的發(fā)生發(fā)展及尋找KD治療性靶標(biāo)提供理論線索與實(shí)驗依據(jù)。本研究結(jié)果顯示，KD急性組血清中ACVR1B的mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著低于正常對照組、發(fā)熱對照組和KD康復(fù)組，提示miR-145對急性KD有抑制作用。

本研究結(jié)果還顯示，miR-145 mimics可顯著抑制pMIR-ACVR1B-wt質(zhì)粒熒光素酶活性；而對pMIR-ACVR1B-Mut熒光素酶活性無明顯影響。提示miR-145可以通過結(jié)合ACVR1B的3′-UTR進(jìn)而抑制ACVR1B的表達(dá)。miR-145 mimics轉(zhuǎn)染組的OD值、S期細(xì)胞比值、細(xì)胞遷移能力顯著高于對照組（P < 0.05），miR-145 mimics+ACVR1B轉(zhuǎn)染組的OD值、S期細(xì)胞比值、細(xì)胞遷移能力顯著低于miR-145 mimics轉(zhuǎn)染組（P < 0.05），提示miR-145可促進(jìn)急性KD HUVEC細(xì)胞增殖，遷移和細(xì)胞周期在S期聚集，但這種促進(jìn)效果會被ACVR1B過表達(dá)逆轉(zhuǎn)。

綜上所述，miR-145可促進(jìn)急性KD的冠狀動脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移及周期在S期的聚集，而這些抑制效果可被ACVR1B抑制及補(bǔ)回，而miR-145可以結(jié)合ACVR1B的3′-UTR并抑制ACVR1B的表達(dá)，促進(jìn)急性KD的發(fā)展。因此，miR-145及ACVR1B可能成為急性KD診斷及治療的新靶點(diǎn)。

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（收稿日期：2018-08-07 本文編輯：任 念）