慎 慧， 郭 建， 張 旻， 孔雯娜， 肖晶晶， 吳文娟， 劉 云， 陳險峰， 謝瀲滟，湯 榮， 董郭平， 李 莉， 孫 燕， 李 敏， 徐陽飏0，張靜華，黃聲雷，奚 衛(wèi)，蔡金鳳，陳祝俊，李 麗，秦惠宏， 舒 文， 曹文俊，王愛敏，衛(wèi)穎玨， 黃衛(wèi)春，張雯雁， 趙 虎，袁軼群0，沈振華，房 華

近年來臨床上免疫功能低下人群逐年增多，侵襲性真菌感染的發(fā)生率明顯上升，其中常見致病真菌包括念珠菌屬、新型隱球菌和曲霉屬感染的年發(fā)病率已經(jīng)達(dá)到萬分之一以上，念珠菌感染的發(fā)生率已經(jīng)升至醫(yī)院感染的第4位[1-5]。侵襲性真菌感染由于缺乏可靠有效的早期診療方法，病死率居高不下，念珠菌血癥的病死率高達(dá)40%，侵襲性曲霉感染未能及時診療的病死率高達(dá)90%以上，已經(jīng)成為嚴(yán)重威脅人類健康的感染性疾病[6-8]。

隨著抗真菌藥物尤其是唑類抗真菌藥物如氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑等在臨床上的大量、廣泛使用，真菌耐藥現(xiàn)象日趨嚴(yán)重；有些真菌如克柔念珠菌等天然耐藥；真菌有高適應(yīng)性特點，在體內(nèi)形成生物被膜、轉(zhuǎn)變成菌絲后也會高度耐藥，耐藥性成為侵襲性真菌感染治療失敗的主要原因之一[9-11]。尤其是近年來“超級真菌” 耳念珠菌的出現(xiàn)，引起了全世界臨床和基礎(chǔ)研究的科學(xué)家及疾病防控部門的高度關(guān)注[12-13]。

為了實時、動態(tài)監(jiān)測上海地區(qū)醫(yī)院侵襲性真菌感染病原菌的分離情況以及抗真菌藥物的耐藥性，2017年6月上海市衛(wèi)計委成立了真菌耐藥監(jiān)測工作組，由東方醫(yī)院作為組長單位，全市27所醫(yī)院（16所三甲綜合性醫(yī)院，8所三甲?？漆t(yī)院，3所二級醫(yī)院）作為成員單位。本研究對上海市真菌耐藥監(jiān)測工作組2017年8月-2018年4月上海地區(qū)臨床分離念珠菌進(jìn)行了分離鑒定和耐藥性監(jiān)測，了解臨床分離念珠菌對常用抗真菌藥物的敏感率和耐藥率，引起臨床醫(yī)師對臨床分離念珠菌及抗真菌藥物合理應(yīng)用的重視，為臨床有效診斷、治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株收集 收集2017年8月1日-2018年4月30日上海地區(qū)27所醫(yī)院臨床分離念珠菌屬菌株，剔除同一患者分離出的重復(fù)菌株。同一患者不同時間同類標(biāo)本，只對初次分離菌株進(jìn)行分析。所有標(biāo)本來自于患者的無菌體液，包括血液、腦脊液、穿刺液及組織等以及非無菌體液如支氣管肺泡灌洗液（BALF）、膿液、引流液、導(dǎo)管、分泌物、透析液等。

1.1.2 試劑和儀器 沙氏葡萄糖蛋白胨瓊脂平皿、真菌藥敏接種肉湯、去離子水、藥敏板（YeastOne plate）、0.5 McFarland 濁度標(biāo)準(zhǔn)品、比濁儀、Sensititre AIM加樣器、SensititreVizion讀板儀、Sensititre一次性加樣頭，均為Thermo Fisher公司商 品。

1.2 方法

1.2.1 菌株鑒定 嚴(yán)格按照《全國臨床檢驗操作規(guī)程》（第4版）[14]進(jìn)行，分離的真菌菌株接種至科瑪嘉顯色培養(yǎng)基或沙堡弱真菌培養(yǎng)基，根據(jù)生長菌落的顏色，結(jié)合VITEK 2-Compact YST卡或質(zhì)譜進(jìn)行初步鑒定。中心實驗室（上海市東方醫(yī)院南院檢驗科）對所有菌株均采用質(zhì)譜鑒定復(fù)核，不一致者使用真菌ITS DNA序列分析確認(rèn)。

1.2.2 藥敏試驗 采用比色微量稀釋法（Sensititer Yeast one，Thermo Fisher公司），每塊藥敏板都包被有適當(dāng)濃度的抗真菌藥物和顯色劑。藥物包含三唑類藥物氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑、泊沙康唑，棘白菌素類藥物卡泊芬凈、阿尼芬凈、米卡芬凈以及5-氟胞嘧啶和兩性霉素B。藥敏板在35 ℃真菌培養(yǎng)箱內(nèi)孵育24～25 h。24 h培養(yǎng)后檢查陽性對照生長微孔。如果生長對照孔呈紅色，則為試驗終點；如果生長對照孔仍然是藍(lán)色或只有輕微紫色，則再培養(yǎng)24 h，檢查是否有菌生長。通過配套儀器觀測表現(xiàn)為生長抑制的最低抗真菌藥物濃度即為最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）。質(zhì)控菌株為近平滑念珠菌ATCC 22019和克柔念珠菌 ATCC 6258。

1.2.2 判斷標(biāo)準(zhǔn) 參照2017年美國臨床和實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會（CLSI）M60文件：酵母抗真菌藥物敏感試驗操作標(biāo)準(zhǔn)（Performance Standards for Antifungal Susceptibility Testing of Yeasts）。

2 結(jié)果

2.1 菌株分布

2017年8月-2018年4月共收集上海市27所醫(yī)院臨床分離念珠菌共354株，其中4所兒童?？漆t(yī)院的臨床分離株占11.58%（41/354）。標(biāo)本主要來自實體腫瘤患者（34.18%）、重癥監(jiān)護(hù)患者（24.58%）、胃腸道手術(shù)患者（13.84%）。所有標(biāo)本來自患者的無菌體液如血液、腦脊液、穿刺液及組織等，以及非無菌體液如BALF、膿液、引流液、導(dǎo)管、分泌物、透析液等。標(biāo)本分布為血液47.46%（168/354）、胸腹水11.02%（39/354）、膽汁9.60%（34/354）、引流液7.63%（27/354）、BALF 6.50%（23/354）、導(dǎo)管5.08%（18/354）、分泌物3.11%（11/354）、穿刺液2.26%（8/354）、膿液2.26%（8/354）、透析液1.69%（6/354）、腦脊液1.41%（5/354）、組織0.56%（2/354）、關(guān)節(jié)液0.56%（2/354）和其他體液0.85%（3/354）。臨床分離念珠菌菌種標(biāo)本類型分布見表1。

表1 臨床分離念珠菌菌種標(biāo)本類型分布及構(gòu)成比Table 1 Distribution of clinical Candida isolates in Shanghai by specimen type

所有臨床分離念珠菌菌種分布見表2。其中，腦脊液標(biāo)本分離的5株念珠菌分別是2株白念珠菌、2株熱帶念珠菌和1株近平滑念珠菌；組織標(biāo)本中分離的2株念珠菌分別為白念珠菌和近平滑念珠菌。

4所兒童?？漆t(yī)院的41株臨床分離念珠菌中包含近平滑念珠菌、白念珠菌、熱帶念珠菌、光滑念珠菌和季也蒙念珠菌，分別占56.10%、24.39%、9.76%、2.44%、7.32%。本研究顯示，與綜合性醫(yī)院相比，兒童醫(yī)院的臨床分離念珠菌中近平滑念珠菌數(shù)量多于白念珠菌。

2.2 念珠菌屬對抗真菌藥物的敏感率和耐藥率

2.2.1 白念珠菌 27所醫(yī)院分離的148株白念珠菌對氟康唑的敏感率為94.20%，劑量依賴性敏感（SDD）率 4.35%，耐藥率1.45%；對伏立康唑的敏感率為95.65%，中介率2.17%，耐藥率2.17%。白念珠菌對卡泊芬凈、阿尼芬凈、米卡芬凈的敏感率為100%（表3）。血液標(biāo)本中共分離45株白念珠菌，對氟康唑的敏感率為93.34%，SDD率4.44%，耐藥率2.22%；對伏立康唑的敏感率為91.12%，中介率6.66%，耐藥率2.22%；對卡泊芬凈、阿尼芬凈、米卡芬凈的敏感率為100%（表4）。兒童?？漆t(yī)院分離的10株白念珠菌對氟康唑的敏感率為90.00%，SDD率10.00%；對伏立康唑的敏感率為90.00%，中介率10.00%；對卡泊芬凈、米卡芬凈、米卡芬凈的敏感率均為100%，與綜合性醫(yī)院相比其藥物敏感率無明顯差異。

表2 臨床分離念珠菌菌種分布及構(gòu)成比Table 2 Distribution of clinical Candida isolates in Shanghai by species

表3 上海市臨床分離白念珠菌對臨床常用抗真菌藥物的敏感率和耐藥率Table 3 Susceptibility of clinical Candida albicans isolates to antifungal agents in Shanghai

2.2.2 近平滑念珠菌 27所醫(yī)院分離的84株近平滑念珠菌對氟康唑的敏感率為98.80%，SDD 率1.2%；對伏立康唑的敏感率為98.80%，中介率1.2%。近平滑念珠菌對卡泊芬凈、米卡芬凈、阿尼芬凈的敏感率均為100%（表5）。4所兒童?？漆t(yī)院分離的23株近平滑念珠菌對氟康唑的敏感率為95.65%，SDD率4.35%；對伏立康唑的敏感率為95.65%，中介率4.35%；對卡泊芬凈、米卡芬凈、阿尼芬凈的敏感率為100%，與綜合性醫(yī)院相比其藥物敏感率無明顯差異。

表4 血液標(biāo)本分離白念珠菌對臨床常用抗真菌藥物的敏感率和耐藥率Table 4 Antifungal susceptibility of the clinical Candida albicans strains isolated from blood in Shanghai

表5 臨床分離近平滑念珠菌對臨床常用抗真菌藥物的敏感率和耐藥率Table 5 Susceptibility of clinical Candida parapsilosis isolates to antifungal agents in Shanghai

2.2.3 熱帶念珠菌 27所醫(yī)院分離的55株熱帶念珠菌對氟康唑的敏感率為45.45%，SDD率12.73%，耐藥率41.82%；對伏立康唑的敏感率為47.27%，中介率12.73%，耐藥率40.00%。熱帶念珠菌對卡泊芬凈、米卡芬凈、阿尼芬凈的敏感率均為100%（表 6）。

2.2.4 光滑念珠菌 27所醫(yī)院分離的33株光滑念珠菌對氟康唑的SDD率93.94%，耐藥率6.06%。光滑念珠菌對阿尼芬凈、米卡芬凈的敏感率為100%，對卡泊芬凈的敏感率為96.97%、耐藥率3.03%（表7）。

由于目前CLSI尚未給出泊沙康唑、伊曲康唑、兩性霉素B、氟胞嘧啶對念珠菌屬的藥敏折點，所以無法判斷該藥的敏感率和耐藥率，在此僅統(tǒng)計了這4種藥物的MIC50和MIC90值（表3～表 7）。

3 討論

近年來侵襲性真菌感染發(fā)生率逐年上升，臨床上可用于侵襲性真菌感染的藥物品種較少，同時由于缺乏早期快速診斷技術(shù)導(dǎo)致了大量預(yù)防性或者經(jīng)驗用藥，使得真菌耐藥日益嚴(yán)重，已經(jīng)成為治療失敗的主要原因之一[9-11]。其中念珠菌是最常見的臨床致病真菌，念珠菌感染的發(fā)生率已經(jīng)升至醫(yī)院感染的第四位[5，10]。

表6 臨床分離熱帶念珠菌對臨床常用抗真菌藥物的敏感率和耐藥率Table 6 Susceptibility of clinical Candida tropicalis strains isolated from invasive fungal infection to antifungal agents in Shanghai

表7 臨床分離光滑念珠菌對臨床常用抗真菌藥物的敏感率和耐藥率Table 7 Susceptibility of clinical Candida glabrata isolates to antifungal agents in Shanghai

為了掌握上海市臨床真菌感染病原學(xué)及耐藥狀況，2017年5月上海市細(xì)菌耐藥監(jiān)測網(wǎng)更名為上海市細(xì)菌真菌耐藥監(jiān)測網(wǎng)，增設(shè)真菌耐藥監(jiān)測工作組，由同濟(jì)大學(xué)附屬東方醫(yī)院為組長單位，上海地區(qū)27所醫(yī)院為組員單位（含16所三甲綜合性醫(yī)院，8所三甲專科醫(yī)院，3所二級醫(yī)院）。真菌耐藥監(jiān)測工作組于2017年8月正式啟動工作，組長單位每月對27所成員單位臨床診斷侵襲性真菌感染病例分離菌株進(jìn)行收集，并監(jiān)測抗真菌藥物敏感性，為真菌感染合理診治提供依據(jù)。

2017年8月-2018年4月共收集上海市27所醫(yī)院侵襲性真菌感染臨床分離念珠菌屬共354株，血液標(biāo)本分離念珠菌占第一位（47.46%），標(biāo)本主要來源于實體腫瘤患者、重癥監(jiān)護(hù)患者和胃腸道術(shù)后患者，表明接受侵襲性操作、屏障破壞和免疫受損者易感性高。文獻(xiàn)研究提示，醫(yī)院內(nèi)重癥監(jiān)護(hù)患者使用呼吸機(jī)和中心靜脈導(dǎo)管可能是侵襲性念珠菌感染的主要危險因素；腫瘤化療患者存在免疫功能低下和腸黏膜損傷，可導(dǎo)致腸道內(nèi)共生的念珠菌跨過腸黏膜屏障，形成侵襲性感染；胃腸道手術(shù)后使得腸壁損傷，也可導(dǎo)致腸道內(nèi)共生的念珠菌跨過腸黏膜屏障，形成侵襲性感染 [15-17]。

本研究臨床分離念珠菌中分離率最高的仍然是白念珠菌（41.81%），Xiao等[18]報道了我國2009-2014年醫(yī)院內(nèi)白念珠菌在念珠菌中分離率為44.9%，說明上海地區(qū)醫(yī)院內(nèi)白念珠菌分離率基本與全國整體水平一致。近年來相關(guān)文獻(xiàn)報道，非白念珠菌分離率有上升趨勢，應(yīng)該引起臨床醫(yī)師的重視[19-21]。本研究中非白念珠菌中以近平滑念珠菌、熱帶念珠菌和光滑念珠菌為主（48.59%），其余念珠菌如克柔念珠菌、擬平滑念珠菌等分離率為9.6%，總體分離率基本上也與國內(nèi)外報道情況一致[2-3，18]。

白念珠菌是最常見的臨床致病真菌，與Yang等[22]報道2008-2012年上海瑞金醫(yī)院分離侵襲性白念珠菌耐藥率相比，本研究顯示上海地區(qū)臨床分離白念珠菌對氟康唑（1.45%對7%）和伏立康唑（2.17%對4.7%）的耐藥率略有下降，可能與目前棘白菌素類抗真菌藥物使用增加、唑類藥物使用量減少有關(guān)，但是耐藥率仍然略高于全國水平[18]；對于伏立康唑，白念珠菌的耐藥率基本平穩(wěn)。近年來IDSA臨床指南[23]已將新型棘白菌素類藥物列入念珠菌血癥的初始用藥（強(qiáng)烈推薦），本研究顯示目前上海地區(qū)分離白念珠菌尚未出現(xiàn)耐藥株。

近年來非白念珠菌分離率有上升趨勢，本研究中發(fā)現(xiàn)上海地區(qū)侵襲性非白念珠菌中以近平滑念珠菌、熱帶念珠菌和光滑念珠菌為主。本研究中近平滑念珠菌分離率在非白念珠菌分離率占比最高，其對唑類藥物的耐藥率低于白念珠菌，同時低于上海瑞金醫(yī)院2008-2012年唑類藥物耐藥率[22]。本研究中93.94%光滑念珠菌對氟康唑?qū)儆赟DD，僅1株光滑念珠菌對卡泊芬凈耐藥，對其他藥物的敏感性情況基本上與白念珠菌一致。值得注意的是，熱帶念珠菌對唑類藥物的耐藥率與上海瑞金醫(yī)院2008-2012年分離菌株耐藥率相比顯著上升，對氟康唑和伏立康唑的耐藥率達(dá)到40%，顯著高于Xiao等[18]在中國侵襲性真菌監(jiān)測研究中的報道，需要引起臨床及檢驗科醫(yī)師的高度重 視。

綜上所述，醫(yī)院獲得性感染的重要病原真菌的發(fā)生發(fā)展是由于抗真菌藥物選擇性壓力、耐藥基因水平傳播和耐藥克隆菌株傳播共同作用的結(jié)果。不同的臨床分離念珠菌對常見抗真菌藥物的耐藥性呈現(xiàn)差異，了解藥物的敏感性，能夠促進(jìn)臨床醫(yī)師對侵襲性念珠菌感染和抗真菌藥物合理應(yīng)用的重視，為臨床有效診斷、治療侵襲性真菌病提供依據(jù)。