陳明水 李潔羽 陳淑萍 葉韻斌

(福建省腫瘤醫(yī)院，福州350014)

樹突細胞(Dendritic cells,DC)腫瘤疫苗在腫瘤免疫治療中起重要作用，DC是體內(nèi)功能最強的專職性抗原提呈細胞,在抗感染及抗腫瘤免疫中具有獨特的地位。佐劑在疫苗中被認為是起到存儲抗原的作用,同時也能影響抗原遞呈細胞。DC在體內(nèi)的生物學(xué)功能受多種因素影響，調(diào)節(jié)DC的成熟狀態(tài)能影響樹突狀細胞的免疫效應(yīng)[1,2]。用納米微粒(Nanoparticle,NP)為載體包載腫瘤抗原和佐劑刺激DC細胞能產(chǎn)生更有效的免疫應(yīng)答[3,4]，在這些研究中DC細胞除了攝取抗原和佐劑之外，DC細胞也能攝取納米微粒，因此納米微粒能影響DC的遞呈抗原作用。聚乳酸-羥基乙酸共聚物是由乳酸和羥基乙酸聚合而成一種可降解的高分子有機化合物，由于其具有優(yōu)良的生物相容性和生物可降解性在醫(yī)藥生物領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，本研究探討PLGA納米微粒對DC細胞表型和功能的影響，并探討其裝載抗原肽負載DC細胞誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的作用，為基于PLGA納米微粒的抗腫瘤作用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1主要試劑與儀器 聚乳酸-羧基乙酸[poly(D.L-lactide-co-glycolide)，PLGA](MW 23 000 50∶50)、聚乙烯醇PVA(Polyvingl acetate)購自山東岱罡公司；二氯甲烷(Dichloromethane，DCM)、香豆素-6(Coumarin-6)購自Sigma公司；粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(Granulocyte-macrophage colony stimulating factor,GM-CSF)購自BD公司；IL-4購自Perprotech公司；ELISPOT檢測試劑盒購自R&D公司。T2細胞、TIL1520細胞購自ATCC；黑色素瘤抗原肽gp100-154-162(KTWGQYWQV)由GenScript Corp公司合成，用HPLC分析其純度>95%，用DMSO溶解，-20℃保存；抗人IFN-γ購自Mabtech公司；鼠抗人抗體：HLA-DR-PE、CD83-PE、CD80-PE、CD86-PE,相應(yīng)的同型對照：IgG2a-PE、IgG1-PE 購自BD Pharmingen公司；掃描電鏡為FEI公司產(chǎn)品；NanoPlus為麥克儀器公司產(chǎn)品；超聲粉碎儀為寧波新藝公司產(chǎn)品；磁力加熱攪拌器為上海司樂儀器有限公司產(chǎn)品；酶標(biāo)儀為Thermos公司產(chǎn)品；低溫高速冷凍離心機購自HITACHI公司。

1.2方法

1.2.1DC的誘導(dǎo)及鑒定 抽取外周抗凝血，用淋巴細胞分離液分離PBMC，用DC培養(yǎng)液調(diào)細胞濃度1×106ml-1，接種在6孔細胞培養(yǎng)板，3 ml/孔，貼壁2 h，用PBS洗去未貼壁的細胞然后加入DC培養(yǎng)液及GM-CSF、IL-4，37℃、5%CO2溫箱孵育，此后隔天換液并加GM-CSF、IL-4，在第7天加入TNF-α，48 h后收集成熟的DC，流式細胞儀檢測DC表型。

1.2.2納米微粒制備與表征 稱取30 mg PLGA溶于1.5 ml CHCl2中，加入事先與BSA混合的抗原肽(gp100-154-162)，在4℃ 55 W電壓下超聲9 s、間歇3 s、共3 min，加入2%PVA溶液6 ml，超聲同上，即制得納米-抗原肽懸液，將此懸液放通風(fēng)櫥中磁珠攪拌過夜，然后在4℃ 12 000 r/min離心30 min，洗滌3次，以去除游離的抗原肽，最后一次離心沉淀物用雙蒸水溶解，低溫冷凍干燥器中干燥24 h 即制得納米-抗原肽微粒。用同樣方法制備含有香豆素-6的納米微粒(NP-C6)和空白納米微粒。用掃描電鏡、NanoPlus納米粒度分析儀檢測納米微粒的表征。

1.2.3納米微粒包載抗原肽檢測 取上述離心、洗滌的上清液，用HPLC測定抗原肽的含量。以含10%乙腈和0.1%三氟乙酸水溶液為流動相，設(shè)定柱溫為30℃，進樣量10 μl，以0.8 ml/min的固定流速在12 min內(nèi)洗脫樣品。HPLC檢測上清液中抗原肽含量,包載入納米微粒的抗原肽=加入的抗原肽量-上清液抗原肽量。

1.2.4DC攝取納米微粒 取0.5 ml濃度為1×106個/ml上述誘導(dǎo)的DC細胞接種于6孔細胞培養(yǎng)板，加入一定量的NP-C6，孵育24 h后收集細胞，用預(yù)冷的FACS緩沖液洗滌2遍，去除未被攝取的納米微粒，用FACS緩沖液重懸DC，流式細胞儀檢測DC/NP-C6細胞平均熒光強度(MFI)，用以檢測DC攝取納米微粒。另吸取一定量的DC/NP-C6細胞用4%PFA固定，洗滌，再用DAPI染色，用共聚焦顯微鏡觀察DC細胞攝取納米微粒的情況。

1.2.5負載納米微粒后DC表型檢測(DC/NPs表型分析) 將外周血PBMC誘導(dǎo)的imDC在第7天加入空載納米微粒CNP，5%CO2、37℃孵育12 h后加入TNF-α，繼續(xù)培養(yǎng)至第9天收獲細胞；用HLA-DR-PE、CD83-PE、CD80-PE、CD86-PE熒光標(biāo)記抗體染色。使用TNF-α刺激后的DC作為對照，流式細胞儀檢測DC表型：HLA-DR、CD80、CD83、CD86。

1.2.6負載納米微粒的DC刺激同種異體淋巴細胞增殖反應(yīng) 將上述誘導(dǎo)的DC/CNP及單純DC，加入絲裂霉素C(25 μg/ml),37℃水浴30 min,滅活作為刺激細胞，淋巴細胞作為效應(yīng)細胞。刺激細胞加入量為1×104/孔，刺激細胞與效應(yīng)細胞之比為1∶5，加入96孔培養(yǎng)板中。實驗分組為：①空白組：加培養(yǎng)液；②對照組：淋巴細胞；③實驗組：NP+淋巴細胞、DC+淋巴細胞、DC/NP+淋巴細胞。每組各3個復(fù)孔，于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d，每孔棄去110 μl上清，加入 MTT 10 μl,孵育4 h，每孔加入DMSO 110 μl，490 nm波長測OD值,計算各組刺激指數(shù)(SI)。SI=(實驗組OD值-空白組OD值)/(對照組OD值-空白組OD值)。

1.2.7納米微粒對DC遞呈抗原作用的影響 誘導(dǎo)培養(yǎng)的imDC分成兩組，第一組在第5天時加入100 μg/ml 的NP/gp100-154-162，5%CO2、37℃孵育1 h，加入TNF-α 1 000 U/ml，繼續(xù)培養(yǎng)至2 d收獲細胞，記為DC1/NP-gp100-154-162；第二組在第5天時加入NP-gp100-154-162、5%CO2、37℃孵育1 h，加入TNF-α 1 000 U/ml，繼續(xù)培養(yǎng)4 d收獲細胞，記為DC2/NP-gp100-154-162；同樣在imDC中于第5天加入gp100-154-162，分別繼續(xù)培養(yǎng)至第7天和第9天收獲細胞，記為DC1/gp100-154-162與DC2/gp100-154-162。收集上述各組DC細胞備用。以DC1/NP-gp100-154-162、DC2/NP-gp100-154-162、DC1/gp100-154-162、DC2/gp100-154-162及DC/NPs作為刺激細胞，以TIL1520作為效應(yīng)細胞，實驗分為對照組：DC+TIL1520、DC/CNP+TIL1520；陽性對照組：T2/gp100-154-162+TIL1520；實驗組：DC1/gp100-154-162、DC2/gp100-154-162、 DC1/NP-gp100-154-162、DC2/NP-gp100-154-162，每孔加入的刺激細胞及效應(yīng)細胞數(shù)各5×104個/孔，刺激細胞與效應(yīng)細胞按1∶1比例加入，用ELISPOT法檢測分泌IFN-γ的細胞數(shù)。ELISPOT檢測采用瑞典Mabtech公司試劑盒，采用Millipore公司的96孔培養(yǎng)板，按試劑盒說明操作，即每孔先用30%酒精潤濕，加入抗人IFN-γ抗體，4℃過夜，然后用PBS洗滌，加入含10%血清的培養(yǎng)液，37℃ 2 h以封閉非特異性位點，PBS洗滌，加入100 μl/孔生物素鼠抗人IFN-γ抗體，室溫孵育2 h，PBS洗滌，加入卵白素-生物素辣根過氧化物，室溫孵育1 h，洗滌，最后加底物顯色劑，2～3 min 后用蒸餾水沖洗終止，用ELISpot分析儀計數(shù)分泌IFN-γ的細胞數(shù)。

2 結(jié)果

2.1DC的誘導(dǎo)及鑒定 PBMC經(jīng)過8 d培養(yǎng)可誘導(dǎo)為典型的DC細胞，表面表達DC標(biāo)志CD80、HLA-DR、CD83、CD86分別為：25.21%、86.43%、41.62%和47.31%,如圖1。

2.2納米-抗原肽微粒表征 用復(fù)乳溶劑蒸發(fā)法制得納米-抗原肽乳劑為乳白色均勻懸液，掃描電鏡觀察納米微粒為圓形(圖2A)，NanoPlus測得納米微粒180～230 nm(圖2B)； HPLC檢測顯示每毫克NP包載67 μg抗原肽。

2.3DC攝取納米微粒 當(dāng)DC細胞與NP-C6孵育24 h,流式細胞儀檢測顯示DC細胞MFI顯著增強(圖3A)，激光共聚焦顯微鏡結(jié)果顯示DC胞漿有較強的綠色熒光(圖3B)，這說明DC細胞能有效攝取NP-C6。

2.4負載納米微粒后DC表型檢測 流式細胞儀檢測DC細胞攝取PLGA納米微粒后表型變化。結(jié)果顯示：負載納米微粒后DC表面標(biāo)志CD80、CD83、CD86、HLA-DR的表達均有所增加，提示PLGA納米微粒可促進DC成熟及表面標(biāo)志的表達，如圖4，綠色部分峰為陰性對照。

2.5負載納米微粒的DC刺激同種異體淋巴細胞增殖反應(yīng) 混合淋巴細胞反應(yīng)結(jié)果顯示，DC/NP組混合淋巴細胞增殖反應(yīng)明顯高于單純DC組和單純NP組，刺激指數(shù)分別為(183.3±9.76)%、(121.58±3.02)%和(105.11±6.94)%(P<0.05)，這表明納米微粒能促進DC對T細胞的增殖反應(yīng)。見圖5。

圖1 流式檢測DC表面標(biāo)志Fig.1 Phenotype of DCs were analyzed by flow cytometry

圖2 納米微粒形態(tài)和大小分布Fig.2 Morphology and size distribution of nanoparticleNote: A.SEM，×50 000；B.NanoPlus.

圖3 樹突細胞攝取納米微粒檢測Fig.3 Dendritic cell uptake nanoparticleNote：A.Flow cytometry;B.Confocal microscape.

圖4 流式細胞術(shù)檢測負載納米微粒后DC表型Fig.4 Phenotype of mDC treated with NP compare with untreated DC by flow cytometry

圖5 DC負載納米微粒刺激T細胞增殖Fig.5 DC loaded with nanoparticle stimulators of T-cells proliferation when compared to untreated mDCNote：*.P<0.05.

圖6 納米微粒包載抗原肽促進DC遞呈抗原作用Fig.6 Effect of Nanoparticle on ability of antigent presention of DCsNote：*.P<0.05.

2.6納米微粒促進DC遞呈抗原作用 DC遞呈抗原能力以引起效應(yīng)細胞活化為標(biāo)志，檢測效應(yīng)細胞分泌IFN-γ可反映效應(yīng)細胞活化程度。本研究用免疫斑點法(ELISPOT)檢測效應(yīng)細胞分泌IFN-γ，結(jié)果顯示：用與納米-抗原肽孵育2 d和4 d的DC細胞刺激TIL1520細胞產(chǎn)生IFN-γ+細胞數(shù)明顯多于DC與單純抗原肽孵育2 d和4 d刺激效應(yīng)細胞產(chǎn)生的IFN-γ+細胞數(shù)(P<0.05)；同樣，用與納米-抗原肽孵育4 d的DC細胞刺激TIL1520細胞產(chǎn)生IFN-γ+細胞數(shù)明顯多于納米-抗原肽孵育2 d的DC細胞(P<0.05),見圖6，這說明納米微粒包載抗原肽能延緩抗原作用時間，促進DC遞呈抗原作用，促進效應(yīng)細胞活化。

3 討論

利用樹突狀細胞負載腫瘤抗原制備腫瘤疫苗是腫瘤主動免疫治療的主要方式，輸送抗原至抗原遞呈細胞特別是樹突狀細胞，是啟動和調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的關(guān)鍵步驟[5,6]，樹突狀細胞在免疫反應(yīng)中起重要作用，成熟的DC誘導(dǎo)免疫應(yīng)答而不成熟的DC誘導(dǎo)免疫耐受[7]。促進DC細胞的活化和成熟是抗腫瘤免疫的主要手段，越來越多研究表明納米微粒在介導(dǎo)DC免疫應(yīng)答過程中起重要作用，納米微粒與DC結(jié)合能進一步提高DC介導(dǎo)的免疫效應(yīng)功能，用納米微粒包載免疫抑制劑或免疫刺激劑負載DC細胞比單純免疫調(diào)節(jié)劑能更有效調(diào)節(jié)DC誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答效果[8,9]。Clawson等[10]研究顯示將Hp91短肽包載入或與PLGA納米微粒偶聯(lián)刺激DC活化比單純Hp91高5和20倍，包載腫瘤抗原Tag和佐劑CpG的納米微粒能促進DC成熟和活化[11]。用于包載生物活性物質(zhì)的納米材料有多種，如納米脂質(zhì)體、金屬納米微粒、聚合物納米微粒等。聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)由于具有良好的生物相容性和生物可降解特性是近年來備受青睞的載體材料之一。用納米微粒包載抗原能促進抗原被DC攝取，提高抗原的利用率，我們前期研究顯示用NP包載腫瘤抗原能增強抗原的免疫原性，誘發(fā)較強的免疫反應(yīng)[12]。

DC疫苗的佐劑可以幫助抗原激發(fā)快速、有效、持久的免疫反應(yīng)，從而提高疫苗的效率和細胞免疫效果。目前發(fā)現(xiàn)較多的DC疫苗佐劑，如CpG寡聚脫氧核苷酸(CpG-ODN)、LPS、單磷脂A等，其增強DC抗原遞呈能力的機制表現(xiàn)為促進DC成熟和分泌細胞因子。如殼聚糖/γ-PGA納米微粒促進DC細胞表達CD86、CD40、HLA-DR,并分泌TNF-α、IL-12p40等炎性因子[13]。我們研究顯示負載PLGA納米微粒的DC表面HLA-DR、CD83、CD80、CD86等平均熒光強度(MFI)表達增強，表明納米微粒能促進DC的成熟。混合淋巴細胞反應(yīng)顯示，負載納米微粒的DC能促進T細胞的增殖作用，說明PLGA納米微粒能促進DC的活化。粒徑是影響納米粒子在體內(nèi)運輸和被抗原遞呈細胞吞噬的重要因素，粒徑小于500 nm的納米微粒能被DC有效攝取[14]，最佳攝取作用為粒徑200～300 nm的納米微粒[15,16]，DC攝取納米微粒隨著DC-NP孵育時間延長而增加，在體外孵育24 h有50%～60%的納米微粒被攝取[17]。我們制備了粒徑為180～230 nm的納米微粒，能被DC有效攝取。用流式細胞儀和共聚焦顯微鏡觀察均顯示，NP-C6與DC孵育12 h能被DC有效攝取。

納米微粒包載抗原能使抗原緩慢釋放維持較長時間，產(chǎn)生更加有效的免疫應(yīng)答。Zhu等[18]制備了包載黑色素瘤抗原肽TRP2和佐劑的二氧化硅納米微粒，這種納米微粒能有效保護抗原肽、延長抗原肽的釋放，增強DC誘導(dǎo)針對B16黑素瘤的有效TRP2特異性CD8+T細胞應(yīng)答的效率和能力。為了進一步研究PLGA納米微粒在DC抗腫瘤免疫中的作用，我們用PLGA納米微粒包載黑色素瘤抗原肽gp100-154-162負載DC誘導(dǎo)TIL細胞免疫反應(yīng)，結(jié)果顯示用納米微粒負載抗原肽處理的DC能誘導(dǎo)較強的免疫反應(yīng)，這可能是因為NP-gp100-154-162在DC內(nèi)存在較長時間，抗原在DC內(nèi)得到充分加工處理，且持續(xù)、緩慢釋放到DC表面，刺激較多的T細胞分泌IFN-γ，說明納米微粒能延長并增強DC遞呈抗原的能力。因此，PLGA納米微粒包載抗原肽促進免疫應(yīng)答的原因除了免疫刺激劑誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的發(fā)生外，PLGA納米微粒也可能促進DC的活化和成熟，從而進一步增強DC的免疫應(yīng)答。本研究用復(fù)乳溶劑蒸發(fā)法制得的納米微粒能被DC有效攝取，促進DC成熟和抗原遞呈作用。本研究表明，PLGA納米微粒既可作為一種免疫佐劑促進DC的成熟增強其遞呈抗原能力，又能使包被其中的抗原產(chǎn)生有效、持續(xù)較長時間的免疫反應(yīng)從而提高細胞免疫效果。