郭 華 裴高油 李龍騰 徐文濤

(鄭州鐵路職業(yè)技術(shù)學(xué)院藥學(xué)院，鄭州451460)

肝臟是人體重要的代謝器官，負(fù)責(zé)碳水化合物、蛋白質(zhì)和脂類的代謝，清除血液中的藥物和毒素，調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)等。因此，肝臟經(jīng)常會(huì)受到各種各樣的損害，包括病毒性感染、創(chuàng)傷、化學(xué)試劑等。這些損害常常會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡和肝臟功能障礙[1,2]。隨著中國(guó)人口老齡化加劇，醫(yī)療需求也在不斷增加。藥物和保健品的不合理使用使得藥物性肝損傷的發(fā)生率也在增加[3]。肝損傷已成為臨床醫(yī)學(xué)和藥物開發(fā)的一個(gè)重大挑戰(zhàn)[4]。加深對(duì)肝損傷及其治療方法的研究對(duì)人類醫(yī)療健康事業(yè)具有重要意義。據(jù)報(bào)道四氯化碳(CCl4)可誘發(fā)急性和慢性組織損傷。由于CCl4誘導(dǎo)的肝損傷機(jī)制與肝臟疾病非常相似，因此在實(shí)驗(yàn)性肝病中常被用于肝損傷動(dòng)物模型的建立[5]。通過CCl4建立的急性肝損傷模型往往會(huì)產(chǎn)生氧化應(yīng)激，炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡的增加[6]。青藤堿是一種從中藥材青風(fēng)藤中提取的異喹啉類物質(zhì)，對(duì)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎有較好的治療效果，甚至具有抗癌，緩解神經(jīng)性疼痛及減輕腦出血損傷等功能[7-9]。但關(guān)于青藤堿肝臟保護(hù)作用的報(bào)道還十分罕見，有待進(jìn)一步研究。本文的主要目的是探究青藤堿對(duì)四氯化碳誘導(dǎo)的急性肝損傷小鼠肝損傷、細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)的影響。

1 材料與方法

1.1材料 40只6周齡小鼠購(gòu)自鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。青藤堿(Sinomenine,SM)(貨號(hào)與規(guī)格：SS8560-20 mg，純度：HPLC≥98%)來源于Solarbio。天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(Aspartate aminotransferase,AST)、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(Alanine aminotransferase,ALT)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、丙二醛(Methane dicarboxylic aldehyde,MDA)、谷胱甘肽(Glutathione,GSH)、白細(xì)胞介素(Interleukin,IL)-6、IL-1β和腫瘤壞死因子(Tumor necrosis factor alpha,TNF-α)的酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自武漢默沙克生物科技有限公司。蘇木素伊紅(Hematoxylin-eosin,HE)染色試劑盒和脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記(Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick labeling,TUNEL)細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)公司。抗Bcl-2抗體和抗 Bax抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。

1.2方法

1.2.1動(dòng)物分組及藥物處理 小鼠隨機(jī)分為4組：健康對(duì)照組(Ctrl)，青藤堿組(Sinomenine)，CCl4模型組(CCl4)，青藤堿處理組(CCl4+Sinomenine)，每組10只。首先CCl4模型組和青藤堿處理組皮下注射40%的CCl4橄欖油溶液(1.5 ml/kg)，2周一次，連續(xù)8周，對(duì)照組和青藤堿組皮下注射等量的橄欖油。上述處理的倒數(shù)第7天開始，青藤堿組和青藤堿處理組每天腹腔注射青藤堿20 mg/kg體重，連續(xù)注射7 d，對(duì)照組和CCl4組用生理鹽水代替。

1.2.2ELISA檢測(cè) 青藤堿處理7 d后，收集各組小鼠血清后按照ELISA試劑盒說明書步驟檢測(cè)ALT、AST、SOD、MDA、GSH、IL-6、IL-1β和TNF-α水平。首先樣品加入反應(yīng)孔， 37℃孵育45 min。洗滌液洗滌4次后加入生物素標(biāo)記的抗體，37℃孵育30 min。洗滌后再加鏈霉親和素HRP混勻，37℃孵育30 min。然后加入顯色劑避光顯色15 min，最后添加終止液終止反應(yīng)，450 nm處檢測(cè)吸光值。

1.2.3HE染色 頸椎脫臼法處死小鼠后取出肝臟組織，用4% 的多聚甲醛對(duì)肝臟組織進(jìn)行固定，4℃ 24 h。PBS清洗3次，用30%、50%和70%的酒精梯度脫水，每個(gè)梯度脫水10 min。再經(jīng)脫水機(jī)中脫水后進(jìn)行石蠟包埋和切片。各組小鼠的石蠟切片按照HE染色液說明書進(jìn)行HE染色，顯微鏡下觀察肝臟組織病變情況。

1.2.4TUNEL染色 按照試劑盒說明書首先將石蠟切片依次進(jìn)行二甲苯脫蠟和梯度乙醇水化，再用蛋白酶K于20～37℃孵育15～30 min。PBS漂洗3次，再用3%的H2O2于室溫孵育20 min。PBS清洗3次。然后進(jìn)行生物素標(biāo)記，顯色，蘇木素復(fù)染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明。最后中性樹膠封片，顯微鏡下觀察拍照，細(xì)胞核呈棕色顆粒的為凋亡細(xì)胞。

1.2.5蛋白印跡 首先各組小鼠的肝臟組織按每20 mg加200 μl的比例加入裂解液,用勻漿器冰上勻漿5 min,4℃、4 200 r/min離心10 min,收集上清。等量蛋白進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳分離并轉(zhuǎn)至PVDF膜，經(jīng)5%的BSA封閉1 h，加入相應(yīng)的一抗，4℃過夜孵育。第二天加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育1.5 h。最后加入發(fā)光液于凝膠成像儀進(jìn)行曝光和拍照，統(tǒng)計(jì)灰度值計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用SPSS16.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，各組間進(jìn)行單因素方差分析后再進(jìn)行duncan′s multiple ramge test檢驗(yàn)。P<0.01認(rèn)為差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1青藤堿對(duì)四氯化碳誘導(dǎo)的急性肝損傷小鼠肝功酶的影響 通過ELISA檢測(cè)血清中ALT和AST水平，分析青藤堿對(duì)四氯化碳誘導(dǎo)的急性肝損傷小鼠肝功酶的影響。如圖1所示，CCl4模型組ALT和AST水平高于對(duì)照組(P<0.01)。與CCl4模型組相比，青藤堿處理組ALT和AST水平下降(P<0.01)。由此可見，青藤堿可降低CCl4誘導(dǎo)的急性肝損傷小鼠血清中肝功酶ALT和AST水平。

2.2青藤堿對(duì)四氯化碳誘導(dǎo)的急性肝損傷小鼠肝臟組織病變的影響 通過HE染色觀察青藤堿對(duì)四氯化碳誘導(dǎo)的急性肝損傷小鼠肝臟組織病變的影響。如圖2所示，對(duì)照組和青藤堿組肝臟組織細(xì)胞排列規(guī)則，無(wú)明顯病變。CCl4模型組出現(xiàn)肝臟組織細(xì)胞排列紊亂，肝細(xì)胞壞死，胞質(zhì)空泡化，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等病變。青藤堿處理組的肝臟組織病變得到明顯改善。上述結(jié)果表明，青藤堿可緩解四氯化碳誘導(dǎo)的急性肝損傷小鼠肝臟組織病變。

圖1 ELISA檢測(cè)血清中肝功酶水平Fig.1 Levels of serum hepatic enzymes were detected by ELISANote：**.P<0.01 vs control group；##.P<0.01 vs CCl4 group.

圖2 HE染色觀察肝臟組織病變Fig.2 Pathological changes of liver tissues were observed by HE staining

2.3青藤堿對(duì)四氯化碳誘導(dǎo)的急性肝損傷小鼠肝臟組織細(xì)胞凋亡的影響 利用TUNEL染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡，分析青藤堿對(duì)四氯化碳誘導(dǎo)的急性肝損傷小鼠肝臟組織細(xì)胞凋亡的影響。由圖3可知，CCl4模型組細(xì)胞凋亡高于對(duì)照組(P<0.01)。與CCl4模型組相比，青藤堿處理組細(xì)胞凋亡下降(P<0.01)。上述結(jié)果說明，青藤堿可減輕四氯化碳誘導(dǎo)的急性肝損傷小鼠肝臟組織細(xì)胞凋亡。

2.4青藤堿對(duì)四氯化碳誘導(dǎo)的急性肝損傷小鼠細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 為進(jìn)一步分析青藤堿對(duì)四氯化碳誘導(dǎo)的急性肝損傷小鼠細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，蛋白印跡檢測(cè)Bcl-2和Bax表達(dá)。圖4顯示，CCl4模型組Bcl-2表達(dá)低于對(duì)照組，Bax表達(dá)高于對(duì)照組(P<0.01)。與CCl4模型組相比，青藤堿處理組Bcl-2表達(dá)上升，Bax表達(dá)下降(P<0.01)。以上結(jié)果表明，青藤堿可逆轉(zhuǎn)四氯化碳誘導(dǎo)急性肝損傷小鼠細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2和Bax表達(dá)的異常。

圖3 TUNEL染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡Fig.3 Apoptosis was measured by TUNEL stainingNote：**.P<0.01 vs control group；##.P<0.01 vs CCl4 group.

圖4 蛋白印跡檢測(cè)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)Fig.4 Expression of apoptosis related proteins was tested by western blotNote：**.P<0.01 vs control group；##.P<0.01 vs CCl4 group.

圖5 ELISA檢測(cè)氧化應(yīng)激指標(biāo)Fig.5 Indexs of oxidative stress were detected by ELISANote：**.P<0.01 vs control group；##.P<0.01 vs CCl4 group.

圖6 ELISA檢測(cè)炎癥因子水平Fig.6 Levels of inflammatory factors were measured by ELISANote：**.P<0.01 vs control group；##.P<0.01 vs CCl4 group.

2.5青藤堿對(duì)四氯化碳誘導(dǎo)的急性肝損傷小鼠氧化應(yīng)激的影響 為分析青藤堿對(duì)四氯化碳誘導(dǎo)的急性肝損傷小鼠氧化應(yīng)激的影響，ELISA檢測(cè)SOD、MDA和GSH水平。由圖5可知，CCl4模型組SOD和GSH水平低于對(duì)照組，MDA 水平高于對(duì)照組(P<0.01)。與CCl4模型組相比，青藤堿處理組SOD和GSH水平上升，MDA 水平下降(P<0.01)。上述結(jié)果說明，青藤堿可減弱四氯化碳誘導(dǎo)的急性肝損傷小鼠氧化應(yīng)激。

2.6青藤堿對(duì)四氯化碳誘導(dǎo)的急性肝損傷小鼠炎癥反應(yīng)的影響 通過ELISA檢測(cè)IL-6、IL-1β和TNF-α水平，分析青藤堿對(duì)四氯化碳誘導(dǎo)的急性肝損傷小鼠炎癥反應(yīng)影響。圖6顯示，CCl4模型組IL-6、IL-1β和TNF-α水平高于對(duì)照組(P<0.01)。與CCl4模型組相比，青藤堿處理組IL-6、IL-1β和TNF-α水平下降(P<0.01)。以上結(jié)果表明，青藤堿可降低四氯化碳誘導(dǎo)的急性肝損傷小鼠IL-6、IL-1β和TNF-α水平，減輕炎癥反應(yīng)。

3 討論

目前針對(duì)肝損傷的藥物治療十分有限，N-乙酰半胱氨酸可用于治療對(duì)乙酰氨基酚引起的肝損傷，以促進(jìn)恢復(fù)和減少肝移植的需要。尋找開發(fā)新的有效的且副作用小的藥物治療迫在眉睫。近年來，隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，許多植物化學(xué)物質(zhì)得以分離，而這些化學(xué)物質(zhì)具有成為治療藥物的潛能[10]。

大量文獻(xiàn)報(bào)道青藤堿在改善各類疾病的組織病變方面發(fā)揮著積極作用。有研究發(fā)現(xiàn)青藤堿可改善腦內(nèi)出血導(dǎo)致的腦積水及神經(jīng)功能缺損等腦損傷[11]。有數(shù)據(jù)顯示在大腦中動(dòng)脈閉塞誘導(dǎo)的缺血再灌注損傷大鼠中，青藤堿可減輕大腦皮層的神經(jīng)元退化變性等病變[12]。Zhao等[13]發(fā)現(xiàn)青藤堿可緩解缺血再灌注誘導(dǎo)的腎損傷大鼠腎臟組織腎小管壞死，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，小管擴(kuò)張及水腫等病變。本研究結(jié)果顯示，青藤堿可緩解四氯化碳誘導(dǎo)的急性肝損傷小鼠肝臟組織細(xì)胞壞死、胞質(zhì)空泡化、大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等病變。

細(xì)胞凋亡是十分重要的生理過程，大量數(shù)據(jù)表明青藤堿具有調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的作用。據(jù)報(bào)道青藤堿可降低創(chuàng)傷性腦損傷大鼠腦組織細(xì)胞凋亡，減弱Caspase-3表達(dá)，增強(qiáng)Bcl-2表達(dá)[14]。有研究顯示青藤堿可減弱大腦中動(dòng)脈閉塞誘導(dǎo)的缺血再灌注損傷小鼠腦組織細(xì)胞凋亡[15]。Fu等[16]發(fā)現(xiàn)在外傷性腦損傷小鼠中，青藤堿可減輕細(xì)胞凋亡，降低Caspase-3和Bax表達(dá)，提高Bcl-2表達(dá)。本文結(jié)果顯示，青藤堿可減弱四氯化碳誘導(dǎo)的急性肝損傷小鼠肝臟組織細(xì)胞凋亡，提高Bcl-2表達(dá)，降低Bax表達(dá)。

越來越多的研究表明青藤堿具有抗氧化應(yīng)激的功效。Zhang等[17]發(fā)現(xiàn)在慢性間歇性缺氧所致肺損傷大鼠中，青藤堿可降低MDA水平，提高SOD及CAT水平。有數(shù)據(jù)顯示在單側(cè)輸尿管梗阻誘導(dǎo)腎纖維化小鼠中，青藤堿可升高腎臟組織CAT,SOD和GPx水平[18]。據(jù)報(bào)道青藤堿可降低支氣管哮喘小鼠MDA水平及髓過氧化物酶活性，增強(qiáng)總抗氧化能力[19]。本研究結(jié)果顯示，青藤堿可提高四氯化碳誘導(dǎo)的急性肝損傷小鼠SOD和GSH水平，降低MDA 水平，減弱氧化應(yīng)激。

炎癥在肝損傷過程發(fā)揮著重要作用[20]。大量文獻(xiàn)報(bào)道青藤堿具有抗炎的功能。有研究表明青藤堿可減弱單側(cè)輸尿管結(jié)扎誘導(dǎo)腎損傷小鼠IL-1β和TNF-α表達(dá)[21]。Qiu等[22]發(fā)現(xiàn)缺血性中風(fēng)小鼠中，青藤堿可降低IL-1β、IL-6、IL-18和TNF-α水平。據(jù)報(bào)道青藤堿可降低慢性哮喘小鼠IL-4、 IL-5和IL-13水平[23]。本文結(jié)果顯示，青藤堿可降低四氯化碳誘導(dǎo)的急性肝損傷小鼠IL-6、IL-1β和TNF-α水平，減輕炎癥反應(yīng)。

本研究表明，在四氯化碳誘導(dǎo)的急性肝損傷小鼠中，青藤堿可降低肝功酶ALT和AST水平，緩解肝臟組織細(xì)胞壞死、胞質(zhì)空泡化、大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等病變，減輕細(xì)胞凋亡、增強(qiáng)Bcl-2表達(dá)、減弱Bax表達(dá)，降低MDA水平、提高SOD和GSH水平，降低IL-6,IL-1β和TNF-α水平。綜上所述，青藤堿可減輕四氯化碳誘導(dǎo)的急性肝損傷小鼠肝損傷，細(xì)胞凋亡，氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)。下一步計(jì)劃研究青藤堿在其他因素導(dǎo)致的肝損傷中作用，為肝損傷的治療提供理論依據(jù)。