孫 林 洪明陽 曹雅明 朱曉彤

(中國醫(yī)科大學(xué)免疫學(xué)教研室，沈陽110122)

瘧疾是瘧原蟲通過媒介按蚊傳播的威脅人類健康的寄生原蟲感染性疾病。WHO報告顯示，2017年全球有216萬瘧疾病例，445 000人死于瘧疾感染[1]?？顾幵x與抗殺蟲劑蚊的出現(xiàn)與擴散使瘧疾的防控面臨嚴(yán)峻挑戰(zhàn)[2]。探索新型有效的瘧疾控制方式迫在眉睫。傳播阻斷疫苗(Transmission blocking vaccine，TBVs)可阻斷流行區(qū)瘧疾的傳播，且由于其候選抗原表達于蚊階段原蟲，不受人體免疫系統(tǒng)選擇壓力影響，故具有低多態(tài)性和良好的免疫原性[3]?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)多個瘧疾傳播阻斷疫苗候選抗原，如：配子體和配子表面蛋白P48/45與P230，合子和動合子期表面蛋白P25和P28，蚊階段原蟲表面抗原HAP2[4-7]。雖然上述候選抗原制備的疫苗具有明顯的傳播阻斷效應(yīng)，但仍不能完全阻斷原蟲傳播。因此，探索新的TBVs候選抗原可為高效瘧疾傳播阻斷疫苗的研制提供前期基礎(chǔ)。

瘧疾傳播始于蚊蟲叮咬感染患者。在蚊蟲叮咬過程中，配子體期原蟲由脊椎動物宿主(人)傳播到蚊體內(nèi)。在蚊胃內(nèi)，由于溫度、pH值下降和多種環(huán)境因素導(dǎo)致配子體分化為雄配子(小配子)和雌配子(大配子)[8]。經(jīng)3次有絲分裂后，每個小配子體形成八個小配子。通過出絲溢出并與大配子結(jié)合受精后，形成合子和動合子。上述發(fā)育過程依賴原蟲體內(nèi)多條由磷酸酶(PPs)和激酶(PKs)參與的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的作用[9-11]。調(diào)控配子體期原蟲信號轉(zhuǎn)導(dǎo)可干擾原蟲在蚊體內(nèi)的發(fā)育，為阻斷瘧疾傳播提供可能。因此，配子體發(fā)育信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中的磷酸酶和激酶為抗瘧小分子藥物研制的有效靶位，同時也是瘧疾傳播阻斷疫苗的潛在候選抗原。

絲/蘇氨酸磷蛋白磷酸酶5(PP5)通過N端的TPR結(jié)構(gòu)域與熱休克蛋白90(Hsp90)、Rac GTP酶、RAF、ASK1、CDC16和CDC27等蛋白相互作用，參與細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程[12-14]。在柔嫩艾美耳球蟲原蟲中，下調(diào)PP5(Eimeria tenella PP5，EtPP5)表達水平可導(dǎo)致二代裂殖子凋亡[15]。上調(diào)布魯氏錐蟲PP5(Trypanosoma brucei PP5，TbPP5)中PP5表達水平可抑制格爾德霉素的治療效果，而敲除PP5基因可抑制錐蟲生長[16]。惡性瘧原蟲PP5(Plasmodium falciparum PP5，PfPP5)具有與其他原蟲PP5蛋白相似結(jié)構(gòu)，并與Hsp90相互作用，但其功能尚不明確。有研究提示PfPP5在瘧原蟲生長和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中發(fā)揮重要作用[17,18]。

基于PP5蛋白在哺乳動物細胞中重要的信號傳導(dǎo)作用和其在瘧原蟲有性階段研究的潛在意義，本項目采用生物信息學(xué)方法選取惡性瘧原蟲PfPP5在伯氏瘧原蟲(Pb.ANKA)中同源蛋白PbPP5(PbANKA_113190)，截取其優(yōu)勢抗原表位區(qū)域，構(gòu)建原核表達載體，表達并純化PP5重組蛋白。免疫小鼠后，通過ELISA和Western blot方法評估PP5蛋白的免疫活性，并通過評估抗PP5免疫血清的傳播阻斷效果為研制新型高效瘧原蟲傳播阻斷疫苗提供理論和實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料 6～8周齡雌性BALB/c小鼠購自北京實驗動物研究所；Pb.ANKA 2.34原蟲基因組DNA(gDNA)由中國醫(yī)科大學(xué)免疫學(xué)教研室保存；KOD-Plus-Neo購自Toyobo；限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和NotⅠ TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit v2.0、T4 DNA連接酶購自TaKaRa；快速質(zhì)粒小提試劑盒(DP105)購自天根；LB Broth、Goat anti-Mouse IgG(H+L)Secondary Antibody HRP、HisPurTMNi-NTA Magnetic Beads、PierceTMECL Plus Western blot Substrate、6×His Tag Monoclonal Antibody購自Thermo Fisher Scientific； 1640培養(yǎng)基購自Gibco；胎牛血清購自Hyclone；氨芐青霉素購自北京鼎國。

1.2方法

1.2.1絲/蘇氨酸磷酸酶5(PlasmoDB ID:PbANKA_113190，PP5)基因合成及原核表達載體構(gòu)建 以Pb.ANKA原蟲gDNA為模板，采用引物：PP5-BamHIF：cgcggatccGTTGTAGAATATATAAGTGTACC；PP5-NotIR：ttttccttttgcggccgcAATATTTTGATATAAA-TTATGAGCATA，擴增PP5基因功能區(qū)域(氨基酸位點：407-711 aa)。將上述PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，切膠純化獲得PP5-DNA片段后，經(jīng)BamHⅠ和NotⅠ限制性內(nèi)切酶37℃孵育2 h，純化回收雙酶切的DNA片段。pET32a(+)原核表達載體采用BamHⅠ和NotⅠ雙酶切后回收純化。采用T4連接酶16℃過夜連接酶切后的pET32a(+)載體和PP5-DNA片段，構(gòu)建pET32a(+)-PP5表達載體。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至宿主菌Rosetta(DE)Competent Cell(TaKaRa)，菌落PCR選取陽性克隆后，質(zhì)粒小提后，送華大基因公司測序。采用MEGA7.0軟件，對測序結(jié)果與PlasmoDB(http://www.plasmodb.org)數(shù)據(jù)庫中PP5基因組DNA基因比對分析。

1.2.2重組蛋白的表達、純化與實驗動物免疫 選取pET32a(+)-PP5陽性克隆于LB培養(yǎng)基中，經(jīng)1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)20℃過夜搖菌表達重組蛋白后，采用HisPurTMNi-NTA Magnetic Beads純化PP5-his重組蛋白并檢測蛋白濃度。將純化蛋白的重組蛋白用10%的聚丙烯酰胺凝膠電泳分離。25 V 30 min 半干法轉(zhuǎn)膜。以5%脫脂奶粉，4℃封閉過夜。TBS-T漂洗3次后，采用抗His標(biāo)簽抗體6×His Tag Monoclonal Antibody(1∶2 000)孵育PVDF膜，室溫1 h。用TBS-T將PVDF膜洗滌3次，每次5 min。采用HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG孵育PVDF膜，室溫1 h。TBST洗滌3次。用ECL發(fā)光方法，熒光圖像分析系統(tǒng)中檢測結(jié)果。實驗動物免疫：6～8周齡BALB/c雌性小鼠10只，隨機分為2組，每組5只。1組免疫PP5重組蛋白(PP5)；2組為PBS對照組(control)。每兩周免疫1次，共免疫3次。初次免疫重組蛋白(50 μg/只)與完全弗氏佐劑充分混合，二免和三免采用重組蛋白與不完全弗氏佐劑充分混合皮下免疫小鼠。 分別于小鼠免疫后14、28、42 d采集免疫小鼠尾血，收集免疫血清，-80℃保存。

1.2.3血清特異性抗體水平檢測 用溶解在碳酸鹽緩沖液的PP5重組蛋白(10 μg)包被96孔酶標(biāo)板，4℃過夜。采用含1%BSA的PBS-T封閉l h，以PBS緩沖液連續(xù)倍比稀釋免疫后不同時間點小鼠抗PP5免疫血清，每孔100 μl，37℃孵育 2 h，PBS-T清洗3次后，加入1∶5 000倍稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG，孵育l h，PBS-T清洗后，加入底物鄰苯二胺和過氧化氫進行顯色，酶標(biāo)儀檢測492 nm處OD值。

1.2.4內(nèi)源性蛋白PP5提取 采用1×107個Pb.ANKA尾靜脈注射(i.v.)感染BALB/c小鼠，待感染后第3天，感染率達5%時取小鼠尾血100 μl，PBS洗滌3次，采用0.015%皂苷裂解紅細胞，PBS洗滌去除血紅蛋白后，采用2%SDS+0.1%TritonX-100提取原蟲蛋白。采用抗PP5免疫血清，Western blot方法檢測抗PP5免疫血清與內(nèi)源性PP5蛋白的結(jié)合情況。

1.2.5抗PP5免疫血清對有性階段原蟲生長發(fā)育抑制效果觀察 采用1×107個Pb.ANKA腹腔注射(i.p.)感染BALB/c小鼠，待感染后第3天，感染率達5%時取小鼠尾血10 μl與40 μl動合子培養(yǎng)基(1640培養(yǎng)基+25%胎牛血清)混合，并將抗PP5免疫血清按1∶5、1∶10、1∶50和1∶100四個稀釋濃度分別加入動合子培養(yǎng)基中，放置于25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15 min后，取1.5 μl涂片，并在10 min內(nèi)于光鏡顯微鏡下計數(shù)40個視野，觀察配子體出絲的數(shù)目。取10 μl血液置于90 μl動合子培養(yǎng)液中，加稀釋的重組蛋白/對照免疫的小鼠血清(1∶5、1∶10、1∶50和1∶100)。瘧原蟲在19℃培養(yǎng)24 h。用抗Pbs21抗體固定和標(biāo)記培養(yǎng)物，在熒光顯微鏡下計數(shù)動合子數(shù)目并計算動合子形成率[19,20]。在蚊飼實驗中，采用1∶5 倍稀釋抗PP5免疫血清100 μl在蚊飼前30 min尾靜脈注射1×107個Pb.ANKA感染的BALB/c小鼠，蚊飼10 d后，解剖按蚊檢測感染率和蚊胃內(nèi)卵囊形成情況。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用GraphPad Prism 6.0統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，原蟲血癥的組間比較采用Student′st檢驗，配子體出絲，動合子轉(zhuǎn)化率，蚊感染率和卵囊密度實驗組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1pET32a(+)-PP5載體構(gòu)建及其表達和純化 本研究中成功構(gòu)建了pET32a(+)-PP5原核表達載體，并轉(zhuǎn)至大腸桿菌Rosetta(DE)Competent Cell表達系統(tǒng)，加入1 mmol/L IPTG，經(jīng)16℃誘導(dǎo)20 h后，SDS-PAGE電泳分析可見大量可溶性PP5重組蛋白(約38 kD)的表達。使用HisPurTMNi-NTA Magnetic Beads柱純化重組蛋白，并對洗脫及透析后的樣品進行Western blot檢測，可清晰看到目標(biāo)蛋白條帶約38 kD，大小符合目的蛋白分子量。檢測其蛋白純度>80%，濃度可達到2.5 mg/ml(圖1)。

2.2免疫血清特異性IgG抗體檢測ELISA結(jié)果 小鼠經(jīng)3次PP5重組蛋白免疫后，與PBS組相比，PP5組小鼠血清特異性抗體水平顯著升高(P<0.01，圖2A)，且抗PP5免疫血清可與內(nèi)源性PP5蛋白結(jié)合(約82.5 kD)。重組蛋白加強免疫后效價可達1∶256 000。與對照組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(圖2B)。

2.3抗PP5免疫血清對配子體期原蟲發(fā)育的影響 1∶5、1∶10 、1∶50和1∶100倍稀釋的抗PP5免疫血清可使配子體出絲數(shù)目分別減少75%、45%、33.33%和21.05%，且減少量呈劑量依賴性，1∶5和1∶10倍稀釋組與對照組相比差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖3)。此結(jié)果提示抗PP5免疫血清可影響雄配子功能。

2.4抗PP5免疫血清對體外動合子期原蟲和蚊階段原蟲發(fā)育的影響 1∶5、1∶10、1∶50和1∶100倍稀釋的抗PP5免疫血清與瘧原蟲共同培養(yǎng)24 h后均可使動合子形成減少，動合子數(shù)目分別減少了77.12%、60.39%、37.58%和20.26%。除1∶100倍稀釋組，其他各組與對照組相比差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖4A)。動合子轉(zhuǎn)化率實驗顯示，1∶5 稀釋的抗PP5免疫血清可顯著抑制動合子轉(zhuǎn)化率，動合子轉(zhuǎn)化率減少14.79%(P<0.05)。同時，與對照組相比，1∶5倍稀釋的抗PP5免疫血清可顯著降低蚊感染率26.05%，蚊胃內(nèi)卵囊密度下降74.19%(表1)。上述結(jié)果提示抗PP5免疫血清可阻止部分動合子和卵囊的形成和成熟。

圖1 PP5重組蛋白表達檢測Fig.1 Expression of recombinant PP5 proteinNote：A.The coomassie brilliant blue staining result of recombinant PP5 protein；B.Western blot detection of recombinant PP5 protein by using 6×His Tag Monoclonal Antibody(1∶2 000 dilution).Arrows indicate recombinant PP5 proteins.

圖2 ELISA法檢測PP5重組蛋白免疫效果和免疫血清抗體效價Fig.2 Immune effect and immune sera antibody titer of recombinant PP5 protein were detected by ELISA assayNote：A.ELISA assay was used to detect the immune effect of recombinant PP5-his protein.Control.PBS immunized group;PP5.Plasmodium berghei PP5 recombinant protein immunized group.The upper right pannel is the result of endogenous PP5 protein detected by anti-PP5 immune serum(1∶200).The arrow indicates endogenous PP5 protein(～82.5 kD).Pre.Pre-immune serum；B.ELISA assay was used to detect the antibody titer of anti-PP5 immune serum.Pre-immune,pre-immune serum.*.P<0.05;**.P<0.01;***.P<0.001.

圖3 抗PP5免疫血清對配子體出絲的影響Fig.3 Effect of anti-PP5 serum on gametocyte exflagellationNote：PBS control.PBS immunized group;PP5.Recombinant Plasmodium berghei PP5 protein immunized group.*.P<0.05.

圖4 抗PP5血清對動合子數(shù)目和形成率的影響Fig.4 Effect of anti-PP5 serum on ookinete number and ookinete conversion rateNote：A.The effect of anti-PP5 serum on ookinete number;B.The effect of anti-PbPP5 serum on ookinete conversion rate.PBS control.PBS immunized group;PP5.Recombinant Plasmodium berghei PP5 protein immunized group.*.P<0.05.

表1 抗PP5免疫血清接種小鼠傳播阻斷效應(yīng)

Tab.1 Transmission-blocking effects of mouse inoculate with anti-PP5 sera

PBS control seraPBS-M1PBS-M2PBS-M3anti-PP5 seraPP5-M1PP5-M2PP5-M3Mosquitoes infected/dissected20/2322/2320/2313/2315/2316/23Prevalence of infection(%)a86.9595.6586.9656.5265.2269.57Mean prevalence(%)89.8263.77Reduction in prevalence(%)b26.051)Oocyst intensityc129.95117.6103.651532.4743.1875SEMd23.3322.7815.973.3948.04411.09Mean oocyst intensity117.0730.22Reduction in oocyst intensity(%)e74.191)

Note：1)P<0.05 for comparisons between the experimental group and the control group；a.The prevalence of infection was calculated by the number of mosquitoes with oocysts/total mosquitoes dissected in each group × 100%；b.The percent reduction of prevalence was calculated as %mean prevalence PBS control-%mean prevalence anti-PP5；c.Mean number of oocysts per mosquito midgut；d.Standard error of the mean；e.The percent reduction in oocyst intensity was calculated as(mean oocyst intensity PBS control-mean oocyst intensity anti-PP5)/mean oocyst intensity PBS control×100%.

3 討論

瘧原蟲的有性發(fā)育階段由配子體轉(zhuǎn)變?yōu)閯雍献拥倪^程中需要多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路共同作用，包括由蛋白激酶(Protein kinases，PK)和磷酸酶(Protein phosphatases，PP)催化的可逆蛋白磷酸化過程。PK已被廣泛研究并被確認(rèn)為瘧疾治療的重要靶位，但對于PP的研究尚處于起步階段。瘧原蟲的磷酸酶可分為蛋白磷酸酶(Phosphoprotein phosphatases，PPPs)、金屬依賴性蛋白磷酸酶(Metal-dependent protein phosphatases，PPM)、蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP)和NLI相互作用因子樣磷酸酶(NIFs)等四大家族[21]。PPPs由PP1、PP2A、PP2B、PP5和PP7 等亞家族組成[22]。惡性瘧原蟲PP1和PP2A在無性發(fā)育階段表達，敲除PP1可抑制DNA合成[23]。小分子藥物FKBP35可抑制PP2B磷酸酶活性[24]。PP7家族成員PPJ蛋白主要表達在裂殖體期原蟲，其活性有Ca2+調(diào)控[25]。但PP5的研究尚處于起步階段。本研究中，我們選取惡性瘧原蟲絲/蘇氨酸磷酸酶PP5在伯氏瘧原蟲中的同源蛋白，探討其免疫血清對瘧原蟲有性階段生長發(fā)育的影響。

除采用藥物治療瘧疾感染之外，開發(fā)高效的瘧疾傳播阻斷疫苗亦是瘧疾防控的重要手段[26]。本研究中，采用大腸桿菌系統(tǒng)表達的重組蛋白免疫小鼠，經(jīng)過三次免疫后，小鼠血清中抗PP5特異性抗體水平顯著升高。同時，Western blot結(jié)果顯示抗PP5免疫血清可以結(jié)合內(nèi)源性PP5蛋白。此結(jié)果表明伯氏瘧原蟲PP5重組蛋白免疫血清具有良好的免疫原性和抗原性，為篩選其作為傳播阻斷疫苗候選抗原提供了理論基礎(chǔ)。經(jīng)典的TBVs候選抗原，如：配子受精前期靶抗原P45/48、P230，受精后期靶抗原P25、P28和 蚊 蟲 中 腸 靶 抗 原HAP2均為原蟲有性階段表面蛋白。雖然P45/48和P230具有明顯的傳播阻斷效果，但兩者在體外表達時無法正確折疊而阻礙了其發(fā)展[27]。P25和P28為動合子表面蛋白，介導(dǎo)動合子侵入胃壁上皮細胞[28]。有研究證實，抗Pbs25/28免疫血清可完全阻止瘧原蟲在蚊體內(nèi)的發(fā)育[29]。Pvs25已經(jīng)進入了Ⅰ期臨床試驗，Pvs25疫苗可減少80%的卵囊形成，并降低20%～30%的按蚊感染率，但其傳播阻斷效果未達到100%。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，PP5蛋白在動合子期定位于伯氏瘧原蟲表面(結(jié)果未顯示)。當(dāng)在動合子培養(yǎng)基中分別加入1∶5、1∶10、1∶50和1∶100的抗PP5免疫血清時，其對動合子形成的抑制效果呈劑量依賴性，動合子形成率分別減少了77.12%、60.39%、37.58%和20.26%。在同樣的高抗體濃度下(1∶5倍稀釋)，其動合子抑制率與經(jīng)典的伯氏瘧原蟲HAP2候選抗原相似(抑制率：87%)[7]。同時，蚊飼實驗顯示，抗PP5免疫血清可顯著抑制蚊感染率和胃內(nèi)卵囊形成。前期研究中，本課題組發(fā)現(xiàn)伯氏瘧原蟲PP5蛋白在多個原蟲發(fā)育階段表達，提示抗PP5的抗體可在多階段阻止瘧原蟲的生長發(fā)育。前期研究的免疫熒光結(jié)果顯示，PP5蛋白表達于紅內(nèi)期和配子體期原蟲胞漿。由于紅內(nèi)期晚期和配子體期細胞膜的高通透性可使免疫血清中特異性抗體進入細胞內(nèi)部，進而與特異性抗原結(jié)合。因此，抗PP5蛋白的免疫血清可能影響原蟲生長發(fā)育的多個階段。與預(yù)期結(jié)果一致，在1∶5和1∶10倍稀釋免疫血清加入培養(yǎng)基后，與對照組相比雄配子體出絲水平明顯下降?？筆P5免疫血清對紅內(nèi)期原蟲生長發(fā)育的作用尚需深入研究。

綜上所述，我們應(yīng)用抗PP5免疫血清，通過使用鼠瘧模型確定了伯氏瘧原蟲PP5作為新的TBVs候選抗原的傳播阻斷能力，為TBVs的研發(fā)提供了一定的理論與實驗素材，并為惡性瘧原蟲和間日瘧原蟲PP5蛋白作為瘧疾傳播阻斷疫苗候選抗原可行性的深入研究奠定了理論基礎(chǔ)。