雷珊 曾智銳 薛燕 蘭金芝 孫遠梅 陳騰祥，

貴州醫(yī)科大學1基礎醫(yī)學院生理學教研室，2貴州省再生醫(yī)學重點實驗室（貴陽550004）

胰腺癌是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，因早期極易發(fā)生侵襲轉移且缺乏特異性的診斷指標，大多數(shù)患者發(fā)現(xiàn)時已屬晚期［1］，手術是目前治療胰腺癌有效的手段之一，但復發(fā)率極高。至今，胰腺癌的病因及發(fā)展機制尚不清楚，仍缺少有效的靶向治療靶點及分子標志物［2］。有研究表明，胰腺癌的發(fā)展是一個多步驟、多因素參與的過程，因此從分子水平闡明胰腺癌發(fā)生、轉移的分子機制，尋找特定有效的靶向治療分子靶點可能是早期診斷和治療胰腺癌的重要手段之一［3-4］。

長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是轉錄本的長度超過200 個堿基序列且自身沒有編碼蛋白能力的RNA，主要是通過基因的轉錄、翻譯以及染色體重構等多種途徑參與基因表達，具有調節(jié)各種生物過程的潛力［5］。研究表明，LncRNA 的表達與多種疾病發(fā)生發(fā)展相關，例如LncRNA ROR 在胰腺癌組織中高表達且促進胰腺癌細胞增殖［6］，LncRNA PVT1 促進鼻咽癌細胞的增殖轉移［7］等。然而在最新研究報道中，LINC00152 在多種惡性腫瘤中異常表達，促進腫瘤的發(fā)展［8-9］。且在本課題前期篩選基因時發(fā)現(xiàn)LINC00152 在胰腺癌組織中異常高表達?；诖?，本研究進一步通過qRT-PCR 法檢測6 株人胰腺癌細胞系和人胰腺導管上皮細胞、胰腺癌組織和癌旁組織中LINC00152 的表達情況，并進一步探討其與患者臨床病理特征及其預后的關系，為胰腺癌的治療和預后分析提供新的標志物。

1 材料與方法

1.1 細胞及組織人胰腺癌細胞系PANC-1，MIA PaCa-2，Panc 03.27，AsPC-1，SW1990，CFPAC-1 和人胰腺導管上皮細胞HPDE 均購自美國模式培養(yǎng)物集存庫，細胞均采用在10% 胎牛血清、高糖DMEM 培養(yǎng)基、5%CO2、37 ℃的條件下培養(yǎng)，每2 天更換一次新鮮培養(yǎng)基，融合度達85%左右進行傳代。狀態(tài)好的細胞用于后續(xù)實驗。組織標本從華中科技大學同濟醫(yī)學院和貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院臨床樣本庫中獲得胰腺癌組織及其癌旁組織共100 例，所有患者在手術前均未進行放療、化療及生物免疫治療等任何抗腫瘤治療，并且未合并其他器官的惡性腫瘤。全部標本均由組織學確診。100 例組織中，男63 例，女37 例；年齡＜60 歲有47 例，≥60 歲有53 例；腫瘤直徑＜3 cm 有53 例，腫瘤直徑≥3 cm 有47 例；TNM 分期：Ⅰ+Ⅱ期有68例，Ⅲ+Ⅳ期有32例；發(fā)生淋巴結轉移的有49例，未發(fā)生淋巴結轉移的有51 例，實驗標本的使用均獲得了患者本人及其家屬的同意，實驗過程均由倫理委員會證實符合倫理學規(guī)范。

1.2 試劑及儀器高糖DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）均購自Gibco 生物公司（美國），TRIzol 試劑購自Invitrogen 生物公司（美國）；PCR 相關試劑及逆轉錄試劑盒均購自TaKaRa 生物公司（日本）；LINC00152 和內參GAPDH 引物設計及合成皆由武漢天一輝遠有限公司完成。熒光PCR 檢測系統(tǒng)購自BIO-RAD（美國）。

1.3 檢測組織和細胞中LINC00152 的表達用TRIzol 法提取組織及細胞中的總RNA，總RNA 經(jīng)過70%乙醇洗滌后用無酶水稀釋，取1 μL 稀釋后的RNA 滴加在用分光光度計中，檢測提取的總RNA 的濃度及純度，測得的RNA 的吸光度（A）值，其中RNA的A260 nm/A280 nm 在1.8～2.0范圍內的為合格樣品，用于逆轉錄和PCR 反應。取1 000 ng的總RNA，按照TaKaRa 試劑盒的說明書進行逆轉錄；以逆轉錄好的cDNA 為模板，qRT-PCR 試劑盒和引物為試劑，按照公司提供的PCR 的反應步驟，進行實時熒光定量PCR 反應。結果以GAPDH 作為內參，采用2-ΔΔCt法計算LINC00152 的相對表達量。LINC00152 上游引物序列：aaaatcacgactcagccccc，LINC00152 下游引物序列：aatgggaaaccgaccagacc；GAPDH 上游引物序列：ggagcgagatccctccaaaat，GAPDH 下游引物序列：ggctgttgtcatacttctcatgg。

1.4 統(tǒng)計學方法實驗數(shù)據(jù)均采用SPSS 18.0 軟件進行統(tǒng)計學分析。實驗結果以± s 表示，組間比較用t 檢驗表示，不同處理組間采用單因素方差分析，LINC00152 的表達與患者的臨床性狀關系采用卡方分析；生存分析采用Kaplan-Meier 生存曲線描繪及分析。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 LINC00152 在人胰腺癌細胞系和人胰腺導管上皮細胞系中的表達實時熒光定量PCR 結果顯示：以HPDE 細胞中的LINC00152 表達水平（1.01±0.02）作為對比，PANC-1、MIA PaCa-2、Panc 03.27、AsPC-1、SW1990、CFPAC-1 的LINC00152 相對表達水平分別為：（3.01 ± 0.12）、（2.84 ± 0.03）、（2.56 ±0.16）、（2.36 ± 0.21）、（2.24 ± 0.06）、（2.16 ± 0.14）。6 種人胰腺癌細胞系PANC-1，MIAPaCa-2、Panc 03.27、AsPC-1、SW1990、CFPAC-1 中LINC00152 的表達水平顯著高于人胰腺導管上皮細胞系HPDE，差異結果有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。見圖1。

圖1 LINC00152 在人胰腺癌細胞系和人胰腺導管上皮細胞系中的表達Fig.1 Expression of LINC00152 in human pancreatic cancer cells and human pancreatic ductal cell

2.2 LINC00152 在胰腺癌組織和癌旁組織中的表達采用實時熒光定量PCR 檢測LINC00152 在胰腺癌組織和臨近的癌旁組織中的表達。結果顯示，LINC00152 在人胰腺癌組織和相對應的癌旁組織中相對表達水平分別為（1.02±0.14）、（8.48±0.46）。與癌旁組織相比，胰腺癌組織中LINC00152的表達水平顯著升高差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。見圖2。

圖2 人胰腺癌組織和癌旁組織中的LINC00152 表達水平Fig.2 Expression of LINC00152 in human pancreatic cancer tissuse and adjacent pancreatic tissuse

2.3 LINC00152 表達與胰腺癌患者臨床病理參數(shù)的關系以LINC00152 的表達水平均值為界值，將患者分為LINC00152 高表達（≥7.55）組（n=50）和LINC00152低表達（＜7.55）組（n=50），用卡方檢驗分析LINC00152 的表達與胰腺癌患者在臨床上的病理特征之間的關系。結果顯示，LINC00152的表達與腫瘤淋巴結是否發(fā)生轉移及臨床分期密切相關（均P＜0.05），而與患者的腫瘤直徑的大小、性別及年齡無關（均P＞0.05），見表1。

2.4 胰腺癌組織中LINC00152 表達水平與胰腺癌患者預后的關系將100 例胰腺癌患者分為LINC00152 高表達組和LINC00152 低表達組，進行Kaplan-Meier分析，結果顯示，相對于LINC00152低表達組，高表達組患者的生存率明顯下降，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），表明癌組織中LINC00152表達水平可影響患者預后。見圖3。

3 討論

作為消化系統(tǒng)的惡性腫瘤，胰腺癌已躍居惡性腫瘤死亡的第4 位，全世界胰腺癌的發(fā)病率與死亡率逐年增長，到2030年胰腺癌預計成為第二大癌癥死亡原因［10-11］，80% 的癌癥患者在確診時已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有局部轉移［12］。手術是主要治療方式，雖然胰腺癌的手術及化療取得了一定進展，然而目前胰腺癌治愈性切除率僅5% ，且術后并發(fā)癥多，導致手術療效不盡如人意［13］。轉移復發(fā)是其治愈率低的主要原因，這個問題無法通過手術解決，而早期診斷和靶向治療可以成為綜合治療的手段彌補手術治療的不足。分子靶點包括了DNA和蛋白質，而今年來非編碼的RNA 也發(fā)現(xiàn)參與了基因和蛋白質的表達調控，和腫瘤的發(fā)生發(fā)展息息相關。

表1 胰腺癌組織中LINC00152 的表達水平與胰腺癌患者臨床病理參數(shù)的關系Tab.1 The expression of LINC00152 in pantients with pancreatic cancer and corresponding clinical data 例

圖3 胰腺癌組織中的不同LINC00152 的表達水平患者的Kaplan-Meier 生存曲線Fig.3 Kaplan-Meier survival curve was performed to detect the effect of LINC00152 on pancreatic cancer patient outcome

在非編碼的RNA中，長鏈非編碼RNA（lncRNA）也參與的基因的表達調控，是表觀遺傳學中的重要內容。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，lncRNA 在多種癌癥中表達異常，通過基因表達調控，參與了腫瘤細胞的增殖、凋亡、侵襲及遷移生物學和病理生理學過程，是目前的研究熱點之一［14］。有研究表明，LINC00152 在多種惡性腫瘤組織的表達水平出現(xiàn)異常，如SUN等［15］報道LINC00152 作為miR-497 的競爭性內源RNA 下調其下游靶腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子BDNF，從而促進如乳頭狀甲狀腺癌的侵襲和轉移；CHEN等［16］發(fā)現(xiàn)，LINC00152 在卵巢癌組織和細胞系中表達顯著上調，LINC00152 的基因沉默可以抑制癌細胞增殖，誘導癌細胞凋亡，從而抑制腫瘤生長。目前，有關LINC00152 在胰腺癌中表達情況的研究甚少。

本研究檢測了人胰腺癌細胞系PANC-1，MIA PaCa-2，Panc 03.27，AsPC-1，SW1990，CFPAC-1 和人胰腺導管上皮細胞系HPDE 中LINC00152 的表達水平，結果發(fā)現(xiàn)相對于人胰腺導管上皮細胞系HPDE，LINC00152 在其它6 株胰腺癌細胞系均有不同程度的表達上調。本研究還檢測了100例胰腺癌臨床病例的癌組織及癌旁組織中LINC00152 的表達水平，結果發(fā)現(xiàn)相對于癌旁組織，LINC00152在癌組織中表達顯著增高；進一步統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，LINC00152 的表達與患者的淋巴結是否發(fā)生轉移及TNM 分期密切相關，與患者的腫瘤直徑的大小、性別及年齡等因素沒有相關性，提示LINC00152表達的上調與胰腺癌轉移有著密切的相關性。

然而，LINC00152 在胰腺癌中的表達上調是否影響胰腺癌的預后，目前還沒有報道。本研究選取了100 例胰腺癌患者，根據(jù)表達水平，將患者分為LINC00152 高表達組和LINC00152 低表達組，通過病人后期的隨訪信息，繪制了生存曲線。結果發(fā)現(xiàn)，LINC00152 高表達組的患者存活時間較短，預后較差，而LINC00152 低表達組患者存活時間較長，預后相對較好。這個結果與其他課題組在胃癌、宮頸癌和肝癌中的發(fā)現(xiàn)相一致［17-19］，提示LINC00152 可以作為判斷胰腺癌預后的分子生物學標志物。

綜上所述，胰腺癌中LINC00152 表達異常增高，是影響患者預后的危險因素，本研究為胰腺癌的靶向治療以及預后分析提供了新的方向。