郭睿洲 趙彥濤 李利 胡先同

作者單位：100039 北京，解放軍醫(yī)學院 ( 郭睿洲 )；100048 北京，解放軍總醫(yī)院第四醫(yī)學中心 ( 郭睿洲、趙彥濤，李利 )；100048 北京，骨科植入醫(yī)療器械工程技術(shù)研究中心 ( 胡先同 )

自體骨移植因其具有骨誘導、骨傳導和成骨能力而成為金標準[1-3]，但是自體骨存在供區(qū)疼痛和局部并發(fā)癥如血腫、骨折的潛在發(fā)生及數(shù)量有限等缺點[4]。長期以來異體移植物因其優(yōu)異的成骨性能和骨傳導性能被用作天然替代物覆蓋骨缺損[5]，而異體骨也存在如傳播疾病、排斥反應(yīng)、骨不愈合、移植物吸收、自體骨骨折及供體缺乏等缺點[1,4]。與自體骨和異體骨相比，異種骨亦具備成骨和骨誘導性能，且來源充足，安全可靠。目前的異種骨主要分為煅燒骨、脫鈣骨、凍干骨、冷凍骨，研究較多的主要為煅燒骨和脫鈣骨。煅燒骨的性能與礦物相類似，其骨傳導能力和生物相容性較好，但不具備骨誘導性能。它可與 BMP-2 等生長因子結(jié)合，用于脊柱融合及骨缺損修復[6]。脫鈣骨基質(zhì) ( decalcified bone matrix，DBM ) 通常采用鹽酸進行脫鈣，導致礦物質(zhì)成分丟失，但 I 型膠原、非膠原蛋白和骨誘導生長因子仍保存下來，包括不同濃度的骨形態(tài)發(fā)生蛋白 ( bone morphogenetic proteins，BMPs )、生長分化因子和轉(zhuǎn)化生長因子 ( transforming growth factor，TGF-β1、TGF-β2 和 TGF-β3 )，從而具有骨傳導性和骨誘導性[7]。脫礦質(zhì)過程使細胞外基質(zhì)中多種生長因子暴露出來，從而使有效的生物活性分子在宿主環(huán)境中發(fā)揮作用，脫鈣后釋放的 BMPs 可使干細胞向成骨分化，從而幫助骨愈合。但 DBM 力學性能較差，骨傳導能力較弱，且可能由于處理過程較復雜仍具有一定的生物毒性。由于脫鈣骨本身含有一定濃度的 BMP-2，具有骨誘導活性，但其與復合BMP-2 的煅燒骨相比，何者早期成骨效果更好并不明確，因此本實驗擬對這兩種骨誘導材料的早期成骨性能進行探討。

材料與方法

一、脫鈣骨及煅燒骨的制備

取成牛股骨髁經(jīng) -70 ℃ 冷凍后，用切割機切成5 mm×5 mm×5 mm 的骨塊后分為兩部分，一部分經(jīng)馬弗爐 700 ℃ 煅燒，另一部分先經(jīng)過高壓水槍沖洗，沖洗后使用 triton 1% 超聲清洗 30 min，超聲清洗后采用甲醇 / 氯仿 ( 1∶1 ) 進行脫脂，脫脂完成后采用 0.5 mol / ml 鹽酸進行脫鈣。加入 1∶3000 胃蛋白酶超聲 30 min 混勻，搖床反應(yīng) 8 h。30 U / ml 半乳糖苷酶，超聲 30 min 混勻，搖床反應(yīng) 8 h。50 U / ml DNA 酶超聲 30 min 混勻，搖床反應(yīng) 12 h，每次進行下一步工序前均采用純化水對骨塊進行沖洗，每次10 min，一共 3 次，超聲清洗過程中保持水溫不超過 37 ℃。酶處理后 75% 酒精沒過骨塊，搖床 100 r /min，持續(xù) 15 min，結(jié)束后放入凍干機凍干。

二、煅燒骨及脫鈣骨打粉

煅燒骨及脫鈣骨制備完成后分別進行研磨打粉處理，操作前先將骨塊浸入液氮防止打粉過程中溫度過高，打粉后將骨粉過篩網(wǎng)，篩選出粒徑 270～1000 μm 骨粉備用，脫鈣骨打粉完成后進行密封包裝，60鈷輻照滅菌。

三、煅燒骨復合 BMP-2

取 BMP-2 ( 北京睿泉生物技術(shù)公司提供 ) 與制備好的煅燒骨進行復合，加入濃度為 0.5 mg / g，加入適量 PBS 使液面沒過骨塊，充分震蕩混勻，-20 ℃預凍 30 min 后，放入凍干機進行凍干，持續(xù)12 h 后進行密封包裝，60鈷輻照滅菌。

四、動物模型的制作與分組

選用 7 只雄性新西蘭兔 ( 解放軍總醫(yī)院第四醫(yī)學中心動物實驗室提供 )，并分為三組：A 組為煅燒骨 / BMP-2，B 組為單純脫鈣骨基質(zhì)組，C 組為空白組。其中 A、B 組各 3 只，C 組 1 只。取速眠新 1.5 ml 與氯胺酮 1 ml 進行混合，混勻后 0.2 ml / kg耳緣靜脈注射麻醉，膝關(guān)節(jié)區(qū)域常規(guī)備皮、消毒、鋪巾，取髕骨外側(cè)縱行切口，長約 5 cm，逐層切開皮膚和肌肉，顯露股骨外側(cè)髁，取高速磨鉆鉆取直徑 4 mm，深度 10 mm 的圓柱形缺損，鉆孔過程中持續(xù)注入生理鹽水控溫。用鑷子夾取缺損骨旋轉(zhuǎn)后去除，在股骨外側(cè)髁缺損區(qū)域分別填入煅燒骨 /BMP-2、DBM，空白組不填入材料 ( 圖 1 )。逐層縫合傷口，術(shù)后正常飲食進水，術(shù)后前 3 天每天肌注青霉素 10 萬 U。

五、觀察指標

1. 植入后大體形態(tài)觀察：在第 4 周時處死 7 只新西蘭兔，將股骨內(nèi)外側(cè)髁至股骨干近端約 5 mm 處均完整取下，進行大體形態(tài)觀察。

2. 組織學觀察：股骨髁完整取下后使用 50%甲酸進行脫鈣，1 周后每天用細針頭在股骨干區(qū)域針刺，針頭透過股骨干至對側(cè)基本無阻力時視為脫鈣完全，脫鈣后放入脫水機進行脫水，隨后石蠟包埋、切片至 0.5 μm 厚度進行 HE 染色。

結(jié) 果

一、大體形態(tài)及組織學觀察

大體觀察顯示，煅燒骨 / BMP-2 材料完全覆蓋缺損區(qū)域，與周圍骨組織連結(jié)緊密，以細針頭針刺骨缺損區(qū)域無法穿透，缺損區(qū)域骨化面積約 75%～100%；單純 DBM 材料未能完全覆蓋骨缺損區(qū)域，材料與骨組織結(jié)合欠佳，邊緣尚留有空隙，以細針頭針刺骨缺損區(qū)域，部分區(qū)域可以穿透，骨化面積約 50%～75% ( 圖 2 )。

組織切片行蘇木精-伊紅染色后可見煅燒骨 /BMP-2 材料填充于直徑 0.4 cm 的圓形缺損區(qū)域內(nèi)，材料周圍均有大量新骨形成，材料與新生骨交織成片覆蓋整個缺損區(qū)域，可見大量的骨陷窩和骨細胞，亦可見部分骨小梁形成，未見炎癥細胞及新的血管形成。而單純 DBM 組可見大量成片的 DBM 將缺損中央?yún)^(qū)域填滿，僅在部分材料的邊緣區(qū)域見到少量成條索狀的新骨形成，材料與宿主骨之間及宿主骨周圍由纖維性組織填充，骨陷窩和骨細胞數(shù)量較少，未見新的骨小梁形成及新生血管 ( 圖 3 )。通過 imagepro-plus 6.0 軟件定量計算新生骨 ( 玫紅色 )的面積及新生骨占整個缺損區(qū)域的百分比 ( 表 1 )。

表1 兔股骨髁缺損中各組植入材料及新生骨面積的比較 (±s，n = 3 )Tab.1 Comparison of implant materials and new bone area in rabbit femoral condyle defects ( ±s, n = 3 )

表1 兔股骨髁缺損中各組植入材料及新生骨面積的比較 (±s，n = 3 )Tab.1 Comparison of implant materials and new bone area in rabbit femoral condyle defects ( ±s, n = 3 )

注：煅燒骨 / BMP-2 組與脫鈣骨基質(zhì)組的新生骨面積比較，差異有統(tǒng)計學意義，aP ＜ 0.05Notice: Differences of new bone area between calcined bone / BMP-2 group and decalcified bone matrix group were significant, aP ＜ 0.05

項目 鍛燒骨 / BMP-2 DBM新生骨面積 ( cm2 ) 0.0210±0.007a 0.0021±0.002材料面積 ( cm2 ) 0.0308±0.011 0.0337±0.025新生骨 / 缺損區(qū)域 0.1675±0.600a 0.0173±0.017

圖1 兔股骨髁缺損模型的建立及材料植入 a：外徑 4 mm 電鉆鉆孔；b：股骨髁 4 mm 缺損；c：植入缺損區(qū)域的煅燒骨 / BMP-2Fig.1 Establishment of rabbit femoral condyle defect model and material implantation a: Drilling with an electric drill of an outer diameter 4 mm;b: Femoral condyle 4 mm defects; c: Calcined bone / BMP-2 implanted in the defect area

討 論

DBM 是一種有吸引力的用來替代自體骨移植的材料，其具備的骨傳導性和骨誘導性可以幫助促進骨愈合。脫鈣引起礦化基質(zhì)內(nèi)以 BMP-2 為主的骨誘導生長因子暴露在表面，可以增強骨形成過程[8]。BMPs 是有效的骨誘導生長因子，在多種動物模型中已經(jīng)證明了其加速骨形成的效果顯著[9-10]。DBM 作為一種骨誘導材料，我們推測它可以通過 BMP-2 發(fā)揮較好的成骨效果。但是現(xiàn)有的臨床研究表明，關(guān)于 DBM 有效性的證據(jù)水平仍然較低[11]。關(guān)于 DBM的有效性和骨誘導潛力存在爭議，一些研究表明DBM 在骨再生和骨質(zhì)礦化中效率低下[12]。幾項動物實驗表明，單獨使用 DBM 可能不足以完全修復骨缺損[12-14]。幾項臨床前研究亦證實在臨界骨缺損中使用 DBM 后仍然缺乏骨再生[12,15-16]。對此，有可能的原因是不同的 DBM 產(chǎn)品中 BMP-2 的量存在差異，從而骨誘導能力有限。本研究中 DBM 組的成骨能力欠缺，有可能是由于制備過程中 BMP-2 部分丟失，而殘余的 BMP-2 未能達到最小治療劑量所致。另一方面，與煅燒骨相比，DBM 的主要成分中缺少羥基磷灰石等礦物質(zhì)成分，研究推測盡管 DBM 具備骨誘導活性，但可能并不是最適合 BMP-2 的載體形式。

圖2 大體形態(tài)觀察 a：缺損區(qū)域填入煅燒骨 / BMP-2；b：缺損區(qū)域填入 DBMFig.2 Gross morphology observation a: The defect area filled with calcined bone / BMP-2; b: The defect area filled with DBM

煅燒骨主要成分為羥基磷灰石，具有良好的生物相容性和骨傳導性能，幾乎沒有生物毒性。盡管其缺乏骨誘導性，但其骨傳導能力明顯優(yōu)于 DBM，且具有與骨發(fā)生化學鍵結(jié)合的能力[17]。多項研究已經(jīng)證實，煅燒骨在與 BMP-2 復合后可以解決其骨誘導能力缺乏的問題。Wu 等[18]通過體外研究闡明 BMP-2 ( rhBMP-2 ) 在與 hAMSCs 復合后添加在nHAC / PLA 上的作用，HAMSCs 出現(xiàn)了理想的成骨細胞 ( OB ) 分化能力并且 BMP-2 ( rhBMP-2 ) 有利于hAMSCs 的增殖和成骨。本實驗結(jié)果亦證實煅燒骨在與 BMP-2 復合后，不僅有了一定的骨誘導能力，且生物相容性和骨傳導能力均較好，是用于骨缺損修復的理想材料。本實驗采用的動物模型為兔股骨髁缺損模型，股骨髁作為負重骨，對機械穩(wěn)定性有著較高的要求，從本實驗大體觀察的結(jié)果來看，煅燒骨 / BMP-2 組骨與材料的連接性要優(yōu)于 DBM 組，骨化面積幾乎覆蓋整個缺損，而 DBM 材料與缺損之間仍留有縫隙。從組織學染色結(jié)果來看，煅燒骨在與BMP-2 復合后骨缺損部位的新生骨亦明顯多于 DBM組。對于這兩種材料的描述僅為半定量和定性的評價，缺乏絕對定量的指標，兩種材料在早期成骨方面影響究竟有多大的差異仍有待進一步的研究。

DBM 及煅燒骨 / BMP-2 均能在一定程度上促進早期成骨。而盡管 DBM 本身即含有少量 BMP-2，其成骨能力比之煅燒骨 / BMP-2 仍較弱。

圖3 植入材料后各組股骨髁缺損區(qū)域蘇木精 - 伊紅染色 a：煅燒骨 / BMP-2 ( 4 × )；b：煅燒骨 / BMP-2 ( 10 × )；c：DBM ( 4 × )；d：DBM ( 10 × )；e：空白組 ( 4 × )；f：空白組 ( 10 × )Fig.3 Hematoxylin-eosin staining in the femoral condyle defect area after implantation of materials a: Calcined bone / BMP-2 ( 4 × ); b: Calcined bone / BMP-2 ( 10 × ); c: DBM ( 4 × ); d: DBM ( 10 × ); e: Blank group ( 4 × ); f: Blank group ( 10 × )