汪瑜 羅梅懿 黃歆 熊德建 楊云戟 宋永丹 楊旭 陳維永

作者單位：610041 成都市第七人民醫(yī)院、成都市癌癥防治中心 ( 汪瑜、黃歆、熊德建、楊云戟、宋永丹、陳維永 )；610072 成都，四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院、四川省人民醫(yī)院 ( 羅梅懿 )；643000 四川，自貢市第四人民醫(yī)院皮膚腫瘤科 ( 楊旭 )通訊作者：陳維永，Email: wangyu167890@126.com

股骨頭缺血性壞死 ( avascular necrosis of femur head，ANFH ) 是一種高致殘性骨科疾病，其主要病理病機(jī)是血運(yùn)受阻導(dǎo)致骨質(zhì)缺血[1-2]。臨床統(tǒng)計(jì)，導(dǎo)致股骨頭壞死的因素早已高達(dá) 60 余種[3]。常見壞死類型有激素性、酒精性、外傷性、老年和兒童性；致病因素主要是創(chuàng)傷、藥物、酒精、骨質(zhì)疏松等[4]。激素性股骨頭缺血性壞死 ( steroid-induced avascular necrosis of femoral head，SANFH ) 因糖皮質(zhì)激素的過量使用，從而導(dǎo)致股骨頭缺血、骨細(xì)胞大量死亡，是臨床主要發(fā)病類型，占總發(fā)病率的57%[5]。阿托伐他汀除了可降膽固醇、降血液黏稠度等作用，其單獨(dú)或聯(lián)合應(yīng)用，還具有減輕 ANFH 癥狀的臨床療效[6]。葛根素是提取自葛根的一種黃酮類藥物，能夠刺激成骨細(xì)胞的增殖，提高成骨細(xì)胞的分化早期標(biāo)志物堿性磷酸酶的活性并兼具抗炎作用[7-8]，可應(yīng)用于 SANFH 治療。但二者聯(lián)合用藥尚無報道，聯(lián)合用藥能否增強(qiáng)療效值得研究。筆者旨在考察葛根素聯(lián)合阿托伐他汀對 SANFH 的作用效果及機(jī)制，為二者聯(lián)合用藥治療 SANFH 提供科研依據(jù)。

材料與方法

一、藥物

葛根素 ( 中國食品藥品鑒定研究院，批號：110752-201514 )、阿托伐他汀 ( 輝瑞制藥有限公司，批號：1037043 )、脂多糖 LPS ( 美國 Sigma 公司 )、甲潑尼龍 ( 美國輝瑞公司 )、生理鹽水、水合氯醛。

二、動物

采用成年雄性 SD 大鼠，共 50 只，12 周齡，體重 400～450 g，許可證號：SCXK ( 川 ) 2015-030，養(yǎng)殖溫度 22 ℃～26 ℃，濕度 37%～42%，光照按12 h 晝夜交替，自由攝食飲水，每籠 2 只。適應(yīng)性喂養(yǎng) 1 周后隨機(jī)分為 5 組，每組 10 只。動物和試驗(yàn)場地由成都里來生物科技有限公司提供。

三、主要試劑

TRIZOL，美國 Invitrogen 公司生產(chǎn)，批號：15596-026；PrimeScript RT reagent Kit，寶生物工程( 大連 ) 有限公司生產(chǎn)，批號：BK501；SYBR Premix Ex Taq II Kit，寶生物工程 ( 大連 ) 有限公司生產(chǎn)，批號：BK402；大鼠 PGE2 ELISA 試劑盒、大鼠 TXB2 ELISA 檢測試劑盒，大鼠 TGF-β1 ELISA 試劑盒，購于上海鑫樂；TUNEL 試劑盒 ( In situ cell death detection kit-POD 法，10279600 )，購自瑞士 Roche公司；甲醛、伊紅液、蘇木素 ( AR 級 )。

四、主要儀器

RT-PCR 儀 ( PIKORed 96，ThermoFisher )，全自動組織脫水機(jī) ( TSJ-II，常州中威 )，包埋機(jī)( BMJ-III，常州中威 )，病理組織漂烘儀 ( PHY-III，常州中威 )，數(shù)碼三目攝像顯微鏡 ( BA400 Digital )，酶標(biāo)儀 ( Multlskan )，低溫離心機(jī) ( C2500，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)儀器 )，壓力蒸汽滅菌器 ( SYQ-DSX-280B，上海宜川 )，高精密電子天平 ( BN-200，臺灣巨林櫻花 )。

五、分組及造模

50 只 SD 大鼠按隨機(jī)數(shù)字表，隨機(jī)分為空白對照組 ( A )、模型組 ( B )、阿托伐他汀組 ( C )、葛根素組 ( D ) 和聯(lián)合用藥組 ( E )，每組 10 只。每組大鼠精確稱重后，B、C、D、E 組均分別以 20 μg / kg 劑量尾靜脈注射 LPS 2 天，每天 1 次，末次注射 24 h后，臀肌注射 40 mg / kg 劑量甲潑尼龍 3 天，每天1 次[9]?？瞻讓φ战M A 臀肌注射等體積無菌生理鹽水。造模的同時，C 組灌胃阿托伐他汀20 mg/kg，D 組灌胃葛根素 400 mg / kg，E 組灌胃 20 mg / kg 阿托伐他汀及 400 mg / kg 葛根素，每天 1 次，連續(xù)8 周。第 8 周治療結(jié)束后 2 h，采集各組大鼠血樣，收集血清于 -80 ℃ 保存待測；處死大鼠，采集左側(cè)股骨頭組織，按后續(xù)操作用于組織病理學(xué)檢測；采集右側(cè)股骨頭，剔除軟骨，置于盛有 1 ml Trizol 的研磨器中仔細(xì)研碎，按后續(xù)操作提取骨標(biāo)本總 RNA。

六、檢測指標(biāo)

1. 血清指標(biāo)檢測：采用 ELISA 試劑盒檢測各組大鼠血清 PGE2、TXB2、TGF-β1 含量。

2. RT-PCR 檢測：按試劑盒說明書，提取大鼠總 RNA，檢測 A260 和 A280 吸光度值，電泳確定RNA 的完整性后，按照 PrimeScript RT reagent Kit 說明書合成 cDNA 第一鏈。設(shè)計(jì) BMP-2、COX-2、TGF-β1、VEGF 上下游引物，以 β-actin 作為內(nèi)參基因，按照 SYBR Premix Ex Taq II Kit 說明書，檢測股骨頭組織 BMP-2、COX-2、TGF-β1、VEGF mRNA表達(dá)量。

3. 組織病理檢測：采集的股骨頭組織，于多聚甲醛固定 3 天后進(jìn)行脫水脫鈣處理，二甲苯透明，石蠟包埋，切片，取部分切片 HE 染色，鏡下觀察骨髓細(xì)胞以及骨髓內(nèi)脂肪細(xì)胞，骨小梁以及骨細(xì)胞。

4. 免疫組化檢測：采用免疫組化 SABC 方法，檢測股骨頭組織 cAMP、PGE2 表達(dá)。鏡下觀察細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞外基質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色反應(yīng)產(chǎn)物判定為陽性。照相后采用圖像分析軟件 Image-Pro Plus 6.0 ( 美國 Media Cybernetics 公司 ) 進(jìn)行光密度測定和圖像分析。

5. 細(xì)胞凋亡檢測：石蠟切片，經(jīng)脫蠟水化后，根據(jù) TUNEL 凋亡試劑盒說明書操作，鏡下觀察骨細(xì)胞凋亡情況。計(jì)算細(xì)胞凋亡指數(shù) ( AI )。計(jì)算公式：AI＝凋亡細(xì)胞數(shù) / 細(xì)胞總數(shù)×100%，取平均數(shù)。

七、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

運(yùn)用 SPSS 20.0 軟件對模型和空白對照組進(jìn)行t檢驗(yàn)；各治療組與模型組間進(jìn)行單因素方差統(tǒng)計(jì)分析，定量資料以±s描述，除特別說明外，檢驗(yàn)水準(zhǔn) α 均設(shè)定為 0.05，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、血清指標(biāo)檢測

模型組大鼠血清 PGE2、TXB2 含量較空白對照組明顯增加 (P＜0.01 )，TGF-β1 含量明顯降低 (P＜0.01 )。通過不同藥物干預(yù)，阿托伐他汀組和聯(lián)合用藥組 PGE2、TXB2 含量較模型組明顯降低 (P＜0.05，P＜0.01 )，TGF-β1 含量明顯升高 (P＜0.01 )，葛根素組 PGE2、TXB2、TGF-β1 含量較模型組無明顯變化 (P＞0.05 ) ( 表 1 )。

二、RT-PCR 檢測

RT-PCR 結(jié)果顯示模型組較空白對照組股骨頭組織 BMP-2、TGF-β1、VEGF mRNA 表達(dá)明顯降低 (P＜0.01 )，COX-2 mRNA 表達(dá)明顯增加 (P＜0.01 )。經(jīng)不同藥物干預(yù)，與模型組比較，葛根素組 BMP-2、VEGF mRNA 表達(dá)明顯增加 (P＜0.05 )，COX-2、TGF-β1 mRNA 表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0.05 )；聯(lián)合用藥組 BMP-2、TGF-β1、VEGF mRNA 表達(dá)均明顯增加 (P＜0.01 )，COX-2 mRNA 表達(dá)明顯降低 (P＜0.05 )；阿托伐他汀組 BMP-2、COX-2、TGF-β1、VEGF mRNA 表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0.05 ) ( 表 2 )。

三 、組織病理檢測

空白對照組：成骨細(xì)胞數(shù)量多，骨細(xì)胞清晰，骨小梁排列規(guī)則整齊，造血細(xì)胞豐富。模型組：骨小梁數(shù)量、骨細(xì)胞數(shù)量、軟骨下血管、造血細(xì)胞數(shù)量均減少，脂肪細(xì)胞體積增大，血管減少。

阿托伐汀組：成骨細(xì)胞及造血細(xì)胞多見，骨小梁較粗，空骨陷窩少，髓腔內(nèi)無出血，脂肪細(xì)胞基本正常。

葛根素組：骨細(xì)胞數(shù)目增多，造血細(xì)胞及成骨細(xì)胞多見，脂肪細(xì)胞基本正常。聯(lián)合用藥組：軟骨細(xì)胞、骨細(xì)胞排列整齊，骨小梁致密，髓腔內(nèi)有大量造血細(xì)胞，脂肪細(xì)胞分布均勻，造血細(xì)胞豐富。

聯(lián)合用藥組較兩組單一用藥組，骨小梁增寬更明顯，間距更小，且骨髓細(xì)胞和造血細(xì)胞增生更明顯，修復(fù)效果更佳 ( 圖 1 )。

四、免疫組化檢測

免疫組化結(jié)果顯示 cAMP、PGE2 在股骨頭組織中表達(dá)趨勢一致，均表現(xiàn)為模型組明顯高于空白對照組 (P＜0.01 )；3 組藥物治療組均可明顯降低股骨頭組織 cAMP、PGE2 的表達(dá) (P＜0.01 ) ( 表 3、2 )。

表1 各組大鼠血清中相關(guān)因子的含量 (±s)Tab.1 Contents of related factors in serum of each group of rats (±s)

表1 各組大鼠血清中相關(guān)因子的含量 (±s)Tab.1 Contents of related factors in serum of each group of rats (±s)

注：模型組與空白對照組比較，**P＜0.01；各治療組與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01Notice: The model group was compared with the blank control group, **P ＜ 0.01;each treatment group was compared with the model group, #P ＜ 0.05, ##P ＜ 0.01

組別 ( n = 10 ) PGE2 ( pg / ml ) TXB2 ( pg / ml ) TGF-β1 ( ng / ml )空白對照組 70.74±3.23 86.76±2.41 47.07±2.02模型組 79.06±3.16** 93.01±3.26** 37.23±3.06**阿托伐他汀 75.80±4.04# 88.38±2.11## 41.04±2.77##葛根素 77.61±3.32 93.04±2.61 39.60±2.91聯(lián)合用藥 75.40±3.61# 87.41±1.70## 45.20±3.18##

表2 各組大鼠股骨頭組織中相關(guān)基因的表達(dá)量 (±s)Tab.2 Expression levels of related genes in the femoral head tissue of each group of rats (±s)

表2 各組大鼠股骨頭組織中相關(guān)基因的表達(dá)量 (±s)Tab.2 Expression levels of related genes in the femoral head tissue of each group of rats (±s)

注：模型組與空白對照組比較，**P＜0.01；各治療組與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01Notice: The model group was compared with the blank control group, **P ＜ 0.01;each treatment group was compared with the model group, #P ＜ 0.05, ##P ＜ 0.01

組別 ( n = 10 ) BMP-2 COX-2 TGF-β1 VEGF空白對照組 1.00±0.04 1.01±0.19 1.00±0.06 1.00±0.11模型組 0.45±0.15** 2.03±0.35** 0.40±0.09** 0.55±0.03**阿托伐他汀 0.69±0.05 1.73±0.17 0.39±0.03 0.58±0.11葛根素 0.73±0.15# 1.65±0.11 0.58±0.06 0.77±0.12#聯(lián)合用藥 0.86±0.21## 1.53±0.42# 0.87±0.20## 0.86±0.12##

表3 各組大鼠股骨頭組織中的免疫指標(biāo)結(jié)果 (±s)Tab.3 Results of immunological indicators in femoral head tissues of each group of rats (±s)

表3 各組大鼠股骨頭組織中的免疫指標(biāo)結(jié)果 (±s)Tab.3 Results of immunological indicators in femoral head tissues of each group of rats (±s)

注：模型組與空白對照組比較，**P＜0.01；各治療組與模型組比較，##P＜0.01Notice: The model group was compared with the blank control group, **P ＜ 0.01;each treatment group was compared with the model group, ##P ＜ 0.01

組別 ( n = 10 ) cAMP PGE2空白對照組 0.2982±0.0045 0.3414±0.0096模型組 0.3505±0.0044** 0.3755±0.0045**阿托伐他汀 0.3284±0.0018## 0.3746±0.0013##葛根素 0.3222±0.0060## 0.3608±0.0020##聯(lián)合用藥 0.3108±0.0099## 0.3571±0.0031##

五、TUNEL 細(xì)胞凋亡檢測

細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示模型組較空白對照組細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯升高 (P＜0.01 )，3 組藥物治療組均可明顯降低細(xì)胞凋亡指數(shù) (P＜0.01 )，其中聯(lián)合用藥組凋亡指數(shù)最低 ( 表 4，圖 3 )。

圖1 大鼠股骨頭組織病理組織學(xué)變化 ( HE )Fig.1 Histopathological changes of rats femoral head tissue ( HE )

圖2 大鼠股骨頭組織免疫組化結(jié)果 ( × 400 )Fig.2 Results of immunohistochemical in rats femoral head tissue( × 400 )

表4 各組大鼠股骨頭組織細(xì)胞凋亡指數(shù) (±s)Tab.4 Apoptosis index of femoral head tissues in each group of rats(±s)

表4 各組大鼠股骨頭組織細(xì)胞凋亡指數(shù) (±s)Tab.4 Apoptosis index of femoral head tissues in each group of rats(±s)

注：模型組與空白對照組比較，**P＜0.01；各治療組與模型組比較，##P＜0.01Notice: The model group was compared with the blank control group, **P ＜ 0.01;each treatment group was compared with the model group, ##P ＜ 0.01

組別 ( n = 10 ) 凋亡指數(shù)空白對照組 2.99±0.31模型組 27.55±2.35**阿托伐他汀 6.20±1.58##葛根素 8.73±1.00##聯(lián)合用藥 3.94±0.62##

討 論

SANFH 是糖皮質(zhì)激素過量使用，導(dǎo)致股骨頭缺血、骨細(xì)胞大量死亡而引發(fā)的骨科常見疾病，致殘率極高[10]。本試驗(yàn)在大鼠 SANFH 模型基礎(chǔ)上，分別采用阿托伐他汀、葛根素及二者聯(lián)合用藥治療，首先從組織病理角度考察療效。結(jié)果表明，模型組骨小梁骨細(xì)胞數(shù)量、造血細(xì)胞數(shù)量均減少，脂肪細(xì)胞體積增大。阿托伐汀、葛根素單一用藥可使周圍成骨細(xì)胞及骨細(xì)胞數(shù)增多，造血細(xì)胞數(shù)增加，脂肪細(xì)胞基本正常。聯(lián)合用藥組的骨細(xì)胞排列整齊，骨小梁致密，造血細(xì)胞豐富，脂肪細(xì)胞分布均勻。聯(lián)合用藥組較兩組單一用藥組，骨小梁增寬更明顯，間距更小，且骨髓細(xì)胞和造血細(xì)胞增生更明顯，修復(fù)效果更佳，表明阿托伐汀和葛根素均可明顯減輕SANFH 病理損傷。同時，本研究還考察了不同藥物對骨細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果顯示，模型組細(xì)胞凋亡指數(shù)較空白組明顯升高 (P＜0.01 )，3 個藥物組細(xì)胞凋亡指數(shù)較模型組均明顯降低 (P＜0.01 )，聯(lián)合用藥較單一用藥降低更明顯，表明聯(lián)合用藥可更好地促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)骨形成。

圖3 大鼠股骨頭組織細(xì)胞凋亡Fig.3 Apoptosis of rats femoral head tissue

SANFH 發(fā)病機(jī)制的兩種主要學(xué)說為血管內(nèi)凝血學(xué)說和脂肪代謝紊亂學(xué)說，圍繞學(xué)說開展調(diào)控機(jī)制研究[11]。PGE2 不僅可直接刺激神經(jīng)末梢提高痛覺感受器的敏感性，與炎性致痛物質(zhì)作用而引起疼痛[12]，且可雙向調(diào)節(jié)骨生成，低濃度 PGE2 可以促進(jìn)骨生成，高濃度 PGE2 則可刺激骨吸收[13]。骨形成過程主要依賴于破骨細(xì)胞主導(dǎo)的骨吸收和成骨細(xì)胞主導(dǎo)的骨生成兩個過程[14-15]。當(dāng)骨生成小于骨吸收，會出現(xiàn)骨丟失現(xiàn)象，如：骨礦含量和骨基質(zhì)成分等比例的減少、骨皮質(zhì)變薄、骨小梁減少變細(xì)，從而導(dǎo)致骨壞死，而當(dāng)機(jī)體內(nèi) PGE2 濃度過高，將刺激破骨細(xì)胞骨吸收。本試驗(yàn)檢測結(jié)果顯示，模型組血清及股骨頭組織 PGE2 含量較空白組均明顯升高 (P＜0.01 )，與模型組比較，葛根素聯(lián)合阿托伐他汀組 PGE2 含量明顯降低 (P＜0.05 )，說明聯(lián)合用藥可以促進(jìn)骨生成。TXB2 濃度過高，可凝聚血小板，形成血栓，引起股缺血，TXB2 與 PGE2 共同作用可加速骨壞死。COX-2 屬于誘導(dǎo)性表達(dá)基因，一般情況下，COX-2 在機(jī)體內(nèi)的大部分組織中幾乎無表達(dá)[16]。但當(dāng)其被刺激信號刺激時，將大量表達(dá)，且能夠通過催化反應(yīng)轉(zhuǎn)化氨基酸，最終形成 PGE2。作為 PGE2 的限速酶，COX-2 能夠調(diào)控 PGE2 的活性[17]。本試驗(yàn)檢測發(fā)現(xiàn)，模型組 TXB2、COX-2 含量明顯升高 (P＜0.01 )，與模型組比較，葛根素、阿托伐他汀單一用藥對 COX-2 含量降低無明顯變化(P＞0.05 )，阿托伐他汀組可明顯降低 TXB2 含量(P＜0.01 )，而聯(lián)合用藥組 TXB2、COX-2 含量均明顯降低 (P＜0.05，P＜0.01 )，表明聯(lián)合用藥可抑制骨壞死。cAMP，作為 PGE2 介導(dǎo)的下游因子，在病理狀態(tài)下，PEG2 可以通過 cAMP 介導(dǎo)的通路促進(jìn)破骨過程。當(dāng) COX-2 / PGE2 / cAMP 通路被激活，COX-2、PGE2、TXB2、cAMP 均大量釋放，共同加速骨壞死進(jìn)程。免疫組化試驗(yàn)發(fā)現(xiàn) cAMP 含量模型組較空白組明顯升高 (P＜0.01 )，3 個藥物治療組cAMP 表達(dá)較模型組均明顯降低 (P＜0.01 )，且聯(lián)合用藥組低于單一用藥組。TGF-β1 可以促進(jìn)骨細(xì)胞增殖、調(diào)控未分化間充質(zhì)干細(xì)胞增殖分化、支持破骨細(xì)胞形成、促進(jìn)骨與血管形成以及骨吸收的作用，是重要的耦聯(lián)調(diào)節(jié)因子[18]。RT-PCR 結(jié)果顯示模型組TGF-β1 mRNA 表達(dá)較空白組明顯降低 (P＜0.01 )，僅聯(lián)合用藥較模型組可明顯升高 TGF-β1 mRNA 表達(dá)(P＜0.01 )。軟骨內(nèi)成骨是骨形成的重要過程，而在軟骨內(nèi)成骨過程中，需新生成血管，VEGF 則是促進(jìn)血管形成的重要調(diào)節(jié)因子。BMP 是促進(jìn)成骨細(xì)胞分化、誘導(dǎo)骨形成的重要活性物質(zhì)[19]，其中 BMP-2 的活性最強(qiáng)。有研究發(fā)現(xiàn) VEGF 與 BMP-2 相互調(diào)節(jié)，共同促進(jìn)骨形成以及骨愈合[20]。RT-PCR 檢測結(jié)果顯示模型組 VEGF、BMP-2 mRNA 表達(dá)較空白組明顯降低 (P＜0.01 )，葛根素組、聯(lián)合用藥較模型組BMP-2、VEGF mRNA 表達(dá)明顯升高 (P＜0.05，P＜0.01 )，聯(lián)合用藥較單一用藥升高更明顯，表明聯(lián)合用藥還可通過提高股骨頭組織 VEGF、BMP-2 mRNA表達(dá)促進(jìn)骨形成及骨愈合。

綜上所述，葛根素聯(lián)合阿托伐他汀可通過抑制COX-2 / PGE2 / cAMP 信號通路，明顯減輕股骨頭壞死癥狀，抑制破骨細(xì)胞的吸收能力，加強(qiáng)成骨細(xì)胞分化，減少骨丟失。