耿壯 徐麗麗 張曉英 王顏剛*

1. 青島大學(xué)附屬醫(yī)院內(nèi)分泌與代謝性疾病科，山東 青島 266000 2. 青島大學(xué)附屬醫(yī)院急診科，山東 青島 266000

骨質(zhì)疏松癥是一種骨代謝障礙，由于成骨細(xì)胞的形成與破骨細(xì)胞的吸收不平衡，導(dǎo)致骨質(zhì)脆弱、易于發(fā)生骨折[1-2]。它是一種潛移默化、不可預(yù)測(cè)的疾病，直到進(jìn)入晚期階段才會(huì)出現(xiàn)癥狀[3]。

絕經(jīng)后女性卵巢性激素缺乏是引起骨質(zhì)疏松癥的主要危險(xiǎn)因素。據(jù)預(yù)測(cè)截止到2050年，全球有一半以上的骨質(zhì)疏松性髖骨骨折將發(fā)生在亞洲[4]。目前用于治療骨質(zhì)疏松癥的藥物，包括雌激素替代治療(HRT)、雙膦酸鹽和選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑(SERMs)等[5]，然而，這些藥物存在潛在的副作用，包括雙膦酸鹽的胃腸道耐受問(wèn)題和HRT潛在導(dǎo)致惡性腫瘤發(fā)生的困擾[6-7]。因此，具有抗骨質(zhì)疏松活性的天然化合物是目前研究的熱點(diǎn)。黃酮類化合物已被廣泛應(yīng)用于延緩絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥。研究[21-22]表明，黃酮類化合物(如槲皮素)可防止骨質(zhì)流失。槲皮素是主要的黃酮醇，主要被發(fā)現(xiàn)為糖苷(蘆丁也被稱為槲皮素- 3-o-rutinose)，它與雌激素受體結(jié)合，并影響幾種激素依賴性癌癥細(xì)胞系的發(fā)育。在食品中，槲皮素主要存在于糖苷和蘆丁。蘆丁顯示具有抗氧化性，能夠抑制癌細(xì)胞的生長(zhǎng)[23-24]。本研究將探討蘆丁對(duì)去卵巢大鼠骨代謝的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 化學(xué)試劑：蘆丁購(gòu)自國(guó)家控制藥品和生物制品研究所，經(jīng)高效液相色譜法測(cè)定其純度≥ 98%。除另有說(shuō)明外，其他所有試劑均為分析級(jí)。

1.1.2 動(dòng)物分組實(shí)驗(yàn)：40只8月齡雌性SD大鼠(340～350 g)，被安置在室溫(22±2)℃條件下，12 h光/暗周期,允許自由獲取食物和蒸餾水。1周后，在無(wú)菌條件下，用氯醛麻醉大鼠。對(duì)10只大鼠進(jìn)行雙側(cè)剖腹手術(shù)，但未摘除卵巢，為假手術(shù)組，其余30只均行雙側(cè)卵巢切除術(shù)并被隨機(jī)分為3組：OVX組(用生理鹽水灌胃)、R5低劑量組[喂食蘆丁劑量5 mg (kg·d)]、R10高劑量組[喂食蘆丁劑量10 mg (kg·d)]，每日灌胃一次，持續(xù)3個(gè)月。實(shí)驗(yàn)期間每周記錄大鼠子宮濕重及子宮指數(shù)。動(dòng)物研究的程序包括飼養(yǎng)、喂養(yǎng)和整個(gè)手術(shù)過(guò)程。遵循APS的“照顧和使用動(dòng)物的指導(dǎo)原則”，并得到了青島大學(xué)動(dòng)物研究委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)：在水合氯醛深度麻醉下，通過(guò)股動(dòng)脈放血處死大鼠。收集血液樣本在4 ℃、3 000 r/min,持續(xù)離心15 min。立即進(jìn)行血清分離,儲(chǔ)存在-20 ℃?zhèn)溆?。根?jù)試劑盒指示，ELISA 測(cè)定血清水平骨鈣素(OG)、雌激素(E2)、1,25(OH)2 D3和炎性細(xì)胞因子(IL- 6、TNF-α、INF-γ)。

1.2.2 骨組織形態(tài)分析：首先制備股骨切片，在戊巴比妥鈉腹腔麻醉下, 迅速取出股骨頭、股骨頸，立即投入10%中性甲醛中固定48 h, 4 ℃, 混合酸脫鈣液脫鈣7 d, 梯度乙醇脫水，用二甲苯進(jìn)行沖洗，最后制成石蠟切片后應(yīng)用鉆石刀切片。用10%中性甲醛緩沖液沖洗嵌在石蠟上的股骨切片，用金納的三色染色法染色。觀察切片的組織病理學(xué)變化，分析左側(cè)股骨的組織形態(tài)學(xué)，并對(duì)其進(jìn)行骨微觀結(jié)構(gòu)分析。染色借鑒既往研究進(jìn)行[25]，利用圖像分析軟件進(jìn)一步分析。

1.2.3 骨礦物質(zhì)密度：采用雙能X線骨密度儀中的小型實(shí)驗(yàn)動(dòng)物骨密度評(píng)估軟件對(duì)右側(cè)股骨的骨密度(bone mineral density, BMD)進(jìn)行測(cè)量，結(jié)果以g/cm2顯示。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

使用統(tǒng)計(jì)分析軟件SPSS 11.5版本處理本研究的數(shù)據(jù)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，通過(guò)方差分析來(lái)分析各群體間的統(tǒng)計(jì)比較。當(dāng)P<0.05時(shí)，用最小顯著性差異法進(jìn)行兩兩比較。

2 結(jié)果

2.1 體重

所有小組在研究期間，均沒(méi)有大鼠死亡。四組大鼠最初的平均體重是相同的。在3個(gè)月的實(shí)驗(yàn)期間，每周監(jiān)測(cè)大鼠體重，研究在行卵巢切除術(shù)后，喂食蘆丁是否改變了體重。與假手術(shù)組(sham)相比，切除卵巢大鼠的體重持續(xù)增高(P< 0.05)，見(jiàn)圖1;術(shù)后第4周，OVX組的體重明顯高于假手術(shù)組(P< 0.05);除了R10(高劑量蘆丁)組的大鼠體重稍微偏低點(diǎn)之外，R5(低劑量蘆丁)組的體重在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中沒(méi)有明顯增加。

圖1 治療期間大鼠體重增加情況Fig.1 Weight gain during treatment

2.2 子宮指數(shù)

子宮指數(shù)的變化趨勢(shì)與體重相似。與假手術(shù)組(sham)子宮組織相比較，OVX組明顯萎縮(P<0.05);與OVX組比較，蘆丁組的子宮重量顯著增加(P<0.05)，似乎與劑量有關(guān)(見(jiàn)表1)。

表1 各組干預(yù)期間子宮指數(shù)Table 1 Uterus index during intervention

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05;與OVX組比較，#P<0.05。

2.3 蘆丁對(duì)炎癥標(biāo)志物的影響

用ELISA法檢測(cè)不同治療組的血清細(xì)胞因子水平并進(jìn)行分析評(píng)價(jià)。如表2所示,與假手術(shù)組相比，OVX組的細(xì)胞因子IL - 6,IFN-γ、TNF-α明顯升高(P<0.05)。然而,蘆丁的干預(yù)逆轉(zhuǎn)了細(xì)胞因子IL- 6、,IFN-γ和TNF-α的水平，此過(guò)程似乎也呈劑量依賴性的方式。

表2 IL - 6,IFN-γ，TNF-α水平Table 2 IL-6, IFN-γ and TNF-α levels

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05;與OVX組比較，#P<0.05。

2.4 血清參數(shù)

不同組大鼠血清參數(shù)結(jié)果見(jiàn)表3。結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，OVX組大鼠血清E2和1,25(OH)2D3水平顯著降低，蘆丁干預(yù)后E2和1,25(OH)2D3水平顯著增加，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與假手術(shù)組相比，在OVX組大鼠中觀察到血清OCN。有趣的是，蘆丁治療以劑量依賴性的方式逆轉(zhuǎn)了OVX大鼠的血清OCN水平。

表3 血清E2、1,25(OH)2D3、OCN水平Table 3 Serum E2, 1,25(OH)2D3and OCN levels

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05;與OVX組比較，#P<0.05。

2.5 股骨的骨密度

與假手術(shù)組比較，OVX組右側(cè)股骨BMD明顯降低 (P<0.05)。蘆丁對(duì)OVX大鼠的干預(yù)顯著改善了股骨骨密度;與OVX組相比，經(jīng)過(guò)3個(gè)月的治療，高劑量的蘆丁增加了右側(cè)股骨的BMD (P<0.05)，似乎是呈劑量依賴性(表4)。

表4 股骨的骨密度檢測(cè)Table 4 Bone density of femur

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05;與OVX組比較，#P<0.05。

2.6 蘆丁減少骨小梁丟失

用蘇木精和伊紅染色對(duì)股骨骨結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。假手術(shù)組大鼠表現(xiàn)出正常的骨干(圖2 A);OVX組大鼠表現(xiàn)出均勻稀疏的骨小梁(圖2B);低劑量蘆丁組表現(xiàn)出明顯的改善(圖2C);采用高劑量蘆丁(R10)治療后，幾乎完全改善為正常骨和骨小梁(圖2D)，類似于假手術(shù)組。這些結(jié)果證實(shí)了蘆丁對(duì)卵巢切除引起的骨丟失起到了積極的作用。

圖2 不同組大鼠股骨的組織學(xué)(×200)Fig.2 Histology of the femur of different groups of rats (200 times magnification)

3 討論

骨質(zhì)疏松癥是一種骨代謝障礙疾病，其特點(diǎn)是成骨細(xì)胞的形成與破骨細(xì)胞的吸收不平衡，導(dǎo)致骨骼脆弱，容易骨折。卵巢激素缺乏癥是絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的主要危險(xiǎn)因素。卵巢切除術(shù)導(dǎo)致子宮重量、骨密度和生物力學(xué)強(qiáng)度顯著下降，而這些變化部分是由于雌激素缺乏導(dǎo)致。在老年婦女中[25]，茶的攝入量與高骨密度有關(guān)，這被認(rèn)為是由兒茶素引起的，它抵消了咖啡因?qū)趋来x的影響。許多研究表明[8-14]，一些蔬菜和水果如洋蔥、豆類和茶可以抑制骨吸收。它們是強(qiáng)的抗氧化劑[11]，可以通過(guò)抑制低密度脂蛋白的氧化來(lái)預(yù)防心血管疾病。洋蔥富含黃酮類化合物，抗氧化作用被認(rèn)為是蔬菜中最強(qiáng)的[15]。一些獨(dú)立的證據(jù)表明，含有多酚分子的特殊天然產(chǎn)物可能起到有益的作用。例如，在兒茶素[16]、蘆丁[17]、綠茶多酚[18]、橄欖油多酚[19]、蘋(píng)果多酚中發(fā)現(xiàn)了對(duì)骨質(zhì)減少或骨質(zhì)疏松癥起到改善作用的物質(zhì)。以類黃酮為代表的酚類化合物[20]，已被證實(shí)具有促進(jìn)健康和抗骨質(zhì)疏松活性的作用。

大鼠在食用富含洋蔥的飲食后表現(xiàn)出對(duì)骨吸收的抑制作用，作為槲皮素的糖基化形式，蘆丁被發(fā)現(xiàn)是洋蔥中主要的黃酮類化合物。洋蔥提取物已被證明可以抑制體外和體內(nèi)的骨吸收[26]。本研究旨在評(píng)價(jià)蘆丁對(duì)去卵巢誘發(fā)大鼠骨量減少的保護(hù)作用。數(shù)據(jù)顯示，與假手術(shù)組相比，OVX組減少了身體和子宮的重量。蘆丁的干預(yù)增加了卵巢切除大鼠的身體和子宮的重量。目前體重和骨質(zhì)疏松關(guān)系存在爭(zhēng)議，體重與骨質(zhì)疏松呈非線性關(guān)系，加拿大的研究認(rèn)為低體重可能為骨質(zhì)疏松及骨質(zhì)疏松性骨折的危險(xiǎn)因素。Gilsanz實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)皮下脂肪與骨量直接相關(guān)，而內(nèi)臟脂肪則與骨量無(wú)關(guān)。對(duì)于不同脂肪分布對(duì)骨密度產(chǎn)生不同作用的原因， 目前還無(wú)明確說(shuō)法。蘆丁組股骨的組織病理學(xué)檢查顯示骨化、礦化和鈣化沉積，所有這些都表明有明顯的修復(fù)作用，因此表明蘆丁起到的保護(hù)作用可能是由于骨形成增加和骨吸收減少。眾所周知，雌二醇(E2)、骨鈣素(OCN)、鈣和磷是骨形成標(biāo)志物[27]。先前的研究[17]表明，蘆丁的消耗在改善OVX大鼠骨礦物質(zhì)丟失方面比異黃酮更有效，尿排泄后骨吸收標(biāo)志物(脫氧吡啶啉)減少，成骨活性標(biāo)記物(骨鈣素)增加。在本研究中，結(jié)果顯示OVX大鼠血清E2和1,25(OH)2D3的水平與假手術(shù)組相比顯著降低，而蘆丁干預(yù)顯著增加了E2和1,25(OH)2D3的水平。有趣的是，蘆丁治療以劑量依賴的方式逆轉(zhuǎn)OVX大鼠上調(diào)的血清OCN水平。大量的證據(jù)表明，促炎細(xì)胞因子如白細(xì)胞介素-1(IL-1)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)通過(guò)增加骨吸收參與骨轉(zhuǎn)換的調(diào)節(jié)[28-29]。盛莉等[30]研究表明，未經(jīng)治療的絕經(jīng)后婦女的骨細(xì)胞中，白細(xì)胞介素1(IL-1)、腫瘤壞死因子(TNF)和IL-6 mRNA的表達(dá)比雌激素替代治療組更高。該途徑反過(guò)來(lái)會(huì)抑制成骨細(xì)胞募集和成熟細(xì)胞的活性[31]，并增加破骨細(xì)胞吸收。在本研究中，蘆丁干預(yù)以劑量依賴的方式逆轉(zhuǎn)OVX大鼠細(xì)胞因子IL-6、IFN-γ和TNF-α的上調(diào)。筆者的研究表明蘆丁對(duì)于預(yù)防卵巢切除術(shù)引起的骨質(zhì)流失有一定的有效性和效果。與假手術(shù)組相比，OVX組右側(cè)股骨BMD明顯降低，給予OVX組大鼠蘆丁后則顯著恢復(fù)了股骨的BMD，且呈劑量依賴性。陳麗思等[32]發(fā)現(xiàn)糞便和尿鈣排泄增加以及鈣吸收率降低可能有助于減少BMD。蘆丁可以以劑量依賴的方式抵消大鼠卵巢切除術(shù)后誘導(dǎo)的骨量減少。

本研究表明，蘆丁改善了因切除大鼠卵巢后引起的骨小梁微結(jié)構(gòu)消失，有助于預(yù)防骨量流失，是治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的一種潛在替代治療劑。