何偉 陳榮春 曾芳俊 曾文叢

贛州市人民醫(yī)院, 江西 贛州 341000

骨再生一直是骨科領域研究的熱點問題，有效的骨再生治療依然存在巨大臨床需求。隨著組織工程研究的逐漸深入，間充質干細胞在組織再生中的重要性得到了越來越多的關注。骨髓來源的間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)因其獲取方法方便而較為常用。 BMSC具有修復骨組織損傷的能力[1-2]。BMSCs的上清液同樣有修復受損組織的功能，其作用可能與干細胞通過旁分泌囊泡調節(jié)靶細胞功能有關[3-4]。外泌體(Exosome)作為干細胞旁分泌成分之一，在干細胞調節(jié)靶細胞功能中起到了十分重要的作用。外泌體一般直徑為40～160 nm，其內包含來源細胞內合成的mRNA、miRNA、酶等成分[5-8]，通過出芽的方式進入細胞外基質，被靶細胞內吞后釋放內部成分，完成細胞間的通訊和信息交流[9-11]。外泌體可以有效修復受損的組織、器官[12-15](如心、肺、腎、腦等)，說明移植外泌體可以發(fā)揮移植干細胞類似的作用。因此假設骨髓間充質干細胞來源的外泌體(BMSC-Exos)能表現出與BMSC相似的生物學功能，即促進骨再生。本研究將驗證BMSC-Exos對骨再生的作用，初步探索其骨再生的機制，希望能為將來外泌體治療骨再生提供理論依據，同時為臨床探索骨再生問題提供新的線索和思路。

1 材料與方法

1.1 材料

人骨髓間充質干細胞取自外傷病人的股骨骨髓(經知情同意后)，大鼠成骨細胞取自乳鼠(SD大鼠)顱骨。DMEM/F-12培養(yǎng)基、IMDM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司，FBS購自美國hyclone公司，外泌體分離試劑盒購自美國Invitrogen公司，用于流式細胞檢測的單克隆抗體購自美國Pharmingen公司，成骨誘導培養(yǎng)基和成脂誘導培養(yǎng)基的各組分購自美國Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 BMSC培養(yǎng)：采集骨髓血置于15 mL離心管中，加入等量PBS，1 500 r/min 離心20 min，棄去脂肪層，重復兩次。取Ficoll分離液5 mL(1.077 g/mL)加入新的離心管中，將上述稀釋后的骨髓液緩慢沿著管壁加至Ficoll分離液上層。室溫下2 500 r/min離心20 min。吸取離心管中白色細胞層至另一離心管中，此層細胞包含了BMSC、造血干細胞等，加適量PBS重懸并沖洗，1 500 r/min離心15 min，重復兩次。用DMEM/F-12完全培養(yǎng)基重懸細胞沉淀，接種至T25培養(yǎng)瓶中，CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)72 h后第一次換液，此時BMSC已貼壁生長，后每3天換液一次。原代細胞培養(yǎng)14 d左右可傳代，傳代細胞培養(yǎng)6 d左右可再次傳代。

1.2.2 BMSC表面抗原和多系分化能力鑒定：①取P4～P6代BMSC細胞，通過流式細胞儀檢測BMSC表達CD29、CD44、CD90、CD34、CD45的情況; ②進行成脂誘導培養(yǎng)。在6孔板中接種BMSC，加入脂肪分化誘導培養(yǎng)基，每3天更換培養(yǎng)液，誘導3周后進行油紅O染色鑒定; ③進行成骨誘導培養(yǎng)。在6孔板中接種BMSC，加入成骨分化誘導培養(yǎng)基，每3天更換培養(yǎng)液，誘導3周后進行茜素紅染色鑒定。

1.2.3 BMSC-Exos提取與鑒定:通過invitrogen試劑盒提取BMSC-Exos。BMSCs培養(yǎng)至P4～P6代，每次為細胞換液時注意收集培養(yǎng)上清，暫時保存在4 ℃中。吸取培養(yǎng)上清至高速離心管中，在4 ℃以2 000g離心30 min，以去除雜質。轉移上清液至新的離心管中，按照上清液：試劑=2∶1的比例加入試劑，在渦旋振蕩器上充分混勻后在4 ℃冰箱孵育12 h。取出離心管，在4 ℃以10 000g離心60 min，棄去上清液，小心用PBS重懸離心沉淀即為BMSC-Exos懸液，將其置于-20 ℃保存。通過透射電鏡(TEM)和免疫電泳(Western Blot)觀察BMSC-Exos的形態(tài)和抗原表達。

1.2.4 體外驗證BMSC-Exos骨分化能力:參照文獻方法[16]培養(yǎng)原代成骨細胞。無菌條件下取出出生24 h內乳鼠(SD大鼠)的顱蓋骨，放入盛有PBS溶液(內含1%雙抗)的培養(yǎng)皿中，并刮去表面結締組織(如骨膜、血管)。剪碎骨片成1 mm大小，用2.5 g/L的胰蛋白酶37 ℃消化20 min，PBS沖洗后棄去上清。再用1.0 g/L的II型膠原酶消化2次，每次1 h。吸取上清液加入至DMEM培養(yǎng)基(內含10% FBS，1%雙抗)中，置于二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每3天換液一次。收集P4～P5代成骨細胞，接種至6孔板上，加入DMEM培養(yǎng)基。每3天換液一次，每次換液除了加入2 mL DMEM外，按照如下分組加入BMSC-Exos懸液：①Exo懸液(50 μL)；②Exo懸液(20 μL)+PBS(30 μL)；③PBS(50 μL)。以上3組細胞培養(yǎng)12 d后，一部分細胞行茜素紅和堿性磷酸酶(ALP)染色，一部分細胞行分子生物學檢測。

1.2.5 BMSC-Exos對骨再生機制的探索:取上述經過BMSC-Exos處理12 d后的3組成骨細胞。一部分用于提取蛋白，行Western Blot檢測。用RIPA細胞裂解液裂解細胞，獲得細胞內總蛋白，通過免疫電泳檢測成骨細胞中OCN、Runx2、β-catenin蛋白含量，并比較組間差異。另一部分細胞用于提取RNA，行qRT-PCR檢測。用RNA提取試劑盒提取細胞內的總RNA，通過qRT-PCR定量檢測Runx2基因表達量，并比較組間差異。

圖2 BMSC分別經成骨誘導培養(yǎng)和成脂誘導培養(yǎng)后，茜素紅染色(左)和油紅O染色(右)均呈陽性(×100倍)Fig.2 BMSCs were positive for alizarin red staining (left) and oil red O staining (right) after osteogenic induction and adipogenic induction culture, respectively (×100 times)

1.2.6 體外驗證BMSC-Exos 促進細胞增殖能力：取P4～P5代成骨細胞接種于96孔板上，通過CCK-8細胞增殖實驗檢測BMSC-Exos對成骨細胞增殖能力的影響。按照每天加入培養(yǎng)基的不同分為以下3組：①Exo懸液50 μL + DMEM培養(yǎng)基50 μL；②Exo懸液20 μL + DMEM培養(yǎng)基80 μL；③Exo懸液0 μL+ DMEM培養(yǎng)基100 μL。每組設置5個復孔，每孔加入10 μL CCK-8檢測液后37 ℃孵育2.5 h，放于酶標儀上測450 nm處的吸光度(OD 450)。連續(xù)測定一周，繪制成骨細胞生長曲線。

1.2.7 體內驗證BMSC-Exos修復大鼠顱骨缺損能力:取3月齡SD大鼠16只，實驗組與對照組各8只。4%水合氯醛腹腔麻醉，麻醉后備皮、消毒、無菌手術，在大鼠頭部正中做2.5 cm切口，逐層分離至顱骨正中線，分離骨膜。用磨鉆于雙側頂骨各做直徑5 mm的全層顱骨缺損，注意不可鉆過深以避免傷及顱內組織。實驗組在顱骨缺損處注射100 μBMSC-Exos懸液，對照組顱骨缺損處注射100 μL PBS緩沖液。術畢縫合，肌肉注射青霉素預防感染，放置在動物房中統(tǒng)一飼養(yǎng)。術后8周，將大鼠過量麻醉致死，取出顱蓋骨，清理表面軟組織后，一部分標本行micro-CT檢測，一部分標本脫鈣后制作石蠟切片觀察。動物實驗通過了贛州市人民醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準。

1.3 統(tǒng)計學方法

所有實驗數據通過3次以上獨立實驗得出，以均值±標準差形式表示，組間差異比較通過方差分析和t檢驗完成，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 BMSC培養(yǎng)與鑒定

原代提取的BMSC在鏡下呈長梭形或多角形，貼壁生長，細胞核大，形態(tài)均一。表面抗原高表達CD 29、CD 44、CD 90(×400倍)這些間充質干細胞標志物，低表達CD 34、CD 45等造血細胞標志物，BMSC細胞形態(tài)見圖1。CD 29、CD 44、CD 90的BMSC百分比(%)分別為：97±0.43，98±0.22，98±0.78，未見CD 34、CD 45表達。經過成骨誘導培養(yǎng)和成脂誘導培養(yǎng)后，茜素紅染色和油紅O染色均為陽性(×100倍)，見圖2。以上結果表明分離培養(yǎng)所得的BMSC符合間充質干細胞特征。

圖1 BMSC細胞形態(tài)及表面抗原表達情況Fig.1 BMSC cell morphology and surface antigen expression

2.2 BMSC-Exos鑒定

TEM下觀察外泌體呈兩面凹的橢圓形或圓形，直徑40～120 nm(81.7±19.9)，有完整的磷脂雙分子層膜結構。Western Blot顯示BMSC-Exos表達源細胞表面蛋白CD 69、CD 81(×100)。

圖3 TEM下BMSC-Exos形態(tài)Fig.3 The morphology of BMSC-Exos in TEM

2.3 BMSC-Exos體外促成骨、促細胞增殖

成骨細胞培養(yǎng)12 d后，茜素紅染色和堿性磷酸酶(ALP)染色結果呈陽性。茜素紅染色強度與成骨細胞內鈣鹽沉積量呈正相關，ALP染色強度與成骨細胞內ALP活性呈正相關。染色強度從強到弱依次為：Exos(50 μL)組，Exos(20 μL)組，PBS對照組。表明BMSC-Exos的存在可以促進成骨細胞礦化過程(×100倍)。

圖4 茜素紅和ALP染色結果Fig.4 Alizarin red and ALP staining results

通過CCK-8細胞增殖實驗，驗證BMSC-Exos對成骨細胞的增殖影響，結果可以看出加入BMSC-Exos后成骨細胞增殖速度明顯提高，且提高程度與加入BMSC-Exos的量呈正相關。結果提示BMSC-Exos對成骨細胞增殖有促進作用。

2.4 BMSC-Exos體內促進骨再生

對術后8周的標本行Micro-CT檢測，結果如6圖所示。加入BMSC-Exos的實驗組(右)與空白對照組(左)相比，新生骨量更多，骨缺損修復程度更好。

圖5 CCK-8細胞增殖實驗驗證BMSC-Exos對成骨細胞增殖的影響Fig.5 CCK-8 cell proliferation assay verified the effect of BMSC-Exos on osteoblast proliferation

圖6 Micro-CT檢測結果Fig.6 Micro-CT test results

對術后8周的顱骨標本脫鈣后制作石蠟切片并行HE染色，結果顯示，加入BMSC-Exos的實驗組(下)與對照組(上)相比，新生骨明顯增多(左×100倍，右×400倍)，骨缺損處成骨細胞、骨細胞更多，形成的編織骨組織更多、連接成片，有髓樣組織，骨小梁樣結構更多。見圖7。

圖7 石蠟切片HE染色結果Fig.7 HE staining results of paraffin sections

2.5 BMSC-Exos促進骨再生機制

通過Western Blot檢測成骨細胞中成骨相關蛋白OCN、Runx2的表達，結果顯示加入BMSC-Exos后，成骨細胞中OCN、Runx2蛋白表達含量明顯上升，且隨著BMSC-Exos量的增加而增加。同時，檢測了成骨過程重要調控通路Wnt/β-catenin通路中的關鍵蛋白β-catenin，結果顯示β-catenin蛋白含量也隨BMSC-Exos量的增加而增加。表明BMSC-Exos促進骨再生過程可能與激活Wnt/β-catenin調控通路有關。

圖8 Western Blot結果Fig.8 Western Blot results

通過qRT-PCR方法對Runx2基因表達量定量分析如圖9所示，結果顯示BMSC-Exos上調了Runx2基因的表達，進一步說明BMSC-Exos促進成骨的能力與上調成骨相關基因的表達有關。

圖9 qRT-PCR結果Fig.9 qRT-PCR results

3 討論

間充質干細胞是一種能向多種細胞系分化同時自我更新能力強的干細胞，能在特定的條件下向多種組織細胞分化(如骨、軟骨、脂肪、神經等)，可在全身多種組織(如骨髓、臍帶等)中分離而得，而骨髓來源的間充質干細胞因其獲取方法方便而較為常用。大量研究者[1,17]將間充質干細胞用于組織修復，無論應用于動物模型還是臨床治療都取得了很好的效果。然而，干細胞移植仍然無法避免移植效率低、致畸風險、倫理風險等諸多問題。

干細胞發(fā)揮組織修復作用與旁分泌機制密切相關，外泌體(Exosomes)作為干細胞旁分泌成分中的重要組成部分，其內含物包括核酸、蛋白質、酶等，通過內吞的方式進入靶細胞內發(fā)揮作用，可以代替干細胞發(fā)揮組織修復能力，如修復心、肺、腎、腦等[12-15]組織器官的損傷。同時由于外泌體的低免疫原性、無細胞活性等特點，也降低了干細胞移植的風險。

在細胞培養(yǎng)過程中，外泌體主要存在于細胞培養(yǎng)的上清液中。目前常用來富集濃縮外泌體的方法主要有超速離心法和試劑盒法，根據試劑盒廠家不同具體方法也不同。有研究[18]比較了兩種方法的差異，但業(yè)內對于兩種方法的優(yōu)缺點尚無統(tǒng)一意見。本研究采用的是試劑盒法提純BMSC-Exos，通過透射電鏡觀察可見BMSC-Exos呈兩面凹的圓形或橢圓形，直徑約40～120 nm(81.7±19.9)，表面抗原符合來源細胞表達特征，這與前人研究結果相類似。

BMSCs在骨再生過程中發(fā)揮至關重要的作用，移植BMSCs可以促進骨缺損部位的骨修復。那么移植BMSC-Exos是否可以達到與移植BMSC相類似的效果呢？本研究通過體內體外實驗予以了驗證。首先，將BMSC-Exos加入成骨細胞培養(yǎng)基中，發(fā)現隨著BMSC-Exos量的增多，成骨細胞的茜素紅和ALP染色強度增加，表明成骨細胞內鈣鹽沉積和酶活性提高，因此BMSC-Exos有促進成骨作用。然后，將BMSC-Exos用于大鼠顱骨缺損模型，micro-CT和組織切片顯示，實驗組與對照組相比新生骨量增多，BMSC-Exos在體內也有促進骨再生作用。最后對加入BMSC-Exos后的成骨細胞進行了分子生物學分析，分析表明與成骨過程相關的蛋白OCN、Runx2均有明顯升高，成骨相關基因Runx2表達上調。成骨過程受到復雜的信號通路的調節(jié)，Wnt/β-catenin通路是其中一條重要的調節(jié)通路，β-catenin是這條通路中的關鍵蛋白。本研究測定了成骨細胞中β-catenin的含量，免疫電泳顯示BMSC-Exos處理后β-catenin含量升高并與BMSC-Exos濃度呈正相關，提示BMSC-Exos可能通過激活了Wnt/β-catenin通路而促進成骨。具體的分子機制本研究尚未詳細討論，因此需要后續(xù)研究進一步驗證。

本研究通過體內體外實驗證明了移植BMSC-Exos同樣可以發(fā)揮促進骨再生、修復骨缺損的作用。這也進一步驗證了移植干細胞外泌體可以達到與移植干細胞類似的效果。外泌體具有低免疫原性、低細胞活性等特點，相比移植干細胞更安全，同時也避免了倫理等問題?；谕饷隗w的治療方法對于受損組織、器官的修復具有巨大潛能，希望本研究的結果能夠為外泌體的應用提供理論依據。