陳賽楠 吳華嵩 程佑民 葉云金 李生強(qiáng) 謝麗華 陳娟 葛繼榮

福建省中醫(yī)藥研究院骨質(zhì)疏松證候基因組學(xué)重點(diǎn)研究室，福建 福州 350003

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(postmenopausal osteoporosis,PMOP)屬Ⅰ型高轉(zhuǎn)換型原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥，是由于絕經(jīng)后卵巢功能衰退、雌激素水平降低引起的骨吸收亢進(jìn)，進(jìn)而骨重建失衡導(dǎo)致骨量降低、骨微結(jié)構(gòu)破壞、骨折風(fēng)險(xiǎn)性增加的全身性骨骼疾病[1]。隨著人口老齡化程度加劇，其發(fā)病率逐年上升，骨折致畸、致殘是最常見(jiàn)且最嚴(yán)重的并發(fā)癥，嚴(yán)重影響老年人的生活質(zhì)量[2]。骨質(zhì)疏松癥病因多與性別、營(yíng)養(yǎng)、內(nèi)分泌、遺傳等因素密切相關(guān)[3]，其發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，鈣代謝紊亂是重要的病理機(jī)制之一[4]，因此糾正機(jī)體負(fù)鈣代謝是防治PMOP的有效措施之一。

中醫(yī)理論認(rèn)為骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生與腎、脾關(guān)系密切，腎主骨生髓，腎精虧虛不足以充養(yǎng)骨髓，“腎為先天之本”“脾為后天之本”，腎脾相互影響，互為因果。腎虛可致脾虛，脾失運(yùn)化，脾氣不足，則骨髓空虛、骨骼失養(yǎng)而成骨痿。續(xù)苓健骨方是葛繼榮教授長(zhǎng)期致力于骨質(zhì)疏松癥中藥新藥臨床試驗(yàn)并結(jié)合臨床實(shí)踐，依據(jù)補(bǔ)腎壯骨、益氣健脾、活血祛瘀而提出的指導(dǎo)用藥，是治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥腎虛血瘀證的中藥驗(yàn)方，辨證論治、整體調(diào)控，可有效提高患者骨密度、緩解臨床癥狀。為進(jìn)一步探討其治療機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)采用雙側(cè)卵巢切除術(shù)建立大鼠骨質(zhì)疏松模型，觀察續(xù)苓健骨方對(duì)大鼠脛骨骨密度、脛骨組織顯微結(jié)構(gòu)、骨代謝指標(biāo)TRAP、血鈣和血磷含量的影響，探討續(xù)苓健骨方防治絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的潛在作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SPF級(jí)3月齡未孕雌性SD大鼠40只，體重(240±10)g，購(gòu)自上海禹堃實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號(hào)：SCXK(滬)2016-0003。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)于福建省中醫(yī)藥研究院比較醫(yī)學(xué)中心，合格證號(hào)：醫(yī)動(dòng)學(xué)第23-016號(hào)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥物：續(xù)苓健骨方由骨碎補(bǔ)、茯苓、白術(shù)、陳皮、赤芍和甘草等12味中藥組成，每劑總重量122 g，購(gòu)自福建鷺燕中宏醫(yī)藥有限公司；碳酸鈣D3片(Ⅱ)，規(guī)格：鈣500 mg、維生素D3200 IU，北京康遠(yuǎn)制藥有限公司，批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字H20093675，批號(hào)：20170328。

1.1.3 主要試劑與儀器：戊巴比妥鈉(Sigma-Aldrich)、多聚甲醛(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)、乙二胺四乙酸二鈉(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)、無(wú)水乙醇(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)、抗酒石酸酸性磷酸酶檢測(cè)試劑盒(碧云天生物技術(shù))、鈣測(cè)試盒(南京建成生物工程研究所)、磷測(cè)試盒(南京建成生物工程研究所)、酶標(biāo)儀(BIO-TEK,LX-800)、雙能X線骨密度儀(HOLOGIC,Discovery WS/N 89006)、組織脫水機(jī)(亞光,ZT-14V2)、石蠟包埋機(jī)(亞光,YB-7LF)、石蠟切片機(jī)(Leica,RM2255)、玻片數(shù)字掃描儀(3D HISTECH,Pannoramic 250,Pannoramic MIDI)。

1.2 方法

1.2.1 模型制備：SD大鼠飼養(yǎng)至6月齡，隨機(jī)分為假手術(shù)組、骨質(zhì)疏松模型組、續(xù)苓健骨方組、碳酸鈣組，每組10只。除假手術(shù)組外，其余組行雙側(cè)卵巢切除術(shù)制備模型[5]。術(shù)前一天禁食不禁水，稱重，2%戊巴比妥鈉按0.2 mL/100 g劑量行腹腔注射麻醉，仰臥位固定，備皮，于腹部正中線作一長(zhǎng)約1.5 cm的切口。沿腹白線打開(kāi)腹腔，沿Y型子宮尋找雙側(cè)粉紅色桑葚狀卵巢，結(jié)扎，徹底摘除卵巢，逐層縫合，術(shù)后肌注青霉素8萬(wàn)單位，連續(xù)3 d。假手術(shù)組采用相同手術(shù)方法，切除卵巢附近相等量脂肪組織。

1.2.2 藥物干預(yù)：于術(shù)后4周進(jìn)行藥物干預(yù)，大鼠灌胃劑量根據(jù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體表面積換算，續(xù)苓健骨方組灌胃劑量為12.71 g/(kg·d)，碳酸鈣組灌胃劑量為104.19 mg/(kg·d)，假手術(shù)組、模型組給予等量生理鹽水灌胃，每日1次，連續(xù)灌胃12周，于灌胃結(jié)束后取材。

1.2.3 血清生化：行腹主動(dòng)脈采血，全血靜置2 h，3 000 r/min、離心10 min。吸取血清，嚴(yán)格按照抗酒石酸酸性磷酸酶、鈣、磷測(cè)試盒說(shuō)明書操作，酶標(biāo)儀測(cè)定樣本吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算血清抗酒石酸酸性磷酸酶、鈣、磷含量。

1.2.4 骨密度測(cè)量：取左側(cè)脛骨，盡量去除肌肉、周圍軟組織，用生理鹽水沾濕紗布包裹保存，固定位置。雙能X線骨密度儀采用小動(dòng)物掃描模式，自選工具選定ROI區(qū)域，讀取樣本骨密度，打印測(cè)量結(jié)果。

1.2.5 病理學(xué)觀察：取右側(cè)脛骨置4%多聚甲醛中常溫固定48 h，10% EDTA(pH 7.2～7.4)脫鈣，每3日更換一次，常溫脫鈣6周至刀切無(wú)阻力感。水洗，梯度乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋，脛骨冠狀面為切面，4 μm厚連續(xù)切片，60 ℃拷片2 h，切片脫蠟至水，Bouin’s固定液固定1 h，水洗至無(wú)色，麗春紅染液染色10 min，水洗，磷鉬酸分色鏡下控制，固綠染液染色3 min，水洗，中性樹脂封片，玻片明場(chǎng)全視野掃描，觀察骨組織顯微結(jié)構(gòu)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

圖1 脛骨近端冠狀面(Masson染色，×0.7、×100)(黑色箭頭：骨骺線)Fig.1 The coronal plane of proximal tibia (Masson staining, ×0.7, ×100)

2 結(jié)果

2.1 骨密度

與假手術(shù)組相比，模型組脛骨骨密度顯著降低(P<0.01)，提示絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥模型復(fù)制成功；與模型組相比，續(xù)苓健骨方組骨密度提高(P<0.05)，碳酸鈣組骨密度略有提高，但差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；結(jié)果顯示續(xù)苓健骨方的藥效作用，見(jiàn)表1。

2.2 病理學(xué)觀察

脛骨Masson染色可見(jiàn)假手術(shù)組骨骺線(黑色箭頭)下骨小梁量多、緊密，排列規(guī)則、分布均勻，骨小梁間距小，相互連接成網(wǎng)狀，骨髓腔未見(jiàn)明顯脂滴聚集(圖1 A)。模型組可見(jiàn)骨小梁稀疏，排列不規(guī)則、分布不均勻，骨小梁間距顯著增加，可見(jiàn)骨小梁斷點(diǎn)，骨小梁丟失部位以髓腔正中最為顯著、依次向腓骨側(cè)擴(kuò)散，骨髓腔內(nèi)可見(jiàn)脂滴顯著增加(圖1B)。與模型組相比，續(xù)苓健骨方組骨小梁數(shù)量增加，分布較均勻，骨小梁間距縮小，髓腔內(nèi)脂滴數(shù)量較少(圖1C)；碳酸鈣組骨小梁疏松程度介于模型組和續(xù)苓健骨方組之間，骨組織結(jié)構(gòu)達(dá)到一定程度的改善(圖1D)。

組別BMD假手術(shù)組0.4168±0.0212**模型組0.3321±0.0101##續(xù)苓健骨方組0.3671±0.0135*碳酸鈣組0.3494±0.0149##統(tǒng)計(jì)值0.000

注：與假手術(shù)組相比，#P<0.05;與假手術(shù)組相比，##P<0.01；與模型組相比，*P<0.05;與模型組相比，**P<0.01。

于骨骺線下中央部位鏡下(×50)計(jì)算骨小梁面積，與假手術(shù)組相比，模型組骨小梁面積顯著降低(P<0.01)；與假手術(shù)組相比，續(xù)苓健骨方組(P<0.01)、碳酸鈣組(P<0.05)骨小梁面積上升，見(jiàn)表2。

表2 大鼠脛骨骨小梁面積Table 2 Results of tibia trabecular area in the rats

注：與假手術(shù)組相比，#P<0.05;與假手術(shù)組相比，##P<0.01；與模型組相比，*P<0.05;與模型組相比，**P<0.01。

2.3 血清生化

與假手術(shù)組相比，模型組TRAP活性顯著升高(P<0.01)；與模型組相比，續(xù)苓健骨方組TRAP活性降低(P<0.05)，碳酸鈣組TRAP活性稍降低，但差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果顯示續(xù)苓健骨方可降低破骨細(xì)胞活性，降低骨吸收量。與假手術(shù)組相比，模型組血鈣降低(P<0.05)、血磷升高(P<0.05)；與模型組相比，續(xù)苓健骨方組血鈣升高(P<0.05)、血磷降低(P<0.05)，碳酸鈣組血鈣稍升高、血磷稍降低，但差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果顯示續(xù)苓健骨方在一定程度上恢復(fù)了鈣磷代謝穩(wěn)態(tài)。見(jiàn)表3。

組別TRAP血鈣血磷假手術(shù)組 24.8685±3.6685**2.5728±0.3534*2.5945±0.2061*模型組 34.8856±7.5827##2.278±0.0786#2.9519±0.2183#續(xù)苓健骨方組28.8877±4.5355#*2.4163±0.2263*2.6125±0.3278*碳酸鈣組 31.6902±5.1974#2.361±0.11482.7156±0.4323統(tǒng)計(jì)值 0.0070.0210.066

注：與假手術(shù)組相比，#P<0.05;與假手術(shù)組相比，##P<0.01；與模型組相比，*P<0.05;與模型組相比，**P<0.01。

3 討論

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis,OP)中以絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥多見(jiàn)，鈣磷代謝紊亂是重要病理機(jī)制之一。鈣是人體的必需元素，99%的鈣以羥磷灰石結(jié)晶的方式儲(chǔ)存于骨組織中，1%的鈣分布于體液和軟組織中，兩者處于動(dòng)態(tài)平衡；游離鈣是重要的第二信使，參與凝血、肌肉收縮等重要生理過(guò)程[6-7]。磷也是人體的必需元素，86%的磷以磷酸鈣形式存儲(chǔ)于骨組織中，14%的磷分布于細(xì)胞中，是核酸、三磷酸腺苷和骨骼等組織的重要組成部分，參與并維持機(jī)體正常生理功能。磷需協(xié)同鈣和維生素D共同維持其正常的生理功能[8]。機(jī)體內(nèi)存在精細(xì)的鈣磷平衡調(diào)節(jié)機(jī)制，腸、腎、骨是調(diào)控鈣磷代謝的主要靶器官[9]，1,25(OH)2D3[10]、甲狀旁腺素(PTH)[11]、降鈣素(CT)[9]是調(diào)控鈣磷代謝的主要激素，協(xié)同調(diào)控血鈣磷吸收、尿鈣磷重吸收與排泄、骨鈣磷沉積與釋放，共同維持機(jī)體內(nèi)的鈣磷代謝平衡。

雌激素是重要的骨代謝調(diào)控激素，對(duì)鈣磷代謝起著重要的調(diào)控作用[12]。雌激素對(duì)骨組織的主要作用是抑制骨吸收，作用一為促進(jìn)1,25(OH)2D3合成，增加腸鈣吸收，有利于骨鈣沉積；作用二是降低機(jī)體對(duì)PTH的敏感性，降低升鈣降磷作用，抑制骨吸收；作用三是促進(jìn)CT分泌，抑制破骨細(xì)胞活動(dòng)，降低骨鈣釋放入血。絕經(jīng)后雌激素水平急速降低，1,25(OH)2D3合成降低，PTH敏感性升高，CT抑制破骨細(xì)胞作用減弱，引起的腸鈣吸收減少，尿鈣重吸收率降低、排泄增加，骨吸收和骨形成失衡，骨重建呈高轉(zhuǎn)化，骨吸收、骨形成均增強(qiáng)，但骨吸收作用強(qiáng)于骨形成作用。正常人血清鈣磷乘積是35～40，鈣磷比值影響骨代謝[13]；血清鈣與血清磷呈負(fù)相關(guān)，血清鈣降低則血清磷升高，血清鈣升高則血清磷降低；低鈣高磷引起PTH分泌增加，導(dǎo)致骨吸收作用加強(qiáng)、骨重建紊亂，從而影響骨密度[14]。

中醫(yī)將骨質(zhì)疏松癥歸“骨痿”“骨枯”范疇，病變?cè)诠?，病位在腎，與肝脾胃緊密相關(guān)。腎精虧虛、脾胃虛弱、氣滯血瘀為主要病機(jī)，采用補(bǔ)腎填精、健脾和胃、活血散瘀的治則，選用續(xù)苓健骨方為臨床治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥腎虛血瘀證驗(yàn)方，以續(xù)斷、骨碎補(bǔ)為君藥，補(bǔ)肝腎強(qiáng)筋骨;白術(shù)、茯苓、陳皮為臣藥，益氣健脾;配赤芍清熱涼血、女貞子等為佐藥，滋陰補(bǔ)腎;甘草為使藥，調(diào)和藥性。共奏補(bǔ)腎壯骨、益氣健脾、活血通絡(luò)止痛之功效。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，模型組骨小梁數(shù)量顯著下降，血鈣降低而血磷升高，鈣磷代謝紊亂，呈負(fù)鈣平衡狀態(tài)；經(jīng)續(xù)苓健骨方干預(yù)12周后，血鈣升高而血磷降低，經(jīng)雙能X線骨密度儀測(cè)量顯示骨密度升高，且經(jīng)Masson染色顯示骨小梁數(shù)量和分離度具有了改變。結(jié)果表明本方在一定程度上糾正了負(fù)鈣平衡，恢復(fù)了鈣磷穩(wěn)態(tài)，下調(diào)了骨重建速率以改善去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松狀況。藥理研究表明，章軼立等[16]篩選出骨碎補(bǔ)治療OP的4個(gè)關(guān)鍵作用靶標(biāo)：甲狀旁腺素1受體(PTH1R)、甲狀旁腺素2受體(PTH2R)、降鈣素受體基因(CALCR)、SPTBN1基因(SPTBN1)[15]；白術(shù)提取物(AMK)可通過(guò)調(diào)節(jié)小腸上皮細(xì)胞(IEC-6)發(fā)揮黏膜保護(hù)和修復(fù)作用；茯苓多糖對(duì)腸道黏膜免疫系統(tǒng)具調(diào)節(jié)作用[17]；女貞子粗提物可促進(jìn)維生素D受體和鈣結(jié)合蛋白表達(dá)，促進(jìn)腸鈣吸收，抑制尿鈣排泄[18]。單純碳酸鈣D3片(Ⅱ)的治療對(duì)骨量影響較為有限，不能預(yù)防50歲以上人群骨折的發(fā)生[19]。補(bǔ)鈣屬于骨質(zhì)疏松癥的基礎(chǔ)治療，應(yīng)根據(jù)骨質(zhì)疏松癥的類型，選用雙膦酸鹽類[20]、選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑[21]、PTH[22]等藥物共同進(jìn)行治療。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果初步顯示了續(xù)苓健骨方能夠通過(guò)調(diào)控鈣磷代謝從而提高去卵巢大鼠骨密度并改善骨組織微結(jié)構(gòu)，但如何調(diào)控鈣磷代謝，是否通過(guò)促進(jìn)腸鈣吸收、降低尿鈣排泄、促進(jìn)骨鈣沉積等問(wèn)題，還需后續(xù)進(jìn)一步深入研究來(lái)探討其調(diào)控機(jī)制，為續(xù)苓健骨方的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。